JP2007259870A - Ｄｎａワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミド - Google Patents

Ｄｎａワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミド Download PDF

Info

Publication number
JP2007259870A
JP2007259870A JP2007186200A JP2007186200A JP2007259870A JP 2007259870 A JP2007259870 A JP 2007259870A JP 2007186200 A JP2007186200 A JP 2007186200A JP 2007186200 A JP2007186200 A JP 2007186200A JP 2007259870 A JP2007259870 A JP 2007259870A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hiv
vaccine
envelope protein
env
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2007186200A
Other languages
English (en)
Inventor
Julia Hurwitz
ジュリア ハーヴィッツ
Christopher Coleclough
クリストファー コールクロー
Randall Owens
ランダル オーウェンス
Karen Slobod
カレン スロボド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
St Jude Childrens Research Hospital
Original Assignee
St Jude Childrens Research Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Jude Childrens Research Hospital filed Critical St Jude Childrens Research Hospital
Publication of JP2007259870A publication Critical patent/JP2007259870A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Abstract

【課題】ＤＮＡワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミドを提供する。
【解決手段】二機能性プラスミドは、動物発現調節配列及びウイルス発現調節配列の制御下に異種遺伝子及び／又は異種遺伝子の挿入部位を含む。
【選択図】なし

Description

HIVのP0LYENV ワクチンとしての組換えワクシニアベクターの混合物 この研究はNCI 助成金R01-CA57419-03及び癌センター・サポート・コアー組成金P30-CA21765、NIH-NIAID 助成金AI-32529及びP01-AI31596-04により一部支持された。それ故、米国政府は本発明に或る種の権利を有する。
発明の分野
本発明は夫々がHIV エンベロープタンパク質の異なる変異体を発現する少なくとも4-40かつ10,000までの組換えワクシニアウイルスの混合物を含むヒト免疫不全ウイルス(HIV) のpolyenv ワクチンに関する。これらのワクチンは、HIV 感染に対する予期しない程増進された細胞性免疫応答及び／または体液性免疫応答を与えるために、ヒトを含む哺乳類のワクチン注射に適している。更に、本発明はこのような組換えワクシニアウイルス及びpolyenv ワクチンの生産方法及び使用方法に関する。
発明の背景
エイズウイルスはおそらく2,000 年までに1000万の生命を要求し、世界中の最優先の健康上の関心を構成する［DeVitaら，AIDS，Etiology，Dagnosis，Treat-ment and Prevention,第３編，J.B.Lippincott Co.,Philadelphia,PA(1992);Wong-Staal,Virology,1529-1543頁; 及びHirschら，Virology,1545-1570頁を参照のこと］。有効なHIV ワクチンの設計は免疫学者に特別な挑戦をもたらす。何となれば、HIV の複製に関与する逆転写酵素は高いエラー率を有するからである。これは変異体タンパク質配列を有する外殻タンパク質またはエンベロープタンパク質を有する多くの変異体HIV 株をもたらす。これらの変異体エンベロープタンパク質はしばしば咄乳類免疫系により異なる抗原として認識され、これが外来抗原に対抗する唯一の目的のために毎日109 より多い新しいリンパ球を生産する。Ｂ細胞及びＴ細胞が免疫応答の体液性成分及び細胞性成分を夫々構成する。
このような免疫応答の定性的な強さの良い例がHIV 感染患者及びSIV 感染マカクに示される。夫々の場合、変異体HIV またはSIV の感染、免疫、及び樹立の連続ラウンドが起こる［Wrinら，J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr．7: 211-219(1994);Burns及びDesrosiers,Cur.TopicsMicrobiol.Immunol．188:185-219(1994)］。
夫々のサイクルにより、HIV 抗原決定基（及び相当する免疫応答）の多様性が増大され、 その結果、これらの免疫応答が広範囲のSIV 変異体又はHIV 変異体を中和し、重感染が大部分抑制される。
しかしながら、エイズ患者はHIV ウイルス感染を患者の免疫系を克服することから阻止するのに不十分になる悪化した免疫応答を発生する。これは、一部、エンベロープ変異体タンパク質が患者の免疫系により認識されず、こうして破壊を免れるHIV 変異体の樹立によるためであり得る(Sci.Amer.Aug．1995，pp)。このような場合、たとえ免疫応答がde novo感染（例えば、特権キレート形成部位中のウイルスの永久突然変異）を阻止することができるとしても、HIV 感染は最終的に患者の免疫応答を克服し得る［Pantaleoら，Nature 362:355-358(1993);Embretsonら,Nature 362:359-362(1993)]。
HIV タンパク質中のＢ細胞抗原決定基及びＴ細胞抗原決定基の同定は不完全のままである。HIV エンベロープタンパク質は可変(V1-V5) 領域及び一定(C1-C5)領域を有するものと特性決定されていた。V3領域の代表的なペプチドが主要中和決定基(PND)［Javaherianら，Proc.Nat1.Acad.Sci.(USA)86:6768-6772(1989)]と称されたが、エンベロープタンパク質のその他の領域が又免疫応答を誘発するのに関係しているかもしれない。HIV からの完全長エンベロープタンパク質はハイパー突然変異(hypermutation) のために長さの変化した約850-900アミノ酸を含む［Starcichら，Cell 45:637(1986)］。
臨床試験で評価されたHIV に対する最初のワクチンが免疫系に単一エンベロープタンパク質、又はその部分を与えるように設計された。しかしながら、単一又は二三のエンベロープタンパク質に対する中和応答はHIV の異なる分離株を認識せず、個人は感染から保護されなかった［Belsheら，J.Am.Med.Assoc．272:431-431 (1994);米国特許第5,169,763号; PCT公開WO87/06262; Zaguryら，Nat-ure 332: 728-731 (1988);Kienyら，Int.Conf.AIDS 5: 541 (1989); Eichberg,Int.Conf.AIDS 7: 88 (1991); Cooneyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 1882-1886 (1993);Grahamら,J.Infect.Dis. 166:244-252 (1992);J.Infect.Dis. 167: 533-537 (1993);Keeferら,AIDS Res.Hum.Retrovir.10 (Suppl.2):S139-143 (1994); Gorse,AIDS Res.Hum.Retrovir.10 (Suppl.2): 141-143 (1994);McElrathら，J.Infect.Dis. 169: 41-47 (1994);Fauci,Science264: 1072-1073（1994年５月）］。それ故、HIV 感染症を治療又は予防するのに充分な免疫応答を誘発するワクチン及び方法を発見することにつき長きにわたって思われている切なる要望がある。
発明の要約
本発明は関係した技術の一つ以上の欠点を解消することを目的とする。特に、本発明のpolyenv ワクチンは強力な免疫応答を有利に与える。本発明の強みは有効な体液性免疫及び細胞性免疫についてＢ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び細胞毒性Ｔ細胞区画を漸増するその力にある。例えば、本発明はHIV 特異性抗体活性の大きな幅を誘発する。HIV 中和アッセイは、誘発された抗体が優れた品質のものであることを実証する。驚くことに、本発明は “天然"HIV株、即ち、エンベロープタンパク質がpolyenv カクテルに含まれないHIV 株に対し免疫応答を生じ得る。
有効なHIV ワクチンを与えるために、本発明は、夫々がエンベロープタンパク質の定常領域及び可変領域の両方を含む異なるHIV エンベロープタンパク質変異体(EPV)(又はその実質的な部分) を発現する少なくとも４〜約10,000まで、好ましくは４〜約1,000 、更に好ましくは約10〜約100 の異なる組換えウイルスの混合物を含むpolyenv ワクチンを提供する。発現されたエンベロープタンパク質変異体の夫々は感染細胞又はオリゴマー形態中のようなHIV 脂質二層中に存在する天然エンベロープタンパク質の構造及び／又は免疫原性に似ている構造及び／又は免疫原性を有することが好ましい。又、このような組換えウイルス及びpolyenvワクチンの生産方法及び使用方法が提供される。ワクチンとしてのそれらの使用に際し、変異体エンベロープタンパク質の夫々がＢ細胞及び／又はＴ細胞の異なるサブセットを誘発することが好ましく、夫々のサブセットは異なるエンベロープタンパク質、ひいては多種HIV 変異体に応答する。エンベロープタンパク質のこの数、型及び／又は構造の混合物が広いスペクトル中和活性で強力な耐久性のHIV 特異性免疫応答を誘発するための今発見された方法である。
好ましい実施態様において、組換えウイルスはワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス(AAV) からなる群から選ばれる。以下の特別な実施態様において、ワクシニアウイルスがpolyenv ワクチンを調製するのに使用される。好ましい実施態様において、本発明の組換えワクシニアウイルスワクチンは皮下投与される。本発明の更なる利点は、ワクシニアウイルスの皮下投与が病変の形成をもたらさず、こうして感染性ワクシニア（これは免疫悪化集団にとって潜在的な脅威である）の放出を回避することである。
本発明の組換えウイルスpolyenv ワクチンは感染性ウイルスに加えて発現されたエンベロープタンパク質変異体を含むウイルス感染成長細胞、例えば、vero細胞の溶解産物を含むことが好ましい。免疫応答を助ける溶解産物エンベロープタンパク質変異体の包含は本発明の特別な区別に相当する。何となれば、一般にウイルスは成長細胞溶解産物から精製されるからである。
本発明のワクチンにおいて、EVヌクレオチドが地理的に制限された領域からのHIV ウイルスで感染された患者、異なる分岐群からのHIV ウイルスで感染された患者、又はHIV の研究所単離株から単離し得る。
本発明者らは、本発明のpolyenv ワクチンが多種エンベロープタンパク質変異体（夫々が定常領域及び可変領域の両方を含み、好ましくは天然HIV エンベロープタンパク質の構造に実質的に似ている構造を有する）の発現及び／又は提示により増進された免疫応答を予期しないことに誘発することを発見した。増進された免疫応答はpolyenv ワクチン中に与えられたエンベロープタンパク質を発現する株の他にHIV 株を認識する。こうして、このようなワクチンの目的は広範囲のHIV 株に対し増進された免疫応答を与えることであり、その免疫応答はウイルスの異なる株による感染（又は突然変異のための継続した感染）を治療又は予防するのに適している。
又、本発明はエンベロープタンパク質変異体(EPV) の少なくとも一つの抗原決定基をコードする（又はそれに相補性の）env 変異体(EV)核酸を提供する。EPVは、更に本発明のpolyenv ワクチン中に与えられるような組換えウイルスによりコードされることが好ましい。変異体核酸はコードされたEPV に異なる抗原性、又は三次元構造を与える少なくとも一種の突然変異を含む。
又、本発明は本発明のpolyenv ワクチン、及び医薬上許されるキャリヤー又は希釈剤を含むワクチン組成物を提供する。更に、ワクチン組成物はワクチン組成物を投与された咄乳類中で少なくとも一種のHIV 株に対するpolyenv ワクチン免疫応答を増進するアジュバント及び／又はサイトカインを含み得る。本発明のpolyenv ワクチンは体液性免疫応答（例えば、抗体）及び細胞性免疫応答（例えば、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び細胞毒性Ｔ細胞(CTL) の活性化）の少なくとも一つを含む免疫応答を誘発することができる。
又、本発明はHIV 感染症の予防である哺乳類のHIV 感染症に対する免疫応答の誘発方法を提供し、その方法は本発明のpolyenv ワクチン（これは少なくとも一種のHIV 株の感染により生じる臨床上のHIV 関連病変に対する哺乳類の保護である）を含むワクチン組成物を哺乳類に投与することを特徴とする。
又、本発明はHIV 感染症の治療のための哺乳類のHIV 感染症に対する免疫応答の誘発方法を提供する。その方法は本発明の不活化又は弱毒化polyenv ワクチンを含む組成物を哺乳類に投与することを特徴とし、その組成物は少なくとも一種のHIV 株による感染により生じた臨床上のウイルス病変に対し哺乳類の、対照よりも、増進された免疫応答を誘発する。
更に別の実施態様において、HIV に対し免疫応答を誘発する予防方法又は治療方法は少なくとも４〜約10,000までの異なる組換えウイルスを含む有効量の別の（例えば、第二の）polyenv ワクチンを投与することを特徴とし、その組換えウイルスは先のワクチンの組換えウイルスとは異なる種の組換えウイルスであり、polyenv 中の組換えウイルスの夫々がHIV エンベロープタンパク質の異なるエンベロープタンパク質変異体をコードするenv 変異体ヌクレオチドを含む。
本発明のpolyenv 組換えウイルスワクチンで生じたHIV 特異性免疫応答は、体液性免疫応答もしくは細胞性免疫応答、又はその両方を初回感作又はブーストすることにより、有効量の少なくとも一種の組換えHIV env タンパク質、もしくはＤＮＡワクチンを投与することにより、又はその両方により更に増強し得る。又、組換えタンパク質又はＤＮＡワクチンはpolyenv ワクチンであることが好ましい。ここに提供されたワクチン戦略のいずれもがいずれの順序でも用意し得る。
例えば、被験者は組換えウイルスpolyenv ワクチンで初回感作され、続いて組換えタンパク質ワクチンによる最終ブーストでＤＮＡワクチンでブーストされてもよい。組換えHIV env タンパク質はアジュバントと一緒に混合物中にあることが好ましい。以下に例示される特別な実施態様において、組換えHIV env タンパク質が筋肉内投与される。ＤＮＡワクチンが遺伝子銃で投与されることが好ましい。
本発明の上記方法は新規プラスミドベクターを遺伝子操作することにインセンチブを与える。こうして、必然の結果の局面として、本発明は動物発現調節配列と、ウイルス発現調節配列の両方の制御下に異種挿入部位を含む、ＤＮＡワクチン及び組換えウイルスベクターとして利用することができる二機能性プラスミドを提供する。動物発現調節配列はサイトメガロウイルス即時型(CMV) プロモーターであることが好ましく、ウイルス発現調節配列はワクシニアウイルス初期プロモーター、ワクシニアウイルス後期プロモーター、又はその両方であることが好ましい。
本発明のその他の目的、特徴、利点、有用性及び実施態様は本発明に関する以下の詳細な説明及び実施例から当業者に明らかであろう。
混合HIV polyenv ワクチンに対する予期しない程増進された免疫応答の発見。
HIV の異なる株に対するワクチンを提供しようとする従来の試みはgp120 又はgp160 の一つ以上の可変領域に集中していた。ワクチン中に与えられたこのような可変領域はHIV 感染に対する広い保護を与えることが予想された。しかしながら、ワクチン誘発免疫応答がHIV の多くの異なる株を認識しない場合、このようなワクチンは成功していなかった。それ故、HIV の多種株に対し免疫応答を誘発するワクチン（その結果、これらのワクチンはHIV の治療及び／又は予防に適する）を提供することにつき重大な要望がある。
本発明者らは、予期しない程増進された一次免疫応答及び二次（ブースティング）免疫応答が少なくとも４〜1,000 程度に多く、可能には10,000程度に多い組換えウイルス（夫々が異なるエンベロープタンパク質変異体(EPV) をコードする）の混合物を含むpolyenv ワクチンの使用により数種又は多種の異なるHIV 株に対し誘発し得ることを発見した。又、ワクチンは、例えば、ウイルス生産に使用された宿主細胞中で生産されるようなウイルスにより発現されたEPV を含み得る。
“初回感作”又は“一次”及び“ブースド”又は“ブースティング”という用語は初期免疫化及びその後の免疫化を丁寧に、即ち、これらの用語が免疫学において通常有する定義に従って表すのに本明細書に使用される。
EPV をコードする核酸（エンベロープ変異体(EV)核酸）はHIV で感染されたヒトの同じ集団又は異なる集団（例えば、地理上）から単離し得る。又、異なるEV核酸はあらゆる源から得られてもよく、コーディング配列中の相違に関する配列のスクリーニングに基いて、又は既知の方法に従ってin vitro又はin vivoで多種HIV 株に対し誘発された体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答の相違を評価することにより選択し得る。
初期の発見は組換えワクシニアウイルスワクチンに関するものであった。しかしながら、当業者により容易に理解されるように、あらゆる組換えウイルスが本発明のワクチンのpolyenv 抗原を発現するのに使用し得る。更に、多種ウイルスワクチンの使用はウイルスワクチンによるブースターを有効ではなくなるようにする（激しい抗ウイルス応答の可能な強化のために）抗ウイルス免疫応答をなくすことができる。
当業者により容易に理解されるように、本発明者らは一種以上の組換えHIV env タンパク質、好ましくは複数のタンパク質によるブースティングが本発明の免疫化方法を更に強化することを更に見出した。一種以上のHIV env タンパク質はpolyenv ワクチン中の発現されたHIV env タンパク質に相当してもよく、又はそれらは異なるHIV env タンパク質であってもよい。
同様に、当業者により容易に理解されるように、本発明の免疫化方法はＤＮＡワクチンの使用により増進される。ＤＮＡワクチンは、例えば、組換えHIV タンパク質に関して上記されたようにブーストとして使用し得る。又、ＤＮＡワクチンは抗HIV 免疫応答をブーストするのに使用された一種以上の組換えウイルスワクチンで免疫を初回感作するのに使用し得る。組換えenv タンパク質ブースターワクチンについて、ＤＮＡワクチンは一種以上のHIV env 遺伝子の発現のための一種以上のベクターを含んでもよい。加えて、HIV env 遺伝子は組換えウイルスワクチンにより発現された遺伝子に相当してもよく、又はそれらは異なっていてもよい。好ましい実施態様において、ベクターが組換えウイルスワクチン中及びＤＮＡワクチンの一部としてのトランスフェクトされた哨乳類細胞中の発現のために調製される。
この免疫応答（体液性及び／又は細胞性として）は広範囲の感染性ウイルス、例えば、HIV の株に有効であることがわかり、polyenv ワクチンにより与えられる特定のエンベロープタンパク質変異体(EPV) を発現するウイルス株に限定されない。こうして、本発明はHIV の多種株に対し予期しない程増進された免疫応答を与える組換えウイルスワクチンによりコードされた多種EPV を提供する。
Polyenv ワクチン及びワクチン注射
こうして、本発明は、一局面において、夫々が異なるエンベロープタンパク質変異体、又はその抗原性部分を発現する少なくとも４〜10,000までの異なる組換えワクシニアウイルスの混合物を使用するpolyenv ワクチンを提供する。当業者により容易に理解されるように、４〜約1000、好ましくは約10〜約100 の異なる組換えウイルスが使用し得る。当業者は、その他のウイルスがワクチンに使用し得ることを更に容易に理解し得る。ワクシニアウイルスの他にワクチンの組換えウイルス宿主として作用し得る好適なウイルスの例として、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルスが挙げられる。又、このようなpolyenvワクチンの生産方法及び使用方法が提供される。
本発明のpolyenv ワクチンはpolyenv ワクチンを投与された哺乳類で体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の少なくとも一つを誘発するが、ワクチンに対する応答は準臨床的であり、又はHIV の少なくとも一種の株に対し少なくとも一つの免疫応答を増進するのに有効であり、その結果、ワクチン投与がワクチン注射目的に適する。
ウイルスワクチン
種々の遺伝子操作されたウイルス宿主(“組換えウイルス”)がHIV polyenv 抗原の投与のためのpolyenv ウイルスワクチンを調製するのに使用し得る。ウイルスワクチンは、ウイルス感染成分がＢリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、及び細胞毒性Ｔリンパ球の活性化を標的とする激しい免疫応答を促進する点で特に有利である。多数のウイルス種が本発明のワクチンの組換えウイルス宿主として使用し得る。ウイルスワクチンに好ましい組換えウイルスはワクシニアウイルスである［Mossらによる1987年10月22日の国際特許公開WO 87/06262；Cooneyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90: 1882-6 (1993); Grahamら,J.Infect.Dis.166: 244-52 (1992); McElrathら,J.Infect.Dis.169:41-7 (1994)］。
別の実施態様において、組換えカナリア痘ウイルスが使用し得る［Pialoux ら，AIDS Res.Hum.Retroviruses 11: 373-81 (1995)，erratum AIDS Res.Hum.Retro-viruses 11: 875 (1995); Andersson ら,J.Infect.Dis.174: 977-85 (1996); Fries ら，Vaccine 14: 428-34 (1996); Gonczolら，Vaccine 13: 1080-5(1995)］。別の代替物は欠損アデノウイルス又はアデノウイルスである［Gilar-di-Hebenstreitら,J.Gen.Viro1.71: 2425-31 (1990); Prevecら,J.Infect.Dis．161: 27-30 (1990); Lubeckら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86: 6763-7(1989); Xiang ら，Virology 219: 220-7 (1996)］。その他の好適なウイルスペクターとして、両種性宿主範囲で細胞中にパッケージされるレトロウイルス［M-iller,Human Gene Ther.1:5-14 (1990);Ausubel ら，Current Protocolsin Molecular Biologyg,§９を参照のこと］、及び弱毒化又は欠損ＤＮＡウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)［例えば、Kaplittら，Molec.Cell.Neurosci．2: 320-330（1991）を参照のこと］、パピローマウイルス、エプステインバールウイルス(EBV) 、アデノ関連ウイルス(AAV)［例えば、Samulskiら，J.Viro1.61: 3096-3101 (1987);Samulskiら,J.Virol.63: 3822-3828 (1989)を参照のこと］等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＤＮＡワクチン
抗原及びアジュバントを含む従来のワクチンの代替物は被験者の組織の細胞による抗原の発現のために被験者の組織への抗原をコードするＤＮＡの直接in vivo導入を伴う。このようなワクチンが本明細書中“ＤＮＡワクチン”又は“核酸をベースとするワクチン”と称される。ＤＮＡワクチンは国際特許公開WO 95/20660 及び国際特許公開WO 93/19183 に記載されている。ウイルスタンパク質をコードする直接注射されたＤＮＡが保護免疫応答を誘発する能力が多数の実験系で実証されていた［Conry ら，Cancer Res.，54: 1164-1168(1994); Coxら,Viro1,67: 5664-5667 (1993); Davisら,Hum.Mole.Genet.,2:1847-1851 (1993); Sedegahら,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:9866-9870 (1994);Montgomeryら，DNA CellBio.，12: 777-783 (1993); Ulmerら，Science,259: 1745-1749 (1993); Wangら，Proc.Natl.Acad.Sci.，90: 4156-4160 (1993);Xi-ang ら，Virology，199:132-140 (1994)］。この戦略をインフルエンザウイルスの中和で評価するための研究はエンベロープウイルスタンパク質及び内部ウイルスタンパク質の両方を使用して抗体の産生を誘発していたが、特にウイルス血球擬集素タンパク質(HA)に集中していた［Fynan ら，DNA Cell.Biol.，12: 785-789(1993);Fynan ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,90: 11478-11482(1993B); Robinsonら,Vaccine,11:957 (1993); Websterら,Vaccine,12: 1495-1498（1994）]。
HIV envタンパク質をコードするＤＮＡを直接導入して保護免疫応答を誘発することによるワクチン注射は細胞媒介応答及び体液性応答の両方を生じる。これは生ウイルスで得られた結果に似ている［Raz ら，Proc.Natl.Acad.Sci.，91:9519-9523(1994); Ulmer，1993,上記文献; Wang，1993，上記文献; Xiang，1994,上記文献］。白イタチによる研究は、表面糖タンパク質と一緒に、インフルエンザの保存内部ウイルスタンパク質に対するＤＮＡワクチンが不活化ワクチン又はサブビリオン(subvirion) ワクチンよりもインフルエンザウイルスの抗原性変異体に対し有効であることを示す［Donnellyら，Nat.Medicine，6: 583-587(1995)］。実際に、実質的に動物の寿命にわたって持続する核タンパク質をコードするＤＮＡに対する再現性免疫応答がマウスで報告されていた［Yankauckasら，DNACell Bio1.,12:771-776(1993)］。
当業界で公知であるように、多数の因子が抗原遺伝子の発現の効率及び／又はＤＮＡワクチンの免疫原性に影響し得る。このような因子の例として、接種の再現性、プラスミドベクターの構築、抗原遺伝子発現を誘導するのに使用されるプロモーターの選択及びプラスミド中の挿入された遺伝子の安定性が挙げられる。
それらの起源に応じて、プロモーターは組織特異性及びｍＲＮA合成を開始する際の効率を異にする［Xiangら，Virology，209: 564-579 (1994); Chapmanら，Nucle.Acids.Res.，19: 3979-3986 (1991)］。今日まで、哺乳類系の殆どのＤＮＡワクチンはサイトメガロウイルス(CMV) から誘導されたウイルスプロモーターに頼っていた。これらは幾つかの哺乳類種で筋肉接種及び皮膚接種の両方で良好な効率を有していた。ＤＮＡ免疫化により誘発された免疫応答に影響することが知られている別の因子はＤＮＡ送出の方法である。非経口経路が遺伝子移入の低い率を生じ、又遺伝子発現のかなりのばらつきを生じ得る［Montgomery,1993，上記文献］。遺伝子銃を使用するプラスミドの高速接種がおそらくＤＮＡトランスフェクションの大きな効率及び樹状細胞による有効な抗原提示のためにマウスの免疫応答を増進した［Fynan，1993B，上記文献; Eisenbraunら，DNACell Biol.，12:791-797 (1993)］。又、本発明の核酸をベースとするワクチンを含むベクターは当業界で知られているその他の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、又はＤＮＡベクター輸送体により所望の宿主に導入し得る［例えば、Wuら，J.Biol.Chem.267: 963-967 (1992); Wu及びWu，J.Bio1.Chem.263:14621-14624 (1988); Hartmut ら，カナダ特許出願第2,012,311 号(1990 年３月15日出願) を参照のこと］。
ウイルスワクチン及びＤＮＡワクチン用の二機能性プラスミド
本発明の好ましい局面はＤＮＡワクチン及び組換えウイルスベクターとして利用することができる二機能性プラスミドの操作に関する。精製プラスミドＤＮＡ、即ちＤＮＡワクチンとしての直接注射は試験被験者中でプラスミドにより発現された抗原に対し免疫応答を誘発するであろう。又、プラスミドは免疫化ビヒクルとしての生組換えウイルスに有益であろう。
本発明の二機能性プラスミドは２種の異なる発現調節配列：動物発現調節配列、及びウイルス発現調節配列の制御下に異種遺伝子、又は異種遺伝子の挿入部位を与える。“制御下に”という用語はその通常の意味、即ち、発現調節配列、例えば、プロモーターが異種遺伝子の発現のための発現を与えるという意味で、操作可能に、又は操作により会合されてという通常の意味で使用される。好ましい実施態様において、動物発現調節配列は哺乳類プロモーターである（鳥類プロモーターが又本発明により意図されている）。特別な実施態様において、プロモーターはサイトメガロウイルス即時型(CMV) プロモーターである（図７を参照のこと）。更に別の特別な実施態様において、ウイルスプロモーターはワクシニアウイルス初期プロモーター、もしくはワクシニアウイルス後期プロモーター、又はその両方である（図７）。被験者はＤＮＡとしてかつ異なる時間で、又、組換えウイルスワクチンとしてあらゆる順序で投与された二機能性プラスミドで多段階(multi-tiered) レジメでワクチン注射し得る。本発明はＤＮＡワクチンもしくは組換えウイルスワクチン、又はその両方としての二機能性プラスミドの単一又は多重投与を意図している。このワクチン注射レジメは組換えタンパク質ワクチン（以下を参照のこと）の投与で実施されてもよく、又は付加的なワクチンビヒクルとともに使用されてもよい。
当業者が容易に理解し得るように、本発明の二機能性プラスミドはpolyenv ワクチンベクターとして使用し得る。こうして、少なくとも４〜約10,000まで、好ましくは４〜1000、更に好ましくは10〜100 の異なるHIV env遺伝子を二機能性プラスミドに挿入することにより、こうしてpolyenv ワクチンとして有益な二機能性プラスミドの相当する組を調製する。
組換えタンパク質ワクチン
本発明の一種以上のHIV env タンパク質によるワクチン注射により誘発された活性免疫は細胞性免疫応答又は体液性免疫応答を初回感作又はブーストすることができる。一種以上のHIV env タンパク質、又はその抗原性フラグメントはワクチンを調製するためにアジュバントと混合して調製し得る。
“アジュバント”という用語は抗原に対する免疫応答を増進する化合物又は混合物を表す。アジュバントは抗原を徐々に放出する組織デポー剤として、そして又免疫応答を非特異的に増進するリンパ系アクチベーターとして利用することができる(Hood ら，Immunology，第２編，1984，Benjamin/Cummings: Menlo Park,Ca1ifornia，384頁) 。しばしば、アジュバントの不在下の抗原単独による一次抗原投与は体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘発することができないであろう。アジュバントとして、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション又は炭化水素エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG(カルメットゲランウシ型) 及びコリネバクテリウム・パルブムが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントの選択はワクチン注射される被験者に依存する。医薬上許されるアジュバントが使用されることが好ましい。例えば、ヒト用ワクチンは完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントを含む油エマルションアジュバント又は炭化水素エマルションアジュバントを避けるべきである。ヒト用に適したアジュバントの一例はミヨウバン（アルミナゲル）である。以下の特別な実施態様において、組換えHIV env タンパク質はミョウバン中で筋肉内投与される。又、組換えHIV env タンパク質ワクチンは皮下、経皮、腹腔内、又はその他の許されるワクチン投与経路により投与し得る。
ワクチン投与
本発明によれば、HIV に対する免疫化は本発明の組換えウイルスワクチン単独で、もしくはＤＮＡワクチンもしくは組換えタンパク質ワクチンと組み合わせて、又はその両方で達成し得る。特別な実施態様において、ミョウバン中の組換えHIV env タンパク質がi.m.で与えられて免疫応答をブーストする。
ウイルスワクチンの夫々の投与は同じ４〜10,000、好ましくは４〜1000、更に好ましくは10〜100 の異なる組換えウイルスを含んでもよく、夫々が異なるHIV env 遺伝子を発現する。又、その後のワクチン中のウイルスは異なるHIV env 遺伝子を発現し得る。更に別の実施態様において、その後のpolyenv ウイルスワクチンは共通の幾つかのウイルス、及び初期ワクチンからの異なるその他のウイルスを有していてもよい。例えば、初回感作ワクチンは1-10と任意に指定されたHIV env タンパク質を発現するワクシニアウイルスを含んでもよい。２回目（ブースター）ワクチンはHIV env タンパク質6-15又は11-20 等を発現するワクシニア（又は好ましくは異なるウイルス、例えば、カナリア痘ウイルス又はアデノウイルス）ウイルスを含んでもよい。
ＤＮＡワクチン又は組換えタンパク質ワクチンは単-HIV env タンパク質抗原、又は多種抗原を有していてもよい。本発明における使用のためのＤＮＡ又は組換えタンパク質ワクチンは一種より多いHIV env タンパク質抗原を含むことが好ましい。その後のウイルスワクチンについて、ＤＮＡワクチン又は組換えタンパク質ワクチンの一種以上のHIV env タンパク質はpolyenv ウイルスワクチン中で発現されたHIV env タンパク質に相当してもよく、又はそれはpolyenv env タンパク質のいずれとも異なっていてもよい。
一般に、本発明の好ましい実施態様は夫々のワクチン注射プロトコルで可能な最大の多様性を与えて、レシピエントを最大数のHIV env タンパク質に露出し、こうして天然HIV 分離株との交差反応性を中和する最大の機会を与えることを意図している。
エンベロープタンパク質変異体
上記のように、本発明のワクチン用のEPV は地理上局所の単離物、もしくは分岐群、又は地理上異なる単離物、即ち、異なる分岐群から得られる。当業者により容易に理解し得るように、天然単離株からenv ヌクレオチド（即ち、遺伝子）を得ることは多数の利点を有する。単離株は容易に入手でき、EVP は免疫が望ましい天然産タンパク質に相当し、HIV の突然変異が新しい単離株から迅速に捕獲し得る。
又、EPV は少なくとも一種のエピトープ又は抗原決定基としてEPV アミノ酸配列のアミノ酸配列により誘発された免疫原活性を有するポリペプチドを含む。このアミノ酸配列は少なくとも一種の10-900アミノ酸フラグメント及び／又は既知HIV EPV のコンセンサス配列に実質的に相当する。このようなEPV は、HIV の少なくとも一種の株に対し免疫原応答を誘発する間に、既知エンベロープタンパク質アミノ酸に対し少なくとも50％の総合の相同性又は同一性、例えば、50-99 ％の相同性、又はその中のあらゆる範囲もしくは値を有し得る。
相同性％は、例えば、ウィスコンシン大学の遺伝学コンピューターグループ(UMGCG) から入手し得るGAP コンピュータープログラム、バージョン6.0 を使用して配列情報を比較することにより測定し得る。GAP プログラムはSmith 及びWaterman［Adv.Appl.Math．2:482 (1981)］により修正されたようなNeedleman及びWunschのアラインメント方法［J.Mo1.Bio1．48:443 (1970)］を利用する。簡単に言えば、GAP プログラムは二つの配列の短い方中の記号の合計数で割られた配列記号（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数（これらは類似している）として類似性を定義する。GAP プログラムに関する好ましい省略時パラメーターとして、(1)ユニタリー比較マトリックス（同一性について１の値及び非同一性について０を含む）及びSchwartz及びDayhoff 編集，Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation，Washington，DC(1979)，353-358頁に記載されたようなGribskov及びBurgess，Nucl.Acids Res.14:6745 (1986)の重み付き比較マトリックス;(2)夫々のギャップについて3.0のペナルティー及び夫々のギャップ中の夫々の記号について追加の0.10のペナルティー、及び(3)末端ギャップについてペナルティーなしが挙げられる。
好ましい実施態様において、本発明のEPV は少なくとも一種のHIV エンベロープタンパク質の変異体形態である。EPV はgp120 とgp140 としてのgp41のオリゴマー化ドメイン［Hallenbergerら，Viro1ogy 193:510-514 (1993)］とを含むことが好ましい。
既知HIV エンベロープタンパク質は約750-900 アミノ酸を含む。このような配列の例が市販かつ業務用のHIV 配列データベース、例えば、GENBANK から、又は公表された編集・例えば、Myers ら編集，Human Retrovirusesand AIDS，A Co-mpilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences,I巻及びII巻，Theoretical Biology and Biophysics,Los Alamos,NM（1993）として容易に入手し得る。本発明の組換えウイルス又はpolyenv ワクチン用の核酸によりコードされた付加的なEPV を得るためのEPV の置換又は挿入として、少なくとも一つのアミノ酸残基（例えば、1-25アミノ酸）の置換又は挿入が挙げられる。又、少なくとも一つのアミノ酸（例えば、1-25アミノ酸）がEPV 配列から欠失し得る。このような置換、挿入又は欠失はHIV で感染された個体からの少なくとも一つのEPV をコードする核酸のヌクレオチド配列決定により得られたエンベロープタンパク質の配列決定に基いて同定されることが好ましい。
このような置換、挿入又は欠失の非限定例はHIV-1感染患者からのenv ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の増幅によりつくられ、これらはエンベロープタンパク質又はEPV の修飾構造特性及び機能性を得るためのルーチン実験により決定し得る。
こうして得られたEPV は初期のEPV とは異なる抗原性を有することが好ましい。
このような抗原の相違は好適なアッセイ、例えば、ELSAアッセイにおけるHIV エンベロープタンパク質に特異性のモノクローナル抗体のパネルによる試験により測定し得る。
得られるEPV タンパク質がHIV エンベロープタンパク質に結合する抗体を誘発する限り、あらゆる置換、挿入又は欠失が使用し得るが、そのEPV は二次EPV により誘発された抗体とは異なるパターンを有する。上記置換、挿入又は欠失の夫々が又37C.F.R.§.822(p)(2) に示されるような修飾アミノ酸又は格別のアミノ酸を含むことができる。
下記の表Iは本発明の組換えウイルスによりコードし得るHIV のエンベロープタンパク質の別の変異体の非限定例を示す。







Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
Figure 2007259870
それ故、特定の置換の上記の例に基いて、別の置換がルーチン実験により、例えば、異なる免疫応答を生じるエンベロープタンパク質又はEPV 中に一つ以上の置換、挿入又は欠失をつくることによりつくられて、本発明の別のEPV を与えることができる。
本発明のEPV 中のアミノ酸配列変化は、例えば、そのＤＮＡ中の突然変異により調製し得る。このようなEPV は、例えば、アミノ酸配列内の異なるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を含む。明らかに、EPV をコードする核酸中でつくられる突然変異はその配列を読み取り枠から出て配置してはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生じる相補ドメインを生じない［例えば、以下のAusbel (1995年改訂);以下のSambrook（1989）を参照のこと］。
又、本発明のEPV をコードする核酸はエンベロープタンパク質又はEPV をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ中のヌクレオチドの増幅又は部位誘導突然変異誘発、そして本明細書に示された教示及びガイダンスに基いて、その後のEPV をコードするＤＮA又はＲＮＡを生産するためのそのコードするＤＮＡの合成又は逆転写により調製し得る［例えば、以下のAusubel (1995年改訂);以下のSambrook (1989)を参照のこと］。
本発明のEPV を発現する組換えウイルス、組換えEPV 、又はそれをコードする核酸ベクターは、本明細書に示された教示及びガイダンスに基いて、無用の実験をしないでも、当業者によりルーチンで得られる置換ヌクレオチドとしてEPV をコードする配列の有限の組を含む。タンパク質化学及び構造の詳細な記載について、Schu1z,G.E.ら，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag,New York,NY (1978)、及びCreighton,T.E.,Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman ＆Co.，San Fransisco，CA（1983）を参照のこと。ヌクレオチド配列置換、例えば、コドン優先の提示について、Ausbelら編集，Cur-rentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.，New York,NY (1987，1988，1989，1990，1991，1992，1993，1994，1995)(以下、 “Aus-ubel(1995年改訂)")§§A.1.1-A.1.24、及びSambrook,J．ら，Molecular Clo-ning:A Laboratory Manual,第２編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY（1989）補遺Ｃ及びＤを参照のこと。
こうして、当業者は、本明細書に示された教示及びガイダンスを与えられたとすると、その他のアミノ酸残基をenv ＤＮＡ又はＲＮＡのその他の位置で置換して、置換変異体、欠失変異体又は挿入変異体を含む別のEPV を得る方法を知るであろう。
HIV 活性に関するスクリーニング活性
本発明のワクチンで免疫された個体からの血清又は細胞の抗HIV 活性のスクリーニングについて、あらゆる既知のスクリーニングアッセイ及び／又は好適なスクリーニングアッセイが、当業界で知られているように使用し得る。例えば、既知のHIV アッセイとして、ウイルス感染性アッセイ［例えば、Chesebroら，J.Virol.62: 3779-3788 (1988);A1dovini ら編集，Techniques in HIV Research71-76頁(1990)を参照のこと］、中和アッセイ［例えば、Golding ら，AIDS Res.Hum.Retrovir．10: 633-643(1994);Hanson,AIDS Res.Hum.Retrovir．10: 645-648 (1994);Laalら，Res.Hum.Retrovir.9:781-785 (1993);Hanson,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.7: 211-219（1994）を参照のこと］、末梢単核(PMN) 細胞アッセイ［例えば、Arduinoら，Antimicrob.Agents Chemother．37: 1095-1101(1990)を参照のこと］、及び細胞毒性Ｔリンパ球(CTL) アッセイ［例えば、Ham-ｍondら，J.Exp.Med．176: 1531-1542(1992);McElrathら，J.Virol.68:5074-5083 (1994);Walker ら,Cell.Immunol.119:470-475(1989);Weinhold ら，AIDS Res.Hum.Retrovir．8: 1373（1992）］を参照のこと］が挙げられる。単独又はあらゆる組み合わせのその他の好適な活性として、転写、複製、翻訳、ウイルス粒子とり込み、毒力、ウイルス歩留り、及び/又は形態形成の定量的測定及び／又は定性的測定が挙げられるが、これらに限定されない。
特別な実施態様：EPVを００コードする組換えワクシニアウイルス、Polyenvワクチン並びにその生産方法及び使用方法
大要
HIV エンベロープタンパク質（例えば、gp41、gp120 及び／又はgp160、或いはこれらの部分）を発現する組換えワクシニアウイルス(VV)はウイルスに対し体液性免疫応答又は細胞性免疫応答の少なくと一つを誘発する混合ワクチンの生産及び試験、並びにＢ細胞及びCTL 決定基の分析に有益な物質を与える。
本発明のpolyenv ワクチンはｎ種の異なる組換えワクシニアウイルス（ｎは約４から約10,000までの全数（又はその中のあらゆる範囲もしくは値）である）の混合物からなり、夫々のワクシニアベクター構築物はHIV-1 エンベロープタンパク質(EPV) の変異体（例えば、gp41、gp120 又はgp160)を発現する。組換えワクシニアウイルスはEPV を機能的にコードし、プラスミドによる野生型VVの組換えにより調製される。EPV をコードする多種の異なるプラスミドが、例えば、制限フラグメント又は突然変異誘発を使用して、一つのEPV をコードする配列を別の配列で置換することにより調製し得る。
組換えワクシニアウイルスの調製
個々のプラスミド（夫々が特異なHIV タンパク質を発現する）の調製方法はベクター（例えば、pVenv4又はpVenv1［Halle-nberger ら，Virology 193: 510-514 (1993)］への単離されたエンベロープタンパク質変異体配列の置換のためにＤＮＡ又はＲＮＡ増幅を使用することができ、そのベクターは既知HIV エンベロープタンパク質配列（例えば、NIAID AIDS Re-search＆Reference Reagent Program，Rockvi1le,MDから入手し得る）をコードする。
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は当業界で公知であり、本明細書に示された教示及びガイダンスに基いて、無用の実験をしないで本発明に従って使用し得る。既知のＤＮＡ又はＲＮＡ増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)及び関連増幅方法（例えば、Mullisらの米国特許第4,683,195 号、同第4,683,202 号、同第4,800,159 号、同第4,965,188 号; Tabor らの米国特許第4,795,699 号及び同第4,921,794号; Innis の米国特許第5,142,033号; Wilsonらの米国特許第5,122,464号; Innis の米国特許第5,091,310 号; Gyl1enstenらの米国特許第5,066,584号; Gelfandらの米国特許第4,889,818 号; Silverらの米国特許第4,994,370号; Biswasの米国特許第4,766,067号; Ringoldの米国特許第4,656,134号を参照のこと）並びに二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対しアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅(Malekらの米国特許第5,130,238 号；商標名NASBA を有する) が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、この経路により調製された組換えワクシニアウイルス構築物は免疫化及びHIV 特異性Ｔ細胞応答及び／又はＢ細胞応答の誘発に使用し得る。プライマーは保存HIV 配列を使用し、こうして多くの異なるHIV-1 患者サンプルからのenv 遺伝子を成功裏に増幅する。ここに記載された基本的な技術が、HIV エンベロープタンパク質をコードするベクター中に見られる配列を現場単離物からのenv 配列の大小の片に置換するために、PCR プライマー又はその他の型の増幅プライマーとともに同様に使用し得る。例えば、以下のAusubel;以下のSambrookを参照のこと。
EPV をコードする核酸
その技術はHIV 感染細胞からのＤＮＡの単離及びPCR によるenv 配列の増幅で始まる。PCR 増幅産物又はその他の増幅産物はHIV 配列の単離に最も簡単な手段を与えるが、あらゆるその他の好適な既知方法、例えば、EPV をコードする核酸又はタンパク質のクローニング及び単離が使用し得る（以下のAusubel;以下のSambrookを参照のこと）。酵素制限部位はPCR 増幅プライマー配列又はその他の増幅プライマー配列にとり込まれて遺伝子クローニングを促進することが好ましい。
PCR 用の単離されたＤＮＡは多種ウイルス源（HIV+患者及びウイルス分離株でin vitro で感染された細胞からの新しい全血又は凍結全血を含む）から調製し得る。
新規なHIV env 構築物を生産するために、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)が夫々異なるHIV 患者サンプルからのenv 遺伝子の100-2700塩基対(bp)を増幅するのに使用されることが好ましい。PCR プライマーはenv 遺伝子の既知のサンプル、単離されたHIV 又は異なるHIV 患者サンプルからenv 遺伝子を増幅するのに適している良く保存されたHIV 配列に相当し得る。増幅されたＤＮＡはgp120 及びgp41（両方ともgp160 を構成する）の10-900（例えば、100-400 、400-600 もしくは600-900 、又はその中のあらゆる範囲もしくは値）のアミノ酸をコードする部分を含むことが好ましい。
エンベロープ可変領域(V1-V5) 及び定常領域(C1-C5) の一つ以上がPCR 産物中に含まれることが好ましく、V1領域、C1領域、V2領域、C2領域、V3領域、C3領域、V4領域、C4領域、及びV5領域の殆どが含まれることが更に好ましい。加えて、増幅された配列はgp120/gp41について開裂部位を越えて1-200 アミノ酸をコードすることができる。完全env 遺伝子の殆ど又は全部が増幅されることが好ましい。必要により、増幅されたgp160 をコードする配列はトランスメンブランドメイン及び／又は細胞質テイルドメインをコードする配列の一部又は全部を欠いていてもよい［例えば、Hallenbergerら(1993)を参照のこと）］。
PCR プライマーは、制限酵素部位がワクシニアプラスミド中でエンベロープ遺伝子配列に隣接するように設計でき、その結果、それらは増幅されたＤＮＡ産物にとり込まれる。公知の置換クローニング技術を使用することにより、1-10,000の患者からのエンベロープタンパク質変異体配列を発現するワクシニアプラスミド誘導体は、例えば、置換に制限フラグメントを使用することにより、ワクシニアプラスミド中のenv 配列の相当する部分を患者のEPV をコードする配列の部分に置換することにより生成し得る。例えば、pVenv4プラスミド及びPCR 産物がKpnI及びBsmIで処理されてアミノ酸1-639 のトランケートgp160 をコードする配列を得、これはトランスメンブランドメイン及びgp41の細胞質テイルドメインの両方を欠いている［例えば、Hallenbergerら(1993)を参照のこと）］。
PCR 産物及びpVenv 産物の結合後に、バクテリア宿主細胞が、例えば、エレクトロポレーションを含む当業界で公知の幾つかの方法のいずれかにより結合混合物で形質転換され、組換えコロニーが採取され、配列決定により試験される。
HIV エンベロープタンパク質をコードする組換えワクシニアウイルス構築物
次いでEPV をコードするワクシニアが宿主細胞中で野生型ウイルスで組換えられ、EPV を発現するウイルスプラークが選択され、ウイルス株がつくられる。次いで夫々が異なるEPV をコードする配列を含むVVenv のようなウイルス株が、少なくとも4-40〜約10,000までの異なる組換えウイルスを使用して混合されて、本発明のpolyenv ワクチンを生成する。
次いでEPV 配列を含む組換えワクシニアプラスミドが必要により配列決定され、又はHIV エンベロープタンパク質特異性抗体でスクリーニングされて異なるEPVを同定する。Sanger方法ジデオキシ−鎖終結による配列決定が好ましい。その操作は既に記載された方法［以下のSambrook (1989); United States Biochemical,Sequenase Version 2.0-DNA Sequecing Kit,第９編，Amersham Life Science,Inc., (1994)］から採用されることが好ましく、プライマー位置から約50-300bpを読み取るべきである。
VV発現ベクターの生産方法は当業界で公知である［例えば、Mackett,M.ら，Proc.Natl.Acad.Sci．(USA) 79:7415-7419 (1982);Panicali,D.及びPaoletti,E.,Proc.Natl.Acad.Sci．(USA) 79:4927-4931 (1982);米国特許第4,169,763号; Mazzara,G.P.ら，Methods in Enz．217: 557-581 (1993),以下のAusubel ら，§§16.15-16.19を参照のこと］。既に記載されたpSC11 ベクター[Chakrabarti,S.ら，Mol.Cell.Biol．5: 3403-3409 (1985)]がpVenv4の如きenv コードされたプラスミドを生じるのに使用されることが好ましい。
ウイルスベクターとして、ワクシニアウイルスは外来ＤＮＡの大きいフラグメント(20Kb より大きい) のクローニング、外来ＤＮＡの挿入後の感染性の保持、野生宿主範囲、比較的高いレベルのタンパク質合成、並びに好適な輸送、分泌、プロセシング及び発現されたタンパク質の一次構造により指示されるような後翻訳修飾及び宿主細胞型使用を可能にする能力を含む幾つかの有益な特性を有する。例えば、Ｎ−０−グリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、及び開裂、並びに発現されたタンパク質の集合が忠実な様式で起こる。
ワクシニアベクターの幾つかの変化が開発され、本発明における使用に適している（例えば、以下のAusubelら，§§16.15-16.19 を参照のこと）。最も普通に、ウイルス株 (以下のAusubel ら，§16.16)を得た後、EPV をコードする核酸配列がワクシニアウイルスプロモーターの制御下に置かれ、感染性を保持するようにワクシニアのゲノムに組込まれる (以下のAusubel ら，§16.17)。又、発現はEPV をコードするワクシニアプロモーター調節遺伝子を含むプラスミドを野生型ワクシニアで感染された細胞にトランスフェクトすることにより達成し得る。
宿主細胞及びワクシニアベクターは哺乳類及びヒトのワクチン注射における使用に適しており、認可されることが好ましい。次いでこれらの組換えウイルスが種々の既知方法 (以下のAusubel ら，§16.18)を使用して特性決定される。更に別の変化において、バクテリアファージT7 RNAポリメラーゼ鎖がワクシニアのゲノムに組込まれ、その結果、EPV をコードする配列がトランスフェクトされたプラズマ、プラスミド中でT7プロモーターの制御下で発現され、又は組換えワクシニアウイルスが発現されるであろう。
ポックスウイルスプロモーターの使用が好ましい。何となれば、細胞ウイルスプロモーター及びその他のウイルスプロモーターがワクシニア転写装置により通常認識されないからである。コンパウンド初期／後期プロモーターがpolyenv ワクチン用の組換えワクシニア中で使用されることが好ましい。何となれば、主要組織適合クラス(MHC)I又はIIと混在して組換えワクシニアウイルス感染宿主細胞中で提示される抗原としてEPV を発現することが望ましいからである。このようなMHC 関連HIV エンベロープタンパク質はその後に細胞毒性Ｔ細胞標的を形成し、発現されたHIV EPV に対し細胞毒性Ｔ細胞応答及び／又は体液性応答についてワクチン注射された哺乳類を初回感作するであろう。これは、この型の抗原について宿主細胞中でMHC 提示を誘発するワクシニアウイルスベクターの能力が感染段階で後に低下することが明らかであるためである。初期に生じる転写産物は配列TTTTTNT 後に終止し、不適当なMHC 提示をもたらすであろう。
又、遺伝子のコーディング配列内のあらゆるこのような終止モチーフは、宿主細胞中のエンベロープタンパク質抗原のMHC 提示を増進するために、初期ポックスウイルスプロモーターが使用される場合に、突然変異誘発により変化し得る（以下のEarlら，1990）。ワクシニアウイルスｍＲＮＡを模擬するために、未翻訳リーダー配列及び3'末端配列は、それらがHIV EPV をコードする配列をとり込むワクシニアプラスミド中に使用される場合に、通常短く保たれる。
本発明のワクシニア構築物をつくるのに使用されるプラスミドはワクシニアプロモーターの下流のenv 遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位で設計されることが好ましい (以下のAusubel ら，§16.17)。プラスミドはエンベロープタンパク質をコードする配列を既に含むことが更に好ましく、その制限部位はエンベロープタンパク質をコードする配列の開始及び末端の夫々付近に特異に生じる。次いでEPV をコードする配列の同じ制限フラグメントがプラスミド中の相当する配列を置換し得る。このような場合、EPV をコードする配列の主要部分は、エンベロープタンパク質をコードする配列の殆ど又は全部をプラスミドから除去した後に挿入し得る。
得られるワクシニア構築物（EPVをコードする配列及びワクシニアプロモーターを含む）はワクシニアＤＮＡにより隣接されることが好ましく、プラスミドが野生型ワクシニアウイルスで既に感染された細胞にトランスフェクトされる場合に相同的組換えを可能にする。隣接ワクシニアウイルスＤＮＡは、組換えが必須ウイルス遺伝子を中断しないように選ばれる。
選択しないで、組換えワクシニアウイルス対親ワクシニアウイルスの比は通常1:1000である。この頻度は組換えウイルスを採取するためのプラークハイブリダイゼーション（以下のAusubel ら，§§6.3及び6.4を参照のこと）又はイムノスクリーニング (以下のAusubelら，§6.7)の使用を可能にするのに充分であるが、組換えウイルス同定を促進する種々の方法が使用された。このような選択技術又はスクリーニング技術の非限定例が当業界で知られている（以下のAusubelら，§16.17を参照のこと）。通常、発現カセットはワクシニアチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のセグメントにより隣接され、その結果、組換えがTKの不活化をもたらす。次いでTK- 表現型を有するウイルスは、TK- 細胞系を５−ブロモ−デオキシウリジン(5-BrdU)（これはTKによりリン酸化されてウイルスゲノムに致死的にとり込まれる必要がある）の存在下で感染させることによりTK+表現型を有するウイルスから区別し得る。又、或いは更に、組換えウイルスはアンピシリン(amp) 又はグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt) の如きバクテリア抗生物質耐性遺伝子の同時発現により選択し得る。更に別の例として、エシェリキア・コリlac Z遺伝子の同時発現がXgal (以下のAusubel ら，§16.17)との組換えウイルスプラークの同時スクリーニングを可能にする。
本発明のEPV を発現する組換えワクシニアウイルスは必要により既知方法、例えば、加熱、パラホルムアルデヒド処理、紫外線照射、プロプリオラクテン処理、ハイブリッドもしくはキメラ生成又はその他の既知方法［例えば、Zaguryら，Nature 332: 728-731 (1988);Ito ら,Cancer Res.50: 6915-6918 (1990): Wellisら，J.Immunol．99: 1134-9 (1967);D'Honcht,Vaccine 10 (Suppl.):548-52 (1992); Selenkaら，Arch.Hyg.Bakteriol.153: 244-253 (1969);Grun-dwald-Bearchら，J.Cancer Res.Clin.Onco1．117: 561-567 (1991)］により弱毒化又は不活化し得る。例えば、60℃における熱不活化はウイルスカ価をかなり低下するであろう。このような弱毒化技術は安全性試験される。何となれば、不完全な不活化が患者の死亡をもたらすかもしれないからである［Dorozynski及びAnderson，Science，Science252: 501-502 (1991)］。
このような弱毒化組換えワクシニア又は不活化組換えワクシニアは、生ワクシニアが投与される場合に合併症又は死亡が起きるような悪化した免疫系を患者が有し得る場合に使用されるべきである。
医薬組成物
接種又は非経口投与もしくは経口投与に適した本発明の医薬製剤は、細胞溶解産物、膜結合フラクション、部分精製形態又は精製形態の形態の少なくとも４〜約10,000、好ましくは４〜約1000、更に好ましくは約10〜約100 の異なる組換えウイルスを含むpolyenv 組換えウイルスワクチンを含む。polyenv ワクチンは組換えウイルスにより既に発現されたEPV タンパク質を更に含む細胞溶解産物（又はその膜結合フラクション）を含む組換えウイルスを含むことが好ましい。発現されたEPV の包含が一次抗体応答を増進することが今発見される。
polyenv ワクチン組成物は無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよく、又当業界で知られている助剤又は賦形剤を含むことができる。少なくとも約4-40〜10,000の異なるウイルスの夫々は本明細書に示されるように異なるEPV をコードし、発現する。EPV をコードするＤＮＡはエイズ患者の特定の単離された群落中に存在するEPV を提示するように選択し得る。
例えば、ワクチンはMemphis,TNからの配列を提示でき、Memphis,TN中の使用を標的とし得る。地理的に制限された領域に提示するように設計されたワクチンが又標的群落の外部の群落における使用に有益であり得る。
又、EPV をコードするＤＮＡは地理的に離れた群落、都市又は国、例えば、分岐群に提示するように選択し得る。例えば、多重クローンが一種のpolyenv ワクチン中に提示し得る。polyenv ワクチン組成物はウイルス感染に対する免疫応答を強化するイムノモジュレーター、例えば、サイトカインを更に含むことができる。例えば、Berkowら編集，The Merck Manual，第15編，Merck and Co.，Rahw-ay,NJ (1987);Goodmanら編集，Goodman and Gilman's The Pharma-cologicalBasis of Therapeutics,第８編，Pergamon Press,Inc.,Elmsford,NY (1990);Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacologyand Therapeutics,第３編，ADIS Press,LTD.,Willianls and Wilkins,Balti-more,MD (1987);及びKatzung 編集，Basic and Clinical Pharma-cology,第５編，Appleton and Lange，Norwalk，CT (1992)（これらの文献及びその中に引用された文献が技術水準を示す）を参照のこと。
当業者により理解されるように、本発明のpolyenv ワクチンが個体に提供される場合、それは塩、緩衝剤、アジュバント又は組成物の効力を改良するのに望ましいその他の物質の少なくとも一種を更に含み得る組成物中にあり得る。アジュバントは少なくとも一種の免疫応答を特異的に増強するのに使用し得る物質である。通常、アジュバント及び組成物は免疫系への提示の前に混合され、又は免疫される同じ部位に別々に提示される。アジュバントはそれらの組成に基いて幾つかのグループにおおまかに分けられる。これらのグループとして、油アジュバント、無機塩（例えば、AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、カオリン、及びカーボン）、ポリヌクレオチド（例えば、poly IC 核酸及びpoly AU 核酸）、及び或る種の天然物質（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクロシスからのワックスＤ、コリネバクテリウム・パルブム、又はボルデテラ・ペルツシス中に見られる物質、及びブルセラ属の貨）が挙げられる。アジュバントとして特に有益な物質の中に、サポニン (例えば、Quil A、Superfos A/S，Denmark)がある。ワクチン組成物中の使用に適した物質の例が、例えば、Osol,A.編集，Remington'sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.,Easton,PA (1980)，1324-1341頁に開示されている。
本発明のpolyenv ワクチン医薬組成物は少なくとも一種の抗ウイルス化学療法化合物を更に含むことができる。非限定例はγグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンゾイミダゾール、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン-16（IL-16; Kurth，Natu-re，1995年12月８日）、チオセミカルバルゾン、メシサゾン、リフアムピン、リブビリン、ピリミジン類縁体（例えば、AZT 及び／又は3TC)、プリン類縁体、フォスカーネット、ホスホノ酢酸、アサイクロバー、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼインヒビター（例えば、サキナバー(Hoffmann-La Roche); インジナバー(Merck); リトナバー(Abbott Labs);AG 1343(Agouron Pharmaceuticals);VX-2/78(Glaxo Wellcome)）、ケモキン、例えば、RANTES、MIP1α又はMIP1β[Science270: 1560-1561 (1995)］又はガンシクロバーからなる群の少なくとも一種から選択し得る。例えば、Richman: AIDs Res.Hum.Retroviruses 8: 1065-1071 (1992); Annu Rev Pharmacol Toxico 33: 149-164 (1993); Antimicrob A-gents Chemother 37: 1207-1213 (1993); AIDs Res.Hum.Retroviruses 10: 901(1994);以下のKatzung (1992)、及びその中の夫々798-800 頁及び680-681 頁に引用された文献を参照のこと。
医薬上の使用
polyenv ワクチン（又はそれが誘発する抗血清）の投与は“予防”目的又は“治療”目的、好ましくは予防目的のためであってもよい。予防上与えられる場合、生polyenv ワクチン組成物はHIV 感染症又はエイズ疾患の検出又は症候の前に与えられる。一種以上の化合物の予防投与はその後のHIV 感染症を阻止又は軽減するのに利用できる。
治療上与えられる場合、polyenv ワクチンは実際の感染の症候の検出後に与えられる。HIV 感染後の生polyenv ワクチンの投与は、生ウイルスの投与が実際のHIV 感染を軽減するのに利用できる必要投与量で与えられる場合に、患者の免疫系が不適当な合併症又は死亡の実質的なおそれがなく生polyenv ワクチンの投与に応答することができる場合にのみ与えられる。
又、患者の免疫応答が悪化される場合、治療投与は組換えウイルスが上記のように弱毒化又は不活化される場合に弱毒化又は不活化polyenv ワクチン組成物の使用を優先的に伴う。例えば、以下のBerkow (1987)、以下のGoodman (1990)、以下のAvery (1987)、及び以下のKatzung (1992)、Dorozynski及びAnderson,Science 252: 501-502 (1991)を参照のこと。
組成物は、その投与がレシピエント患者により寛容される場合に“薬理学上許される”と言われる。このような薬剤は、投与される量が生理学上有意である場合に“治療又は予防上有効な量”で投与されると言われる。本発明のワクチン又は組成物は、好ましくはHIV に対し体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を増進することにより、その存在がレシピエント患者の生理の検出可能な変化をもたらす場合に生理学上有意である。
与えられる“保護”は絶対である必要はなく、即ち、HIV 感染症又はエイズ疾患は、対照集団に対し統計上有意な改善があることを条件として、完全には阻止又は根絶される必要はない。保護はその疾患の症候の重度又は迅速な発症を軽減することに制限し得る。
医薬投与
本発明のワクチンはHIV の一種以上の株に対する耐性を与え得る。こうして、本発明は少なくとも一種のHIV 株による感染症を阻止又は軽減する方法に関するものであり、それを提供する。本明細書に使用されるワクチンは、個体へのその投与がその疾患の症候又は症状の完全又は部分軽減（即ち、抑制）、又はその疾患に対する個体の完全又は部分免疫をもたらす場合に疾患を阻止又は軽減すると言われる。
本発明の少なくとも一種のpolyenv ワクチンは、本明細書に記載された医薬組成物を使用して、意図される目的を達成するあらゆる手段により投与し得る。
例えば、このような組成物の投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路、又は頬経路によるものであり得る。皮下投与が好ましい。非経口投与は巨丸剤注射又は経時の徐々の注入によるものであり得る。例えば、以下のBerkow (1987)、以下のGoodman (1990)、以下のAvery (1987)、及び以下のKatzung (1992)を参照のこと。
活性な特異的細胞性免疫療法による細胞性免疫応答により軽減し得る疾患又は症状を阻止、抑制、又は治療するのに典型的なレジメは、単一治療として投与され、又は１週〜約24ケ月までの期間にわたって増進投与量もしくはブースター投与量として反復される有効量の上記ワクチン組成物の投与を含む。
本発明によれば、“有効量”のワクチン組成物は所望の生物学的効果、この場合にはHIV に対する細胞性免疫応答又は体液性免疫応答の少なくとも一つを得るのに充分であるものである。有効投与量はレシピエントの年齢、性別、健康、及び体重、同時治療の種類（存在する場合）、治療の頻度、及び所望される効果の性質に依存することが理解される。以下に示される有効投与量の範囲は本発明を限定することを目的とするものではなく、好ましい投与量範囲を表す。しかしながら、最も好ましい投与量は、無用の実験をしないで、当業者により理解され、決定し得るように、個々の被験者について適応されるであろう。例えば、以下のBerkow (1987)、以下のGoodman (1990)、以下のAvery (1987)、Ebadi，Pharma-cology,Lttle,Brown and Co.,Boston.MA (1985)、及び以下のKatzung (1992)を参照のこと。
一般に言えば、ヒト成人に関する投与量は投与量当たり約105-109 プラーク形成単位(pfu)/kg又はコロニー形成単位(CFU)/kgであり、106-108 が好ましい。どのような投与量が使用されようとも、それは本明細書に又記載されるような既知方法により測定して安全かつ有効な量であるべきである。
被験者
本発明のワクチンのレシピエントはHIV に対する細胞性免疫応答又は体液性免疫応答により特定の免疫を獲得し得るあらゆる哺乳類であってもよく、その細胞性応答はMHC クラスＩタンパク質又はクラスＩＩタンパク質により媒介される。
哺乳類の中で、好ましいレシピエントは霊長類目（ヒト、チンパンジー、類人猿及びサルを含む）の哺乳類である。最も好ましいレシピエントはヒトである。被験者はHIV で感染されることが好ましく、又はHIV 感染症のモデルを与える［例えば、Huら，Nature 328: 721-723 (1987)］。
今、本発明を一般に説明したので、本発明は以下の実施例を参考として更に容易に理解されるであろう。これらの実施例は説明のために示され、本発明の限定であることを目的とするものではない。
実施例
実施例１:HIV Env タンパク質発現のためのワクシニアウイルスベクターの調製
命名法
参照の目的のために、組換えワクシニアウイルス構築物をVVenv 構築物と又称し、特定のワクシニアウイルス構築物を患者、又は寄託所（例えば、ATCC又は構築物中のenv DNA のGenBank 源）に従って表示する。例えば、VVenv-Doe は患者Doe からのenv 配列を有するワクシニアウイルスベクター構築物を表し、VVenv-U28305はGenBank 受理番号U28305に見られるenv 配列を有するワクシニアウイルスベクターを表すであろう。
polyenv ワクチンは4-100 の異なる組換えワクシニアウイルスからなり、その夫々が特異なHIV-1 エンベロープタンパク質を発現する。参照の目的のために、夫々個々のウイルスをVVenv と表示し、最終ウイルス混合物をpolyenv と称する。
夫々のVVenv の調製はpVenv4と称されるプラスミド及び以下に記載されるNYCDHと称される野生型ワクシニアウイルスを使用する。更なる詳細について、Ryanら，“Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Express-ion and Immunization",Immunology Methods Manual,Lefkovits 編集，Acade-mic Press (1996)を参照のこと。
ベクター及び宿主細胞。既に記載されたpSC11 ベクター［Chakrabarti,S.ら，Mol.Cell.Biol．5:3403-3409 (1985)］をVVゲノムへの多種HIV 遺伝子の組換えに使用することができる。pSC11 プラスミドの要素はlacZ遺伝子（形質転換されたバクテリア及びVV組換え体がβ−ガラクトシダーゼ活性を有するものとして容易に同定し得るリポーター遺伝子）、チミジンキナーゼ(TK)をコードする遺伝子の一部、及びアンピシリン耐性遺伝子(amp) を含む。
pSC11 にクローン化された遺伝子を野生型ウイルスのTK遺伝子とpSC11 中に含まれるTK遺伝子の部分の間の相同的組換えによりVVゲノムに挿入する。ウイルスTK遺伝子座へのプラスミドＤＮＡの挿入はウイルス遺伝子を不活化し、その結果、組換えウイルスをブロモデオキシウリジン(BUdR)中の増殖によりTK+ウイルスのバックグラウンドから容易に選択することができる。組換えTK- ウイルスがこの選択に耐えるために、それらは活性TK酵素を供給しない細胞、例えば、TK- 143 細胞系（これはヒト細胞系R970-5のTK欠損誘導体である）、VV［以下のWeirら，(1982)］の増殖を支持する骨肉腫細胞系(Rhim,J.S.ら，Int.J.Cancer 15:23-29（1975）］中で増殖される必要がある。HIV 遺伝子セグメント発現の生産はpSC11 ベクターのSmal部位への完全遺伝子挿入によるものであり得る。完全長遺伝子はP7.5K プロモーターの制御下で発現し得る。
完全HIV 遺伝子のクローニングの別法として、pSC11 に既にクローン化されたHIV 遺伝子を部分遺伝子配列に置換することができる。例えば、pVenv1と称される構築物をpSC11 から調製し、これはBH10 HIVエンベロープタンパク質(env) 遺伝子［以下のHa1lenbergerら，(1993); Kilpatrickら，J.Bio1.Chem.262: 116-121 (1987)］を発現する。その構築物を親ベクターとして使用して現場HIV 分離株からの可変エンベロープタンパク質領域を置換し、発現することができる。同様に、pVenv4と称されるベクターをpSC11 から構築してBH10 envタンパク質を発現し、オリゴマー化ドメイン［以下のHallenbergerら，(1993)］を保持しながらトランスメンブランドメイン及び細胞質テイルドメインをコードするgp41配列を排除するためにトランケートした。当業者により理解し得るように、“オリゴマー化ドメイン”という用語はenv タンパク質のオリゴマー化を可能にするgp41の部分を表すのに機能上使用され、即ち、オリゴマー化に充分な構造がある。pVenv4ベクターはHIV 感染細胞の細胞表面に存在するようなプロセシングされたgp41/gp120オリゴマー（二量体、三量体又は四量体）の構造に似ている三次構造を形成することが発見されたトランケートgp160(又、gp160t、gp140)をコードする。
この三次構造は分泌形態及び膜関連形態の両方中で維持される[Hallenbergerら，(1993)] 。このベクターは別の単離されたenv 配列の置換のための親ベクターとして使用されることが好ましい。
この実施例において、VVenv 構築物の調製は、以下に詳しく記載されるようにpVenv4及び野生型ワクシニアウイルスNYCDH、並びに適当な宿主細胞の使用を伴う。
pVenv4: pVenv4ベクターをpSC11 ワクシニアウイルス組換えベクター［Ha1-lenberger ら,Virology 193:510-514 (1993);Chakrabarti ら,Mol.Cell Bi-ology5: 3403-3409 (1985)］へのHIV-1 エンベロープをコードする配列の挿入により前もって調製した。HIV-1 配列は生ウイルスの研究所の株から誘導した。その配列は“BH10”と称された［Ratnerら，Nature 313: 277-284 (1985)］。PCR 技術により、HIV-1 感染患者からの特異なエンベロープ配列は増幅され、BH10 env配列に置換されて新しいベクターをつくり得る。例えば、下記のプライマーがPCR に使用し得る。
Figure 2007259870
これらのプライマーは5 から3 に記載される。制限部位は下線を施される（ナンバリングされた位置はBH10配列［Ratnerら，Nature 313: 277-284 (1985)］に基く）。
PCR戦略
新規HIV-1 env構築物を生産するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して40の異なるHIV-1 患者サンプルからのエンベロープ遺伝子の1800塩基対(bp)を増幅する。PCR プライマーは良く保存されたHIV-1 配列に相当し、こうして多くの異なるHIV-1 患者サンプルからのenv 遺伝子を成功裏に増幅した。
増幅されたＤＮＡはタンパク質のアミノ末端の約10の高度に保存されたアミノ酸を除いて完全gp120 タンパク質を含む。全てのエンベロープ可変領域(V1-V5) がPCR 産物に含まれる。加えて、増幅された配列はgp120/gp41について開裂部位を越えて約100 アミノ酸をコードする。
KpnI及びBsmIに関する制限酵素部位（これらはpVenv4中のBH10エンベロープ遺伝子配列に隣接する）を有するPCR プライマーを増幅されたＤＮＡ産物にとり込む。

第一ラウンドPCR: 500μｌのミクロ遠心分離管中で、
− １μｌのプライマーＡ（配列番号１）、300ng/μｌ、
− １μｌのプライマーＢ（配列番号２）、300ng/μｌ、
− 2.5μｌの夫々10mMの４種のdNTP、
− １μｇのＤＮＡ、
− 10μｌの10X PCR緩衝液、及び
− HPLC H2O 99μl まで
を混合する。
taq 株を攪拌し、１μｌをPCR 反応に分配する。良く混合する。鉱油でオーバーレイする。
熱サイクラーで以下のように実験する。
− 95℃で３分間インキュベートしてＤＮＡを融解する。
− 95℃で１分間；45℃で２分間；72℃で3.5分間の40サイクルを実験する。
第二ラウンドPCR
プライマーＣ及びＤ（夫々、配列番号３及び４）を用い、ＤＮＡを使用しない以外は上記のようにしてPCR 反応を調製する。最終溶液を95μｌにする。鉱油でオーバーレイする。栓付きのチップで、第一PCR 反応から５μｌを除去する（油の下から）。サンプルを油層の下の第二反応液に混合し、前記のようにサイクルを開始する。30サイクルが通常適当である。透明バンドが約1800bpと同定されるまで夫々10サイクル後にゲル分析のために２μｌを除去することにより、生産物を監視することが望ましい。
公知の置換クローニング技術を使用することにより、BH10エンベロープ配列に代えて、40の患者の１人からのenv 配列を発現するpVenv4誘導体を生成した。簡単に言えば、pVenv4プラスミド及びPCR 産物を次にKpnI及びBsmIで切断し、切断されたpVenv4をアガロースゲルで実験し、大きいフラグメントを単離する。BH10env の小さいフラグメント(1800 bpフラグメント) を捨てた。又、切断されたPCR 産物を単離し、大きいpVenv4フラグメントにつないで患者ＤＮＡからの変異体env の1800 bp を今含むキメラエンベロープ配列をつくつた。PCR 産物及びpVenv 産物の結合後に、バクテリア宿主細胞を、例えば、エレクトロポレーションを含む当業界で公知の幾つかの方法のいずれかによりその結合混合物で形質転換し、組換えコロニーを採取し、配列決定により試験する。
プラスミドpVenv4又はpVenv4でつくられた組換え体は野生型ウイルスのチミジンキナーゼ(Tk)遺伝子とプラスミド内のTk配列の間の相同的組換えによるワクシニアウイルスゲノムへの遺伝子の挿入を促進する。ウイルスTk遺伝子座へのpVenv4DNA の挿入はP7.5K初期／後期プロモーターの制御下で発現されたHIV-1エンベロープ遺伝子を有するワクシニアウイルスを生じる。このウイルスはTk遺伝子座の分断のために増殖活性が弱められる。pVenv4の付加的な要素はβ−ガラクトシダーゼ活性をコードするlacZ遺伝子である。lacZ活性はワクシニアウイルス組換え体を選択するのに使用し得る（以下を参照のこと）。
pVenv4により発現されたエンベロープ遺伝子をトランケートしてトランスメンブラン／Ｃ末端gp41配列を排除する。そのベクターは細胞内に見られ、また分泌形態中に見られるオリゴマー構造として発現される。
ワクシニアウイルス-NYCDH
夫々の新規置換プラスミドを野生型ワクシニアウイルスNYCDH で個々に組換える。このウイルスをA.T.C.C.（受理番号VR-325）から得、使用前にプラーク精製した(Buck,C.及びPau1ino,M.S.編集，American TypeCulture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera，Chlamydiae and Rickettsiae,第６編，American Type Culture Collection,Rockville,MD(1990)，138頁) 。
バクテリア宿主細胞
プラスミドは当業界で知られているようなあらゆる好適な宿主で増殖し得る［例えば、以下のAusubel (1995 rev)，§§6.15-16.19を参照のこと］。非限定例はDH5 α細胞である。
TK欠損細胞
形質転換及びワクシニアウイルス置換をヒトTk- 143B細胞系（これはVV［以下のWeirら(1982)］の増殖を支持する骨肉腫細胞系［以下のRhimら(1975)］であるヒト細胞系R970-5のTK欠損誘導体である）について行う。特異なHIV env遺伝子配列を含む夫々のワクシニアウイルス組換え体をlacZ遺伝子の発現に基いて選択する（ウイルスプラークをBluo-galでオーバーレイし、青色の発生により判断してβ−ガラクトシダーゼ活性について選択する）。PCRの二つのラウンドを行い得る。
実施例２：
Po1yenvワクチンの調製
Vero細胞
最終製造工程はn VVenv構築物をA.T.C.C.から新たに購入したVero細胞 (受理番号CCL81 又はX38)で増殖させ、クローン化し、ウイルス増殖のために膨張させることである。Vero細胞系はワクチン開発に関するWorld Health0r-ganization により認可されていた［Hay,R.ら編集，American Type Culture Col-lection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,第７編，American Type C-ulture Collection,Rockville,MD (1992),48頁］。
Vero細胞をダルベッコ改良イーグル培地(Bio-Whittaker)、グルタミン補給物(Bio-Whittaker) 及び熱不活化ウシ胎児血清(Hyclone，Inc.) で増殖させる。又、無血清培地を使用することができる。夫々のVVenv 構築物をVero細胞の別々の集密層に接種し、細胞がウイルス感染のために細胞変性効果を示す時に回収する。細胞抽出物を回収後かつ凍結前にPBS(Bio-Whittaker) で徹底的に洗浄する。
次いで細胞を凍結−解凍、音波処理又は遠心分離機中の低速の遠心分離（任意）により破壊する。次いで上澄みのアリコートを-70℃で貯蔵する。たとえ、VVが弱毒化され、例えば、調製物が60℃で１時間加熱されるとしても、エンベロープタンパク質は哺乳類モデル中でHIV エンベロープタンパク質特異性抗体(ELISAにより検出可能) を誘発するのに充分な濃度で溶解産物中に存在する。
ワクチン生産物
Vero細胞からの夫々のウイルス(VVenv構築物) 株を個々に凍結し、続いて力価測定し、安全性を試験する。試験が完結した後、夫々のウイルスのアリコートを混合して合計108 pfu/ml（“pfu"はプラーク形成単位を表す）の同種菌ワクチンを得る。40のVVenv 構築物が利用される場合、夫々のVVenv は同等に提供されることが好ましく、夫々のVVenv はワクチン生産物中2.5ｘ106pfu/mlの力価で使用される。これは合計1 ｘ 108 pfu を生じるべきである。
Polyenv ワクチンの評価
マウス
マウスを1 x 107 pfuのenv を発現するVVの腹腔内注射で感染することができる。抗体をVV注射の３週間後に上記HIV ELISA 又は中和アッセイにより同定することができる。
ヒト用のpolyenv ワクチンの製造の前に、ウイルスの同様のグループをマウス中のワクチン試験の目的で調製した。これらのウイルスを腹腔内経路又は皮下経路によりマウスに投与した。次いで本発明者らは血清HIV-1 特異性抗体を試験し、血清を酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA) で活性について試験した。そのアッセイはELISA プレート上の全体の分断HIV-1（HTLV IIIB）の塗布及びウシ血清アルブミンによるプレートのブロッキングを伴った。次いで血清サンプルを食塩加リン酸緩衝液中の1:100、1:1,000及び1:10,000の希釈で添加した。アッセイをアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体及びｐ−ニトロフェニルホスフェートで発色させた。その着色反応を水酸化ナトリウム溶液で停止し、光学密度の読みを405nm でELISAプレートリーダーで読み取った。
図２に示されるように、106-107pfuのワクチンウイルスの細胞溶解産物製剤（単一HIV-1/エンベロープタンパク質をコードする配列及び膜結合発現エンベロープタンパク質を含む）による単一接種は６ケ月の実験時間経過中持続されたHIV-1に対する強い抗体応答を誘発した。このような抗体応答はその他の免疫化で既に報告された応答よりもかなり高かった。この高い抗体応答はワクチン製剤中の膜結合エンベロープタンパク質の存在に起因し得る。図３に示されるように、これらの応答は投与量依存性であった。低い応答が107pfuの投与量を与えられた哺乳類よりも106pfuの投与量を与えられた哺乳類で見られた。
又、異なるHIV-1エンベロープタンパク質を発現するワクシニアウイルスの混合物を調製した。マウスが５種のウイルスの混合物107pfuを受けた場合、それらの応答は単一ワクシニアウイルス組換え体107pfuに対して生じた応答と大きさが実質的に同じであった（図４）。多数のenv を発現するワクシニアウイルスの多数の混合物は報告されておらず、中和抗体の広いスペクトルを与えるものと予想される。
ヒト
混合ウイルス株の試験を臨床試験の前に行い、その最初の試験は投与量上昇及び安全性試験の目的のためであろう。
臨床試験は四つのボランティアグループの集合を伴う投与量上昇研究であろう。夫々のグループは下記のワクチン投与量の一つを受ける。
(１)２ｘ104pfu
(２)２ｘ105pfu
(３)２ｘ106pfu
(４)２ｘ107pfu
夫々のボランティアは皮下注射により投与された食塩水0.5ml中の混合ウイルスワクチンを受ける。
実施例３
チンパンジー中の多エンベロープワクシニアウイルスをベースとするHIV-1 ワクチンによる一次分離株中和免疫の誘発
HIV-1 分離株の集団をエンベロープタンパク質の複雑なアレイで武装化する。
env タンパク質は唯一のウイルスによりコードされた外部タンパク質及び中和抗体活性の標的であり、一つの分離株に対し誘発された抗体は必ずしも別の分離株を中和するとは限らないであろう。この理由のために、本発明者らはHIV-1 ワクチンカクテル、即ち、多数のEnv タンパク質を発現するPolyEnv を調製した。ワクチン生産は30の異なるVV組換え体の調製で開始し、夫々が異なるEnv タンパク質を発現した。次いでVVenv をチンパンジーモデルで個々に、又組み合わせて(PolyEnv)試験した。４匹のチンパンジーを単一VVenv(チンパンジー１及び２) 又はPolyEnv(チンパンジー３及び４) の３回の注射で皮下で免疫し、続いてミョウバン中の組換えgp120/gp41タンパク質で１回筋肉内注射した。安全性を全ての４匹の動物で実証し、そのうちの２匹のみが注射部位で潰瘍の兆候を示した。血清サンプルをHIV 結合及び中和について多数の試験により監視した。チンパンジー３及び４の抗体は抗体活性の最高の性質を示した。中和機能をHIV-1 の研究所分離株及び一次分離株の両方に対し実証し、そのいずれもがワクチン中で特異的に提示されなかった。こうして、混合env タンパク質によるリンパ球の初回感作は、高品質の抗体が異なるHIV-1 に対し誘発し得る有望な方法を与える。
物質及び方法
VV組換えベクターであるpVenv4。pVenv4をBH10-env配列への終止コドンの導入、及びpSC11への修飾BH10エンベロープ遺伝子(env) の挿入により前もって調製した。pVenv4はアミノ酸640 でトランケートされ、分泌及びオリゴマー化の両方が可能であるEnv タンパク質産物を発現した。このトランケートBH10Env タンパク質を発現する組換えVV、Vvenv4の生産が既に記載されていた［Hallenbergerら，Virology193: 510-514 (1993)］。
HIV-1 感染個体からのenv 配列の増幅のためのPCR 。PCR を使用してHIV env配列を増幅した。一般に、サンプルはHIV の最初の診断で採取されたHIV-1 感染個体の血液に由来した。その他のサンプルはエイズの臨床的症候を有する個体、又はエイズ研究及び基準試薬集積所により提供された製品からのものであった。
血液サンプルについて、ＤＮＡをSDS をベースとする細胞溶解緩衝液への血液又は感染細胞の滴下添加及び65℃で30分間のインキュベーションにより最初に調製した。プロナーゼを0.5mg/mlの濃度で添加し、溶解産物を45℃で一夜インキュベートした。２回のフェノール抽出を行い、続いてエタノールで沈殿させ、水中でＤＮＡを再度懸濁させた。
通常の方法により全てのＤＮＡサンプルを用いてPCRの二つのラウンドを行った。プライマー配列を公表されたBH10配列［Ratnerら，Nature 313: 277-284(1985)］に基いて選択した。全ての可変領域及びgp41の一部からの配列を含むフラグメントを得るために、実施例１に記載されたPCR プライマーを使用した。続いてPCR 産物を、通常の方法を使用してpVenv4ベクターへの置換によりクローン化した。配列決定をサンガー方法及びプライマーccatgtgtaaaattaaccccactctgtg（配列番号５）の使用により新規プラスミドについて行った。
VVenv の調製
新規VV組換え体(VVenv) を新たに置換された組換えプラスミド（上記を参照のこと）によるVV (NYCDH,ATCC)感染細胞のトランスフェクションにより調製した。トランスフェクタム(Promega) 及びリポフェクタミン(Gibco,BRL)を製造業者の推奨に従って使用してトランスフェクションを促進した。次いでVVをプラーク精製した。
免疫化
VVenv感染細胞溶解産物を皮下注射でチンパンジーに投与した。VVenvを単独で、又は組み合わせて使用した。VVの合計量(pfuによる) は動物当たり夫々の注射で同様であった（約107pfu）。筋肉内注射はイノキュラム当たり約40マイクログラムのgp120 (カタログ番号12101、Intracel，Cambridge，MA)、20マイクログラムのgp41（カタログ番号036001、Intracel）及び500マイクログラムのミョウバン(Rehsorptar 水酸化アルミニウム吸着ゲル，Intergen Co.，Purch-ase，N.Y.）の混合物によるものであった。
ELISA
５種のELISAを以下のようにして行った。ELISA #1アボット臨床ELISAをアボット・ラボラトリーズから購入し、製造業者(HIVABHIV-1/HIV-2 (rDNA)EIA，アボット・ラボラトリーズ，Abbott Park，I.L.)により推奨されるように行った。ELISA #2:組換え体Mn-gp160(Quality Biological，Inc．Gaithersburg,MD) を１マイクログラム／mlで塗布することにより、ELISAを行った。プレートをブロックし、血清の３倍連続希釈液を用いて試験を行った。次いでプレートを洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ結合抗ヒトIgG でスコアーを付けた。ELISA3: ELISAプレートを１マイクログラム／mlのLAI-gp120（CHO由来タンパク質、Intracel）で被覆した。血清サンプルを1:100 希釈後に塗布し、アルカリ性ホスファターゼ結合抗ヒトIgG(マウス抗ヒトIgG1-AP 、カタログ番号9050-04、Sou-thern Biological Assciates,Inc.,Birmingham,A.L.) 及びｐ−ニトロフェニルホスフェートでスコアーを付けた。O.D.読みを405nm で読み取った。ELISA #4:プレートを１マイクログラム／mlのIIIB-gp120 (バキュロウイルス由来タンパク質、Intracel、カタログ番号12001、Cambridge，MA)で被覆した以外はアッセイ#3と同様にして、ELISAを行った。ELISA #5:プレートを１マイクログラム／mlのIIIBウイルス溶解産物(Organon Teknika Co.，Durham，N.Y.) で被覆した以外はアッセイ#3と同様にして、ELISA を行った。
中和アッセイ
中和アッセイを研究所分離株又は一次分離株［Montefioriら，J.Clin.Microbiol.26:231-237(1988);Montefioriら，Journal of Infectiousdiseases 173:60-67 (1996)］を用いて行った。研究所分離株:ウイルスを夫々の血清サンプルの1:20希釈液と混合し、MT-2細胞又はCEM-x174細胞に塗布した。ニュートラルレッド染色を使用して細胞の生存度を分析した。対照培養物と比較して細胞死滅の35-40％減少を正の偏向と定義した。一次分離株:ウイルスを夫々の血清サンプルの1:4希釈液と混合し、PHA 刺激PBMCに塗布した。アッセイをp24 についてスコアーを付けた。対照培養物と比較して少なくとも75％の感染性の減少を正のスコアーに必要とした。
結果
新規VVenv 組換えワクシニアウイルスの調製
夫々が特異なHIV-1 Env タンパク質を発現する新規VV組換え体(VVenv) を調製するために、ＤＮＡを最初にHIV-１サンプルから単離した。殆どのＤＮＡは疾患の不利な症候を示さず、おそらくHIV-1 感染症の最初の診断時である個体の血液からのものであった。追加のＤＮＡはエイズ患者又はエイズResearch and Reference Reagent Repository により提供されたウイルスからのものであった。KpnI制限部位及びBsmI制限部位を含むプライマー対を用いてPCR を行った。次いでフラグメントをKpnI制限部位及びBsmI制限部位で図５に描かれたpVenv4ベクターに置換した(pVenv4は初期にトランケートHIV-1 タンパク質、BH10を発現した) 。このようにして、BH10からのgp120（V1-V5）配列及びgp41配列をPCR 産物中で夫々の配列により置換した。夫々の置換プラスミドを用いて、新規VV組換えウイルス(VVenv) を調製した。
この方法は、多様なEnv 配列が特異なVV組換え体(VVenv) にとり込まれる簡単な手段を与えた。重要なことに、配列の大半は生産性であり、プロウイルスゲノム（殆どのPCR 産物が誘導される）中のEnv 配列がめったに欠損ではないことを示唆した。大きな多様性がワクチン混合物中に使用されるVVenv 中に存在する。
単一又は混合VVenv によるチンパンジーの免疫化。４匹のチンパンジーを単一VV組換えワクチン及び混合VV組換えワクチンの試験に使用した。免疫化のスケジュールを表２に示す。最初の３回の注射はVVを含み、一方、最後の注射は筋肉内に投与されたgp120、gp41及びミョウバンの組み合わせを含んでいた。チンパンジー１及び２は最初の３回の注射の夫々で投与された唯一のワクシニアウイルス及び夫々のエンベロープタンパク質を受けた。チンパンジー３及び４は10の組換えVVの混合物 (及び最初の注射の夫々のEnv)、２回目の注射で10の追加のEnv 、及び最後の免疫化で10の追加の特異なEnvを受け、タンパク質ブーストの前に合計30の異なるベクターを生じた。全てのチンパンジーはプラーク形成単位で同様の量の合計ワクシニアウイルス及び同様の量の合計組換えタンパク質を受けた。
表２ 混合VV組換え体によるチンパンジーの免疫化スケジュール
日付 注射
チンパンジー１及び２ 1/9/96 VV(Env #1)
4/16/96 VV(Env #1)
6/11/96 VV(Env #1)
7/30/96 組換えgp120 及び
組換えgp41＋ミョウバン

チンパンジー３及び４ 1/9/96 VV(Env #1-10)
4/16/96 VV(Env #11-20)
6/11/96 VV(Env #21-30)
7/30/96 組換えgp120 及び
組換えgp41＋ミョウバン
組換えVVenv は病変を出現しないで投与し得る。全ての４匹のチンパンジーを注射の部位で全身性疾患の兆候及び病変形成について監視した。動物を毎日基準で下痢、鼻漏、咳、くしやみ、迅速な呼吸、傾眠、制限された運動及び食欲の欠如について分析した。これらの兆候のいずれもがいかなる時点でもいずれの動物でも明らかではなかった。最初のVV免疫化後に規則的な間隔で注射部位で撮影された写真は全ての４匹の動物に明らかな隆起を示した。軽度の病変が天然痘ワクチン注射を代表するチンパンジー１及び３の注射部位で現れ、一方、病変はチンパンジー２及び４で明らかではなかった。症候、隆起又は病変がいずれの動物でも２回目、３回目又は４回目の注射で明らかではなく、VV特異性免疫が最初の接種により誘発されたことを実証した。
VVenvの注射、続いてタンパク質ブースター免疫化がELISA 陽性抗体を生じた。HIV特異性抗体を５種の異なるELISA による免疫化スキーム中に監視した。ELISAを使用して夫々の動物中の抗体の絶対量ではなく相対品質を測定した。殆どの場合、試験は天然Env の典型的な三次元かつオリゴマー構造を欠いているウイルスフラグメントによるものであった。これらの場合、ELISA はHIV 特異性抗体のサブセットのみを結合すると予想されるであろう。アボットELISA で得られた結果を図６に示す。チンパンジー３は最初のVV免疫化後に陽性に関するカットオフを越え、一方、チンパンジー４は２回目のVVenv 免疫化後にカットオフを越えた。
免疫化スキームの終了時のチンパンジー３及び４の応答はチンパンジー１及び２の応答をはるかに越えた。MN gp160を用いるELISA #2において、チンパンジー３は唯一高い応答動物であった。この応答はタンパク質ブーストの前に起こり、ブースター注射により混乱されなかった。精製タンパク質ブーストに使用した抗原と同じ抗原を使用してELISA (ELISA #3)プレートに結合されたCHO-LAI に対する応答はチンパンジー3のみが強く応答したことを示した。結合されたIIIB-gp120プレートを用いるELISA #4において、チンパンジー２が高いバックグラウンドを示し、おそらく高いバックグラウンドのために、全ての動物の最高の応答値を示した。第五ELISA、オルガノン・テクニカIIIBウイルス溶解産物に対する応答は全ての４匹の動物からの血清で陽性であった。
一次分離株及び研究所分離株に対する中和応答。中和アッセイを研究所分離株及び一次分離株に対する夫々の動物からの血清を用いて行った。最初のアッセイをＴ細胞系で行い、一方、最後のアッセイをsero- 陰性PHA 刺激PBMC で行った。全ての場合、分離株はHIV-1 ワクチン中に提示されたものにマッチしなかった。
表３に示されるように、チンパンジー２、チンパンジー３及びチンパンジー４からのサンブルはＴ細胞中で朋研究所分離株に対し正の偏向（ウイルス増殖の35-40％抑制）を生じた。２種のその他の研究所分離株（一つはIIIB［Lockeyら，Aids Res Hum Retroviruses 12: 1297-1299 (1996)であり、一つはSF2 株である）を用いるアッセイはいずれのサンプルでも正にスコアーしなかった。PHA 剌激PBMCで試験した４種の一次分離株による中和アッセイ［Montefioriら，1988，上記文献; Montefioriら，1996，上記文献］の結果を示す。ウイルスはこれらのアッセイで中和し難いと考えられる。何となれば、患者血清は、たとえ1:2 希釈液が使用される時でさえも、陰性結果をしばしば生じるからである［Fenyo ら，AIDS 10: S97-S106 (1996); Moore及びHo,AIDS 9: S117-S136 (1995); Monte-fiori ら，1996，上記文献］。重要なことに、チンパンジー４血清の1:4希釈液は試験一次分離株の一つを中和することができた。状況はEnv ワクチンによるその他の体験とは異なり、殆どの先の場合のように、Env免疫個体からの血清は一次分離株中和アツセイで陰性結果を生じた［Steele，Journal of NIH research6: 40-42 (1994);Moore,Nature 376:115 (1995)］。
表３
ワクチン中に特異的に提示されなかったウイルスのチンパンジー抗血清による中和
Figure 2007259870
混合VVenv は単一VVenv よりもHIV-1 特異性抗体の高い品質を誘発する。ELISAアッセイ及び中和アッセイの結果を、血清が上記７つの試験で高い応答を生じたチンパンジーをリストする表４に要約する。その表から注目し得るように、チンパンジー３及び４は７つの試験のうちの５つの複合物で陽性をスコアーし、一方、チンパンジー１及び２は７つのうちの３つのみで陽性をスコアーした。この結果は単一Env ワクチンと比較してPoly Envにより誘発された抗体の高品質を反映し得る。








表４
ELISA アッセイ及び中和アッセイの要約
単一VVを投与されたチンパ 混合VVを投与されたチンパ
アッセイ ンジー中の高い応答 ンジー中の高い応答
アボット(IIIB- チンパンジー３及び
gp41)-ELISA #1 チンパンジー４
MNgp160BAC
ELISA #2 チンパンジー３
IIIB-gp120-BAC
-ELISA #3 チンパンジー２
LAI-gp120-CHO-
ELISA #4 チンパンジー３
IIIbウイルス チンパンジー１及び チンパンジー３及び
溶解産物ELISA #5 チンパンジー２ チンパンジー４
Lab分離株−中和
（偏向） チンパンジー２ チンパンジー３及び４
一次分離株−中和 チンパンジー４
検討
この実施例に記載された実験を、ワクシニアウイルスをベースとするHIV-1 ワクチンの安全性を試験し、エンベロープカクテル及び単一エンベロープワクチンによる初回感作の効力を比較するように設計した。結果は、ワクシニアウイルスが開いた病変を誘発しないで免疫原として使用し得ることを最初に実証し、HIV-1 特異性活性の大きな幅がエンベロープカクテルで誘発し得ることを第二に実証した。
チンパンジーモデルは本発明者らに霊長類におけるPoly Envの安全性を調べさせた。本発明者らは開いた病変形成の程度を測定することに特に関心があった。
何となれば、VV接種は未免疫個体への生ウイルス移入の脅威をもたらし得るからである。HIV の場合、これは、エイズ患者がVV感染を阻止することができないかもしれないという点で重大な関心事である。この関心事に取り組むために、本発明者らは、開いた病変が回避し得るか否かに疑問をもってチンパンジー中の皮下ワクチン注射の使用を試験した。実際に、４匹のチンパンジー中の２匹のみが開いた病変病変を示した。NYCDH ワクシニアウイルス株の皮下接種を天然痘ワクチン[Connorら,Journal of Infectious diseases 135:167-175(1977);Benensonら，Journal of Infectious diseases 135: 135-144 (1977)］の臨床試験に使用した時に、同様の結果が観察された。
おそらく、注射操作に更に注意し、注射部位のフォローアップ看護により、開いた病変が全ての場合に回避し得る。これらの結果は、安全性問題がHIV-1 ワクチンベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を排除する必要がないことを実証する。
エンベロープカクテルをマウス実験（実施例２）及びウサギ実験で試験した。
マウス実験において、抗HIV 抗体をVVenv の単一注射後に監視し、一方、ウサギでは、VVenv を使用してＤＮＡをベースとして誘発された応答をブーストした。
実験は、HIV-1特異性抗体がVVenv で誘発又はブーストし得ることを示し、又、一次分離株が抗体応答により中和し得ることを示した。混合VVenv（PolyEnv）のポテンシャルを調べるために、チンパンジーを二つのグループに分けた。最初の２匹のチンパンジーは唯一のVVenv を受け、一方、チンパンジー３及び４は合計30の異なるVVenv を含むカクテルを受けた。
ワクシニアウイルス免疫化を受けた後に、全ての４匹のチンパンジーにミョウバン中単一gp120/gp41タンパク質混合物によるブースターを投与した。４匹のチンパンジーの夫々からの血清を５種の異なるELISA で試験し、夫々がEnv の異なるフラグメント及び／又は立体配置を使用した。重要なことに、複合物としてのチンパンジー１及び２はこれらのELISAの一つのみで強く応答し、一方、複合物としてのチンパンジー３及び４からの血清は４種のこのようなアッセイで強く応答した。夫々のアッセイが夫々の動物中のHIV-1特異性抗体のフラクションのみを測定したように、結果はおそらく混合ワクチンにより誘発された抗体結合活性の優れた幅を反映した。
又、中和アッセイを研究所分離株及び一次分離株の両方に対して行った。重要なことに、たとえ一次分離株がワクチン混合物中で特異的に提示されなかったとしても、一次分離株に対する陽性応答がチンパンジー４で観察された。再度、これらの結果はPolyEnv ワクチンカクテルにより誘発された抗体の大きな幅を実証した。ワクチンの抗体複雑度の増大はリンパ球及び夫々の抗体応答の増大された多様性をもたらすものと予想されるかもしれない。
中和抗体がワクチン中で提示されない一次分離株に対し誘発し得るという実証は、線形の異なるタンパク質が立体配座構造を共有することを実証する。又、この概念は、多数の相互に排他的なウイルスに露出される二つの個体が、交差露出が起きる時に重感染から一般に保護される点でHIV-1感染患者の免疫応答により実証される。PolyEnv の使用はHIV-1 患者の状況を模擬するチンパンジー系における最初の試みに相当する。即ち、中和抗体は単一Envタンパク質ではなくEnvタンパク質の大きなアレイで誘発される。
要約すると、本発明者らはチンパンジーモデルでPolyEnv と称されるVVをベースとするHIV-1 ワクチンカクテルを試験した。この実施例は
1)VVが開いた皮膚病変を誘発しないでワクチンとして使用でき、
2)HIV-1 特異性抗体活性の大きな幅がこのワクチンで誘発でき、かつ
3)Env 構築物のカクテル(PolyEnv) が単一Env構築物と比較してHIV-1 特異性抗体の優れた品質を生じる
ことを実証した。
ワクシニアウイルスは野生型形態及び組換え形態の両方で強力なワクチンであることが長年にわたって知られていた。VVの強さは免疫応答のＢリンパ球区画及び細胞毒性Ｔリンパ球区画の両方を漸増するその力にある。VVはヒト集団からの疾患（天然痘）を根絶することができるワクチンのみを含んでいた。この実施例中のデータは、組換えVVベクターがHIV-1 の将来の防除に寄与することを示す。
実施例４:二機能性プラスミドの調製
ＤＮＡワクチンは幾つかの異なる系（インフルエンザ、HIV-1 等）中で強力な抗体及びCTL 応答を誘発することが示されていた。ＤＮＡをベースとするインフルエンザワクチン及びHIV-1 ワクチンは既に健康な成人ボランティアによる臨床試験中である。又、ワクシニアウイルスはワクチン注射プログラムに関する強力な基礎として利用することができる。実際に、ワクシニアウイルスはヒト集団からの疾患（天然痘）を根絶することができる唯一のワクチンであった。多数の組換えワクシニアウイルスが動物研究で実証されるように保護免疫応答を誘発した。先に示されたデータはpolyenv ワクチン、及びワクチン注射戦略、例えば、ＤＮＡワクチン及びウイルスワクチンを組み合わせることの有効性を実証する。
ＤＮＡワクチン及びVV組換えベクターの両方として作用することができる二機能性プラスミドを構築する。図７はこのプラスミドの地図を示し、これは哺乳類細胞中の発現のためのCMV プロモーター、並びに組換えワクシニアの調製のためのワクシニア初期プロモーター及び後期プロモーターを含む。精製プラスミドＤＮＡの直接注射は試験被験者中でHIV env タンパク質に対し免疫応答を誘発するのに使用されるであろう。又、プラスミドはHIV env タンパク質免疫化ビヒクルとして生組換えワクシニアウイルスを調製し、試験するのに使用されるであろう。
被験者は、単一注射もしくは多重注射及び／又は付加的なワクチンビヒクルと組み合わせて、あらゆる順序で投与される、一種以上のＤＮＡワクチン注射及び一種以上の組換えワクシニアウイルス免疫化の両方を含む多段階レジメで潜在的にワクチン注射し得る。
本発明は本明細書に記載された特別な実施態様により範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載されたものの他に本発明の種々の改良が以上の説明及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような改良は請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。核酸又はポリペプチドについて示された、全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子質量値がおおよそであり、説明のために示されることが更に理解されるべきである。
種々の刊行物が本明細書に引用され、その開示が参考としてそのまま含まれる。



































Figure 2007259870

Figure 2007259870

Figure 2007259870
ワクシニアウイルスゲノム中のHIV-1 遺伝子の配向の略図。HIV-1 エンベロープ遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子座の右セグメント及び左セグメントの間に位置される。HindIII 部位がHIV-1 エンベロープ遺伝子のＣ末端に存在する。適当な挿入がサイズ約7 kbのHindIII フラグメントを生じる。このパターンを含むサザンブロットがHIV-1 エンベロープ遺伝子の位置及び正確な配向を確認した。 HIV 特異性抗体応答が哺乳類モデルで長期であることを示すデータのグラフ表示。HIV 特異性抗体についてELISA で試験した代表的なマウス血清の結果が示される。夫々のサンプルをHIV-1 被覆ELISA プレートによるアッセイの前に1:100(中実のバー) 、1:1,000(陰影付きのバー) 及び1:10,000（空白のバー）に希釈した。HIV-1 の一つのエンベロープタンパク質を発現するワクシニアウイルス構築物107pfuの注射後に、試験マウスを種々の時間（１ケ月。４ケ月及び６ケ月）でサンプリングした。対照マウスをエンベロープ配列を含まないワクシニアウイルスで免疫した。標準誤差バーが示される。 ワクシニアウイルスがHIV 特異性抗体産生を含む少なくとも一つの免疫応答の誘発にどのように影響するのかを示すデータのグラフ表示。代表的なマウス血清サンプルをHIV-1 被覆プレートによるELISA により試験した。血清サンプルを、HIV-1 エンベロープタンパク質を発現する一種のワクシニアウイルスの105 、106 及び107pfuで注射したマウスから採取した。血清サンプルを注射後約３週間で試験した。夫々のサンプルをHIV-1 被覆ELISA プレートによるアッセイの前に1:100(中実のバー) 、1:1,000(陰影付きのバー) 及び1:10,000（空白のバー）に希釈した。標準誤差バーが示される。 ワクシニアウイルス構築物の混合が注射された哺乳類中のHIV 特異性抗体の誘発を悪化しないことを示すデータのグラフ表示。代表的なマウス血清サンプルを、一種以上のHIV-1 エンベロープタンパク質を発現する107pfuワクシニアウイルスの注射の約２ケ月後にELISA により試験した。“単一”は単一ワクシニアウイルスを受けたマウスからのサンプルを表す。“混台”は５種の異なるエンベロープタンパク質を発現するワクシニアウイルスの混合物を受けたマウスからのサンプルを表す。夫々のサンプルをHIV-1 被覆ELISA プレートによるアッセイの前に1:100(中実のバー) 、1:1,000(陰影付きのバー) 及び1:10,000（空白のバー）に希釈した。標準誤差バーが示される。 pEvenv4 BH10配列に代えてPCR 産物の置換による新規ワクシニアウイルス組換えの生産。配列置換の方法が示される。PCR 産物をKpnI及びBsmIの特異な酵素制限部位で夫々のBH10 env配列に代えて置換した。プラスミドの切断及びPCR 産物との結合後に、新規プラスミドを野生型VVで組換えてVV発現ベクターをつくった。 免疫化後のアボットELISA における応答。４匹のチンパンジーの全てからの血清をアボット臨床アッセイ（以下の物質及び方法を参照のこと）で試験した。夫々の血清サンプルに関する結果（Ｙ軸）が夫々の試験データ（Ｘ軸）について記録される。高い応答が混合VVenv ワクチンで免疫されたチンパンジーで観察された。 ＤＮＡワクチン及びVV組換えベクターの両方として作用することができる二機能性プラスミドの地図。サイトメガロウイルス即時型(CMV) プロモーター及びワクシニアウイルス(VV)後期及び初期プロモーターの存在が哺乳類細胞又はVV感染細胞の両方中の外来遺伝子の発現を可能にする。
Figure 2007259870

Figure 2007259870

Figure 2007259870

Figure 2007259870

Figure 2007259870

Claims (17)

  1. ＤＮＡワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミドであって、動物発現調節配列及びウイルス発現調節配列の制御下に異種遺伝子及び／又は異種遺伝子の挿入部位を含むことを特徴とする二機能性プラスミド。
  2. 動物発現調節配列がサイトメガロウイルス即時型(CMV)プロモーターであり、かつウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス初期プロモーター、ワクシニアウイルス後期プロモーター、又はその両方である請求項１に記載の二機能性プラスミド。
  3. 動物発現調節配列がサイトメガロウイルス即時型(CMV)プロモーターである請求項１に記載の二機能性プラスミド。
  4. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項１に記載の二機能性プラスミド。
  5. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項３に記載の二機能性プラスミド。
  6. ウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス初期プロモーターである請求項１に記載の二機能性プラスミド。
  7. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項６に記載の二機能性プラスミド。
  8. ウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス後期プロモーターである請求項１に記載の二機能性プラスミド。
  9. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項８に記載の二機能性プラスミド。
  10. ウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス初期プロモーター及びワクシニアウイルス後期プロモーターの両方である請求項１に記載の二機能性プラスミド。
  11. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項１０に記載の二機能性プラスミド。
  12. ウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス初期プロモーターである請求項３に記載の二機能性プラスミド。
  13. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項１２に記載の二機能性プラスミド。
  14. ウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス後期プロモーターである請求項３に記載の二機能性プラスミド。
  15. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項１４に記載の二機能性プラスミド。
  16. ウイルス発現調節配列がワクシニアウイルス初期プロモーター及びワクシニアウイルス後期プロモーターの両方である請求項３に記載の二機能性プラスミド。
  17. 異種遺伝子を含み、該異種遺伝子がHIVエンベロープタンパク質のエンベロープタンパク質変異体の可変領域及び定常領域の両方をコードするenv 変異体 (EV)核酸である請求項１６に記載の二機能性プラスミド。
JP2007186200A 1996-01-23 2007-07-17 Ｄｎａワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミド Pending JP2007259870A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/590,288 US5741492A (en) 1996-01-23 1996-01-23 Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9526911A Division JP2000504326A (ja) 1996-01-23 1997-01-23 Ｈｉｖ のｐｏｌｙｅｎｖ ワクチンとしての組換えワクシニアベクターの混合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007259870A true JP2007259870A (ja) 2007-10-11

Family

ID=24361647

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9526911A Pending JP2000504326A (ja) 1996-01-23 1997-01-23 Ｈｉｖ のｐｏｌｙｅｎｖ ワクチンとしての組換えワクシニアベクターの混合物
JP2007186200A Pending JP2007259870A (ja) 1996-01-23 2007-07-17 Ｄｎａワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミド

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9526911A Pending JP2000504326A (ja) 1996-01-23 1997-01-23 Ｈｉｖ のｐｏｌｙｅｎｖ ワクチンとしての組換えワクシニアベクターの混合物

Country Status (29)

Country Link
US (3) US5741492A (ja)
EP (2) EP1378516A1 (ja)
JP (2) JP2000504326A (ja)
KR (1) KR100571479B1 (ja)
CN (1) CN1229501C (ja)
AP (1) AP1200A (ja)
AT (1) ATE278790T1 (ja)
AU (1) AU709174B2 (ja)
BG (1) BG64711B1 (ja)
BR (1) BR9707611A (ja)
CA (1) CA2243570C (ja)
CZ (1) CZ296575B6 (ja)
DE (1) DE69731075T2 (ja)
DK (1) DK0876498T3 (ja)
EA (1) EA002390B1 (ja)
ES (1) ES2230596T3 (ja)
GE (1) GEP20032902B (ja)
HK (1) HK1016218A1 (ja)
HU (2) HU224344B1 (ja)
IL (2) IL156919A0 (ja)
NO (1) NO322261B1 (ja)
NZ (1) NZ331024A (ja)
OA (1) OA10814A (ja)
PL (1) PL188641B1 (ja)
PT (1) PT876498E (ja)
RO (1) RO120268B1 (ja)
TR (1) TR199801418T2 (ja)
UA (1) UA73712C2 (ja)
WO (1) WO1997027311A1 (ja)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US6919318B1 (en) * 1998-04-22 2005-07-19 Chiron Corporation Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine
WO1999061049A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University Of Massachusetts Medical Center Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids
US6562800B1 (en) * 1998-10-30 2003-05-13 University Of Southern California Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
CA2348382C (en) 1998-11-10 2013-09-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric parvovirus vectors and methods of making and administering the same
WO2000039302A2 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
CA2358915C (en) 1998-12-31 2010-06-01 Chiron Corporation Modified hiv env polypeptides
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2000044410A2 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Stichting Biomedical Primate Research Centre Composition and method for obtaining specific immunisation against one or more antigens using different recombinant vectors
DE19907485B4 (de) * 1999-02-12 2008-01-17 Strathmann Ag & Co. Virus-Vakzine
US6420545B1 (en) * 1999-05-24 2002-07-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics
AU3793701A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Orchid Biosciences, Inc. Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof
CA2401974C (en) 2000-03-02 2013-07-02 Emory University Dna expression vectors and methods of use
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
WO2002011748A1 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and composition for immunization using mixed pools of mutated nucleic acids or peptides
EP1363663B1 (en) * 2001-01-12 2011-03-02 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Nucleic acid mucosal immunization
CA2454959C (en) * 2001-03-08 2018-07-10 Bernard Moss Mva expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
WO2003004657A1 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2412242A3 (en) 2001-07-05 2012-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
CA2458995C (en) * 2001-08-31 2013-04-30 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20070269456A1 (en) * 2001-11-05 2007-11-22 Lasher Alfred W DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
WO2003047617A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Isis Innovation Limited Vaccine
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
US20040106566A1 (en) * 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
EP1523582B1 (en) * 2002-07-18 2008-11-12 University of Washington Rapid, efficient purification of hsv-specific t-lymphocytes and hsv antigens identified via same
WO2004050856A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 University Of Massachusetts Polyvalent, primary hiv-1 glycoprotein dna vaccines and vaccination methods
WO2004100985A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against fiv infection
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
US8076060B2 (en) * 2003-08-04 2011-12-13 Emil William Chynn Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma
JP2007505130A (ja) * 2003-09-09 2007-03-08 バイレクシス コーポレイション ヒトにおいてｈｉｖに対する免疫応答を生成するための、レンチウイルスベクターベースのアプローチ
AU2004279362B2 (en) 2003-09-15 2011-03-17 Genvec, Inc. HIV vaccines based on ENV of multiple clades of HIV
CA2539021A1 (en) * 2003-09-15 2005-03-31 Chiron Corporation Combination approaches for generating immune responses
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
EP1773858B1 (en) 2004-05-27 2016-06-22 Janssen Biotech, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
US20050276758A1 (en) * 2004-06-15 2005-12-15 Marshall Deborah J Method for screening agents against human prostate disease
JP4772045B2 (ja) * 2004-07-16 2011-09-14 アメリカ合衆国 Ｃｍｖ／ｒ核酸コンストラクトを含むａｉｄｓに対するワクチン
US20080085261A1 (en) * 2004-10-19 2008-04-10 Haynes Barton F Vaccine Adjuvant
US20100015211A1 (en) * 2004-11-01 2010-01-21 Barnett Susan W Combination Approaches For Generating Immune Responses
CA2591544A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric vectors
WO2008048984A2 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine
US8889641B2 (en) 2009-02-11 2014-11-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
EA025417B1 (ru) * 2010-11-22 2016-12-30 Борис Славинович ФАРБЕР Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения
CA2826286C (en) 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
EP3173096A1 (en) 2011-04-06 2017-05-31 Biovaxim Limited Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans
MX2014005548A (es) 2011-11-14 2014-08-21 Novartis Ag Complejos inmunogenicos de carbomeros polianionicos y polipeptidos env y metodos de manufactura y usos de los mismos.
US9833503B2 (en) 2012-02-24 2017-12-05 President And Fellows Of Harvard College Methods for displaying polypeptides and uses thereof
AU2016369326B2 (en) * 2015-12-15 2019-02-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
US11155609B2 (en) 2019-04-05 2021-10-26 TauC3 Biologies Limited Anti-TAUC3 antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08337539A (ja) * 1994-12-30 1996-12-24 Rhone Merieux 鳥類ヘルペスウイルスをベースとした組換型鳥類用生ワクチン、特にガンボロ病用ワクチン

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198214A (en) * 1983-08-31 1993-03-30 Stolle Research & Development Corporation Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof
NZ217645A (en) * 1985-09-25 1991-11-26 Oncogen Recombinant viruses expressing lav/htlv-iii related epitopes and vaccine formulations
EP0243029A1 (en) * 1986-04-08 1987-10-28 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US5081226A (en) * 1986-12-30 1992-01-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
DE69031735T2 (de) * 1989-04-18 1998-03-12 Applied Biotechnology Inc Erzeugung von hybrid-genen und proteinen durch rekombination mittels viren
ATE241696T1 (de) * 1991-06-14 2003-06-15 Virogenetics Corp Rekombinanter hiv-spezifischer impfstoff aus poxviru
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
WO1995020660A2 (en) * 1994-01-27 1995-08-03 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of dna transcription unit

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08337539A (ja) * 1994-12-30 1996-12-24 Rhone Merieux 鳥類ヘルペスウイルスをベースとした組換型鳥類用生ワクチン、特にガンボロ病用ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
AU709174B2 (en) 1999-08-26
EA199800638A1 (ru) 1999-02-25
HU0402182D0 (en) 2004-12-28
CN1214083A (zh) 1999-04-14
US6086891A (en) 2000-07-11
CZ229398A3 (cs) 1998-12-16
EP1378516A1 (en) 2004-01-07
HUP9900389A2 (hu) 1999-06-28
HK1016218A1 (en) 1999-10-29
EP0876498A1 (en) 1998-11-11
DK0876498T3 (da) 2005-02-07
DE69731075T2 (de) 2006-03-09
EA002390B1 (ru) 2002-04-25
AP1200A (en) 2003-08-29
PL328193A1 (en) 1999-01-18
AP9801325A0 (en) 1998-09-30
IL156919A0 (en) 2004-02-08
GEP20032902B (en) 2003-02-25
BG64711B1 (bg) 2005-12-30
IL125497A0 (en) 1999-03-12
CZ296575B6 (cs) 2006-04-12
ATE278790T1 (de) 2004-10-15
JP2000504326A (ja) 2000-04-11
US5846546A (en) 1998-12-08
DE69731075D1 (de) 2004-11-11
WO1997027311A1 (en) 1997-07-31
BG102712A (en) 1999-04-30
NZ331024A (en) 2000-02-28
UA73712C2 (en) 2005-09-15
RO120268B1 (ro) 2005-11-30
US5741492A (en) 1998-04-21
PT876498E (pt) 2005-02-28
OA10814A (en) 2003-01-28
KR19990081931A (ko) 1999-11-15
AU1829997A (en) 1997-08-20
CN1229501C (zh) 2005-11-30
KR100571479B1 (ko) 2007-06-07
PL188641B1 (pl) 2005-03-31
EP0876498B1 (en) 2004-10-06
HUP9900389A3 (en) 2001-06-28
ES2230596T3 (es) 2005-05-01
HU224344B1 (hu) 2005-08-29
CA2243570C (en) 2001-08-14
CA2243570A1 (en) 1997-07-31
NO983377L (no) 1998-09-23
NO983377D0 (no) 1998-07-22
BR9707611A (pt) 1999-07-27
IL125497A (en) 2007-07-04
TR199801418T2 (xx) 1998-10-21
NO322261B1 (no) 2006-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2007259870A (ja) Ｄｎａワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミド
WO1997027311A9 (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv
US7981430B2 (en) Multi-clade chimeric immunogens derived from highly conserved regions of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) consensus proteome
JP4805511B2 (ja) Ｈｉｖに対する免疫応答における改善、または免疫応答に関する改善
JP2019038849A (ja) ヒト免疫不全ウイルス感染に対する防御免疫を誘導するための方法および組成物
US20040191269A1 (en) Polyvalent, primary HIV-1 glycoprotein DNA vaccines and vaccination methods
CA2790426A1 (en) Vectors expressing hiv antigens and gm-csf and related methods for generating an immune response
JP2006514549A (ja) Ｉｌ−１５を発現する組換えワクチンウイルスおよびその使用方法
AU2017221379A1 (en) Multivalent HIV vaccine boost compositions and methods of use
JP2004518443A (ja) ヒト免疫不全ウイルスのキメラタンパク質用組換えポックスウイルス
JP2005507377A (ja) ＨＩＶに対する免疫のためのｇｐ１２０と、Ｎｅｆ及び／又はＴａｔを含むワクチン
ES2396915T3 (es) Secuencias consenso, antígenos y transgenes del VIH-1 del clado A
US6723558B1 (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
JP2006503800A (ja) Ｈｉｖに対する強化された免疫応答を誘導する方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070718

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100520

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20101209