CZ229398A3 - Způsob přípravy a použití virových vektorů, pro směsnou polyenv vakcínu proti viru HIV - Google Patents

Description

ZPŮSOB PŘÍPRAVY A POUŽITÍ VIROVÝCH VEKTORŮ, PRO SMĚSNOU POLYENV VAKCÍNU PROTI VIRU HIV

Tato práce je podporována částečně NCI grantem R01-CA57419-03 a Cancer Centre Core grantem P30-CA21765, NIH-NIAID granty AI-32529 a P01-A131596-04. Tím pádem vláda Spojených Států má výhradní práva na tento vynález.

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález popisuje polyenv vakcínu pro lidský virus získané imunodeficience (HIV), skládající se ze směsi alespoň 4 až 40 a až 10 000 rekombinantních virů vakcinie, z nichž každý exprimuje odlišnou variantu obalového proteinu env, viru HIV. Tato vakcína je vhodná pro vakcinaci savců, včetně lidí, aby neočekávaně zvýšila buněčnou a/nebo humorální imunitní odpověď na HIV infekci. Navíc vynález popisuje způsob výroby a použití těchto rekombinantních virů vakcinie a polyenv vakcíny.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Virus AIDS pravděpodobně nakazí do roku 2 000 desítky miliónů lidí a stává se díky tomu problémem světového zdravotnictví s vrcholnou prioritou (viz DeVita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3^rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, Virology, pp 1592-1543; Hirsch, et al., Virology, pp. 1545-1570). Vytvoření efektivní HIV vakcíny představuje značný problém pro imunology, neboť enzym reversní transkriptáza, účastnící se replikace HIV, způsobuje při přepisu vysoké procento chyb. To vede ke vzniku mnoha mutantních HIV kmenů majících vnější obal složený z proteinů s odlišnou sekvencíTyto variantní obalové proteiny jsou pak rozeznávány jako odlišné antigeny imunitním systémem savců, který produkuje více než 10⁹ nových lymfocytů denně za účelem eliminace cizorodých antigenů. Humorální a buněčný typ imunitní odpovědi je zajištěn B a T lymfocyty. Dobrý příklade kvalitativní intenzity těchto imunitních reakcí je ukázán na HIV infikovaném pacientovi a SIV infikovaném makakovi. V obou případech dochází k následujícím fázím infekce, imunitní reakce a selekce variantních kmenů HIV a SIV (Wrin et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994); Burns and Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994)). S každý následujícím cyklem diverzita antigenní ch determinant viru HIV

• 4 4 4 4 4 4 · • ··· · · 4 4

4 ·· 4 4 4 4*4 ·

4 4 4 · · · • 4 44 *4 44 (a odpovídající imunitní reakce) narůstá, tak jak imunitní systém neutralizuje široké spektrum variant SIV a HIV a inhibuje tak vznik superinfekce.

Tedy pacienti infikovaní AIDS vytváří odpovídající odpověď, která se stává nedostatečná na to aby zdolala virovou infekci HIV která nakonec překoná pacientův imunitní systém. To může být částečně i díky tomu, že nově vzniklé viry HIV s variantním obalovým proteinem, nejsou rozeznávané imunitním systémem a unikají tak zničení (Sci. Amer., Aug 1995, pp.). V těchto případech, třebaže imunitní odpověď by byla schopna zvládnout infekci de novo (např. persistující mutace viru v privilegovaných izolovaných místech), infekce HIV může nakonec překonat pacientův imunitní systém (Pantaleo et al., Nátuře 362:355-358 (1993); Embretson et al., Nátuře 362:359-362 (1993)).

Identifikace B a T antigenních determinant proti HIV proteinům je stále nekompletní. Obalové proteiny viru HIV jsou složeny, jak bylo zjištěno z variabilních (VI až V5) a konstantních (Claž C5) oblastí. Peptid představující region V3 byl nazván hlavní neutralizační determinanta (PND) (Javaherian et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:6768-6772 (1989)), ačkoliv i ostatní oblasti proteinu obalu mohou být příčinou vyvolání imunitní odpovědi. Celá délka proteinu obalu viru HIV obsahuje mezi 850 až 900 aminokyselinami, s variabilní délkou způsobenou hypermutací (Starcích et al., Cell 45:637 (1986)).

První vakcíny proti HIV testované v klinické praxi byly vytvořené tak aby prezentovaly jeden obalový protein, nebo jeho části, imunitnímu systému. Je tedy jasné, že neutralizační odpověď proti jednomu nebo několika obalovým proteinům nerozeznává odlišné kmeny HIV a jednotlivec pak není chráněn proti infekci (Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994); U.S. Patent No. 5,169,763; PCT publikation WO 87/06262; Zagury et al., Nátuře 332:728-731 (1988); Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989); Eichberg, Int Conf. AIDS 7:88(1991); Cooney et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):S139-143 (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. (Suppl. 2):S141-143 (1994); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994); Fauci, Science 264: 1072-1073) (May 1994)).

Z toho vyplývá, že vytvoření vakcín a metod, které budou schopné stimulovat imunitní systém tak aby byl schopen zvládnout nebo preventovat HIV infekci, je velmi naléhavé.

PODSTATA VYNÁLEZU

Předkládaný vynález navrhuje způsob jak překlenout jednu nebo více komplikací dosavadního stavu techniky. Konkrétně, polyenv vakcína navrhovaná vynálezem, indukuje daleko rozsáhlejší • · · · · » 4 4

4 44 4 4 · · 44444 ···

44444 44 44 ·* 44 imunitní odpověď. Výhodou navrhovaného vynálezu je schopnost stimulovat populace B buněk, T-helperů a T-cytotoxických buněk k efektivní imunitní odpovědi v oblasti buněčné i humorální imunity. Například, vakcína navrhovaná vynálezem je schopna stimulovat protilátkovou imunitní odpověď proti HIV s velmi širokým spektrem specifit. Testy s neutralizací viru dokazují, že se jedná o protilátky s vysokou úrovní specifity. Je zajímavé, že vakcína navrhovaná vynálezem generuje imunitní odpověď i vůči kmenům HIV, které jsou vůči ní naivní, tzn. kmeny HIV, jejichž obalové proteiny nebyly zahrnuty v polyenv koktejlu.

Ke zvýšení účinnosti HIV vakcín, předkládaný vynález navrhuje polyenv vakcínu, která se skládá z alespoň 4 až 10 000, lépe pak okolo 4 až 1 000 a nejlépe pak od 10 do 100, odlišných rekombinantních virů exprimuj ících na svém povrchu odlišné varianty obalového proteinu (EPV) viru HIV (nebo jejich části), které obsahují jak konstantní tak variabilní oblasti obalového proteinu. Je s výhodou pokud každá z exprimovaných variant obalového proteinu má strukturu a/nebo imunologickou podobu struktury která se vyskytuje na přirozených obalových proteinech viru HIV nacházejících se na povrchu infikovaných buněk, nebo v lipidické membráně viru ve formě oligomeru. Také je zde uváděn způsob výroby a použití těchto rekombinantních virů jako polyenv vakcíny. Pokud je tato směs použita jako vakcína, každá z variant obalového proteinu indukuje odlišnou subpopulaci B a/nebo T buněk, odpovídající specifity vzhledem k variantě obalového proteinu, a tím pádem násobí intenzitu imunitní odpovědi. Směs o tomto složení, typu a/nebo struktuře obalového proteinu je nově objeveným způsobem, jak vyvolat silnou, dlouhodobou HlV-specifickou imunitní odpověď s širokým spektrem neutralizační aktivity.

V preferované variantě vynálezu jsou rekombinantní viry vybrány z této skupiny: vakcinie, virus kanářích neštovic (canary pox virus), adenovirus a adeno-associated virus (AAV). Ve tomto případě, byl pro přípravu vybrán virus infra vakcinie. V preferované variantě vynálezu byla vakcína, složená z rekombinantních variant viru vakcinie, aplikována podkožně. Další výhodou tohoto vynálezu je , že vakcína vakcinie podaná podkožně nezpůsobuje tvorbu lézí a tedy znemožnění nárůstu populace infekční vakcinie tak aby se stala dostatečnou pro vyvolání imunitní odpovědi.

Je s výhodou pokud virová polyenv vakcína navrhovaná vynálezem, obsahuje lyzát virem infikovaných rostoucích buněk, např. vero buněk, který obsahuje další varianty obalového proteinu, navíc k těm exprimovaným infekčním virem. Zahrnutí variant obalového proteinu obsažených v lyzátu, které také indukují imunitní odpověď, je podstatnou částí tohoto vynálezu, neboť obecně je virus z buněčného lyzátu vyčištěn.

·· ·· » · · i » · · · » · · <

I · · <

·· · · • · » · « ·· · ·

Ve vakcíně navrhované vynálezem, mohou být nukleotidy pro EV izolované z pacientů infikovaných virem HIV z geograficky vzdálených oblastí, od pacientů infikovaných virem HIV z rozdílných prostředí, nebo z laboratorně isolovaných virů HIV.

Navrhovatel zjistil, že navrhovaná polyenv vakcína stimuluje neočekávaně intenzivní imunitní odpověď, díky expresi a/nebo prezentaci mnoha variant obalového proteinu, kde všechny obsahují jak konstantní, tak variabilní oblasti pokud možno mající strukturu která je alespoň částečně podobná přirozeným formám obalového proteinu viru HIV. Zvýšená imunitní odpověď rozeznává další kmeny HIV navíc k těm , které exprimuji obalové proteiny použité v polyenv vakcíně. Tedy, záměrem této vakcíny je stimulovat imunitní odpověď na široké spektrum virů HIV, tak aby tato reakce byla natolik intenzivní, aby zvládla odstranění viru z organismu nebo preventovala před infekcí (nebo zvládla díky mutaci pokračující infekci) různými kmeny viru. Navrhovaný vynález také popisuje env varianty (EV) nukleových kyselin kódujících (nebo k nim komplementárních) alespoň jednu antigenní determinantu variantního proteinu env (EPV). EPV je pokud možno, kódováno rekombinantním virem, dále použitým v polyenv vakcíně navrhované předkládaným vynálezem. Varianty nukleových kyselin obsahují alespoň jednu mutaci, která má jiné antigenní vlastnosti, nebo prostorovou strukturu, než kódovaná EPV. Navrhovaný vynález také popisuje složení vakcíny, obsahující polyenv vakcínu navrhovanou vynálezem a farmaceuticky přijatelný nosič nebo rozpouštědlo.Směs vakcíny může dále obsahovat nějaké adjuvans a/nebo cytokiny, které zesilují u savců vystavených působení vakcíny imunitní reakci, vyvolanou polyenv vakcínou, na alespoň jeden kmen HIV. Polyenv vakcína navrhovaná vynálezem je schopná indukovat alespoň částečnou imunitní odpověď a to buď humorální imunitní odpověď (tzn. protilátkovou odpověď) nebo buněčnou (tzn. aktivované B buňky, pomocné T buňky a cytotoxické T buňky (CTL)).

Navrhovaný vynález také popisuje způsob vyvolání imunitní odpovědi na HIV infekci u savců, který má profylaktický účinek pro následnou HIV infekci, kdy tato metoda představuje vystavení savce směsné vakcíně obsahující polyenv vakcínu navrhovanou vynálezem, která bude jedince chránit proti klinicky vyvolané HIV patogenezi způsobené infekcí alespoň jedním HIV kmenem. Další možností je profylaktická nebo terapeutická metoda vyvolání imunitní odpovědi na HIV, představující vystavení efektivního množství jiné (např. druhé) polyenv vakcíny skládající se z alespoň 4 až 10 000 rozdílných rekombinantní ch virů, kdy rekombinantní viry jsou odlišného druhu od těch použitých v předchozí vakcíně, a každý z rekombinantních virů v polyenv vakcíně obsahuje variantu nukleové kyseliny kódující odlišnou variantu obalového proteinu viru HIV. HIV specifická imunitní odpověď indukovaná polyenv vakcínou tvořenou rekombinantním virem vakcinie navrhovanou vynálezem, může být dále zesílena podpořením nebo stimulací

4 imunitní odpovědi buď humorálního, buněčného nebo obou typů, přidáním efektivního množství buď rekombinantního HIV env proteinu, nebo DNA vakcíny, nebo dokonce obou. Pokud možno, je rekombinantní protein nebo DNA vakcína součástí polyenv vakcíny. Všechny vakcinační strategie zde popisované mohou probíhat v libovolném pořadí. Například, subjektu může být aplikována rekombinantní polyenv vakcína, následovaná podpůrnou DNA vakcínou a poté rekombinantní proteinovou vakcínou. Je vhodné aby rekombinantní env protein byl podáván v adjuvans. Ve specifickém případě, uváděném jako příklad byl infra rekombinantní HIV env protein podáván intramuskulárně. Je preferováno aby DNA vakcína bula podávána pomocí zařízení zvaného gene gun.

Výše popsané metody, navrhované vynálezem přinášejí nové možnosti pro genové inženýrství a nové plasmidové vektory. V důsledku tedy navrhovaný vynález popisuje bifunkční plasmid, který může sloužit jako DNA vakcína nebo rekombinantní virový vektor, obsahující rozmanité heterogenní oblasti které jsou regulovány jak regulačními sekvencemi hostitelského zvířete, tak původními virovými regulačními oblastmi. Pokud možno, zvířecí regulační sekvence je velmi časný promotor cytomegaloviru a virové sekvence regulující expresi mohou být časný nebo pozdní promotor viru vakcinie, nebo oba dva.

Další záměry, rysy, výhody, způsoby použití a konkrétní varianty vynálezu budou zřejmé odborníkům v oboru z následujícího detailního popisu a příkladů vztahujícím se k tomuto vynálezu.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr.l Schématické znázornění orientace HIV-1 genu v genomu viru vakcinie

Gen obalového proteinu HIV-1 je umístěn mezi pravým a levým segmentem Iokusu thymidin kinázy. Na C- terminálním konci genu pro obalový protein HIV-1 leží restrikční místo pro HindlII. Vhodná velikost inzertního fragmentu získaného pomocí HindlII je přibližně 7 kb. Southern blot tohoto vzorku ověří správnou pozici a orientaci genu pro obalový protein HIV-1.

Obr.2 Grafické znázornění dat dokazujících že HIV specifická protilátko vá odpověď má na savčím modelu dlouhodobou účinnost.

Jsou zde znázorněny výsledky testu reprezentativního vzorku myších sér na HIV specifické protilátky pomocí ELIS A techniky. Před ELISA testem byl každý vzorek ředěn 1:100 (plný sloupec), 1:1 000 (mřížkovaný sloupec) a 1:10 000 (prázdný sloupec). Myši byly odebírány po různé době (1 měsíc, 4 měsíce a 6 měsíců) od aplikace 10⁷ pfu konstruktů viru vakcinie • ·

6· «·· · · · · ♦ · ···· * • · « · · · · · · •••Β· ·· ·· * · ·· exprimujících jeden obalový protein HIV-1. Jako kontrolní myši byly považovány myši imunizované virem vakcinie bez rekombinantní sekvence pro obalový protein. Jsou znázorněny standartní odchylky.

Obr. 3 Grafické znázornění dat dokazujících, že virus vakcinie ovlivní indukci imunitní odpovědi, včetně produkce HIV specifických protilátek.

Pomocí ELISA techniky na HIV-1 potažených destičkách byly testovány reprezentativní vzorky myších sér. Vzorky sér byly získány z myší imunizovaných s 10⁵,10⁶ a 10⁷ pfu virů vakcinie exprimujících jeden HIV-1 obalový protein. Sérové vzorky byly testovány přibližně 3 týdny po imunizaci. Každý vzorek byl před ELISA testem na HIV-1 potažených destičkách ředěn 1:100 (plný sloupec), 1:1 000 (mřížkovaný sloupec) a 1:10 000 (prázdný sloupec). Jsou znázorněny standartní odchylky.

Obr. 4 Grafické znázornění dat dokazujících, že smíchání konstruktů viru vakcinie nezpůsobí snížení intenzity HIV specifické protilátkové odpovědi u savců.

Pomocí ELISA techniky byly testovány reprezentativní vzorky myších sér přibližně dva měsíce po imunizaci s 10⁷ pfu virů vakcinie exprimujících HIV-1 obalový protein(y). Jeden označuje vzorky získané z myší imunizovaných pouze jednou variantou rekombinantního viru vakcinie. Směs označuje vzorky získané z myší, které byly imunizované směsí rekombinantních virů exprimujících 5 odlišných variant obalového proteinu. Každý vzorek byl před ELISA testem na HIV-1 potažených destičkách ředěn 1:100 (plný sloupec), 1:1 000 (mřížkovaný sloupec) a 1:10 000 (prázdný sloupec). Jsou znázorněny standartní odchylky.

Obr. 5 Produkce nových rekombinantních virů vakcinie substitucí PCR produkty do sekvence pEvenv4 BH10.

Je znázorněna metoda substituce. PCR produkty byly substituovány do BH10 env sekvence na jedinečná restrikční místa Knpl a Bsml. Následovala restrikce plasmidu a ligace s PCR produkty, nový plasmidy byly pak rekombinovány s divokým typem VV tak aby vznikly VV-expresní vektory.

Obr. 6 Reakce následující imunizaci testovaná pomocí Abbott ELISA techniky.

Série ze čtyřech pokusných šimpanzů byla testována pomocí Abbott clinical assay (viz. Materiál a Metody, infra). Závěr pro každý vzorek séra ( osa Y) byl vynesen pro každé získané hodnoty (osa X). Vysoké hodnoty byly zjištěny u šimpanzů imunizovaných směsí VVenv vakcíny.

• ·

• · ·	• ·		«	•	··
• « ·	•	•	•	•	• ·
• · · · «	•	•	•	• ·	··· ·
• ·	•	•	•	•	• w
• · · · »	·*		•	•	• ·

Obr. 7 Mapa bifunkčního plasmidu, který může sloužit buď jako DNA vakcína nebo jako V V rekombinantní vektor. Přítomnost velmi časného cytomegalovirového promotoru a časných I pozdních promotorů viru vakcinie (VV) zajišťuje expresi cizorodého genu jak v savčích buňkách tak v VV infikovaných buňkách.

Dřívější pokusy vyvinout vakcínu proti různým kmenům HIV byly zaměřeny na jeden či více variabilních oblastí v gpl20 nebo gpl60. Očekávalo se, že některá z variabilních oblastí, použitých ve vakcíně, zajistí širokou ochranu proti HIV infekci. Tyto vakciny však nebuly úspěšné, neboť vakcínou indukovaná imunitní odpověď nebyla schopna rozeznat řadu odlišných kmenů HIV. Bylo nezbytně nutné vyvinou takovou vakcínu, která by indukovala imunitní odpověď proti různým kmenům HIV, tak aby byla použitelná pro terapii a/nebo prevenci před HIV.

Tato práce popisuje, že značně zvýšená primární a sekundární (podpůrná) imunitní odpověď může být indukována proti několika, nebo celé řadě rozdílných kmenů HIV, použitím polyenv vakciny obsahující směs alespoň 4 a až 1 000, možná dokonce 10 000, rekombinantních virů, kdy každý z nich kóduje odlišnou variantu obalového proteinu (EPV). Vakcína může také obsahovat EPV exprimované virem, např. produkované v hostitelské buňce a použité na tvorbu viru.

Termíny primární a sekundární (podpůrná) zde používané popisují první a následnou imunizaci, tzn. stejně jako jsou tyto termíny používány běžně v imunologii.

Nukleová kyselina kódující EPV (nukleová kyselina kódující variantu obalového proteinu (EV)) může být izolovaná ze stejné nebo odlišné populace (např. geograficky) lidí infikovaných virem HIV. Je také možné odlišné varianty nukleových kyselin kódujících EV získat z jednoho zdroje a pomocí screeningu sekvencí najít odlišnosti v kódující sekvenci, nebo vyhodnotit rozdíly v humorální a buněčné imunitní odpovědi vyvolané několika kmeny HIV in vitro nebo in vivo, pomocí známých metod.

Původní objev popisuje rekombinantní vakciny viru vakcinie. Jak je však každému odborníkovi jasné, pro expresi antigenů polyenv vakciny, jak ji popisuje vynález, je možné použít jakýkoliv rekombinantní virus. Navíc použití několika typů virových vakcín eliminuje možnost indukce imunitní odpovědi proti přirozeným antigenům rekombinantního viru což snižuje účinnost virové vakciny (díky silné antivirové odpovědi).

Jak si každý odborník uvědomí, navrhovatelé vynálezu také zjistili, že rozšíření vakciny o rekombinantní HIV env protein nebo proteiny, preferovaná je směs proteinů, umocní imunizační • · • ·

• · « · efekt vynálezu. HIV env protein nebo proteiny mohou odpovídat HIV env proteinům exprimovaným vektory obsaženými v polyenv vakcíně, nebo mohou být zcela odlišné.

Podobně, jak bude oceněno každým odborníkem, imunizační efekt metody dle navrhovaného vynálezu může být také zesílen použitím DNA vakcíny. DNA vakcína může být použita pro umocnění efektu, např. jak bylo popsáno výše pro rekombinantní HIV proteiny. Jinou variantou je použití DNA vakcíny jako přípravné první dávky v kombinaci s rekombinantní virovou vakcínou nebo vakcínami používanými pro zesílení anti-HIV imunitní odpovědi. Stejně jako zesilovací vakcína složená z rekombinantního env proteinu, tak i DNA vakcína může obsahovat buď jednu nebo více variant vektorů exprimujicích jeden či více HIV env genů. Navíc HIV env geny mohou být stejné jako geny exprimované viry v rekombinantní vakcíně, nebo mohou být zcela odlišné. V preferované variantě jsou vektory připraveny pro expresi v rekombinantní virové vakcíně a v transfektovaných savčích buňkách jako součást DNA vakcíny.

Indukovaná imunitní odpověď (humorální a/nebo buněčná) je účinná pro širší spektrum kmenů infekčního viru, jako je HIV, a není zdaleka limitována na kmeny viru exprimuj ícím specifické varianty obalového proteinu (EPV) použité v polyenv vakcíně. Navrhovaný vynález tedy popisuje mnoho EPV kódovaných rekombinantní virovou vakcínou, která silně stimuluje imunitní odpověď proti mnoha kmenům viru HIV.

Polyenv vakcína a vakcinace

Navrhovaný vynález tedy popisuje, v jednom aspektu, polyenv vakcínu složenou ze směsi alespoň 4 až 10 000 odlišných rekombinantních variant viru vakcinie z nichž každý exprimuje odlišnou variantu obalového proteinu, nebo jeho části s antigenní determinantou. Jak může tedy každý odborník předpokládat může být použito, 4 až asi 1 000, lépe pak 10 až asi 100, odlišných variant rekombinantního viru. Každému odborníkovi v oboru je jasné, že pro vakcinaci mohou být použity i jiné viry. Jako příklady virů použitelných jako hostitelské organismy pro vakcínu mohou být, kromě viru vakcinie uvedeny např. virus kanářích neštovic, adenovirus a adenoassociated virus. Jsou zde také popsané metody výroby a použití těchto polyenv vakcín. Polyenv vakcína popisovaná navrhovaným vynálezem indukuje alespoň buď humorální nebo buněčnou imunitní odpověď u savců imunizováných polyenv vakcínou, ale odpověď na vakcínu je subklinická, nebo účinně zesiluje alespoň jeden typ imunitní odpovědi proti alespoň jednomu kmenu HIV, takže vakcína je použitelná k vakcinaci proti infekci.

« · • ·

Virové vakcíny

Řada geneticky modifikovaných virových přenašečů (“rekombinantních virů”) může být použita k přípravě polyenv virové vakcíny pro expresi HIV polyenv antigenů. Virové vakcíny jsou obzvláště výhodné v tom případě že komponenty virové infekce stimulují silnou imunitní odpověď která zahrnuje aktivaci B buněk, pomocných T lymfocytů a cytotoxických T lymfocytů. Celá řada virů může být použita jako rekombinantní virové vektory použitelné ve vakcíně navrhované vynálezem. Preferovaný rekombinantní virový vektor pro virovou vakcínu je virus vakcinie ( International Patent Publication WO 87/06262, October 22, 1987, by Moss et al., Cooney et al., Proč Nati. Acad. Sci. USA 90:1882-6 (1993), Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992), McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)). V jiné variantě vynálezu byl použit rekombinantní virus kanářích neštovic ( Pialoux et al., AIDS Res. Hum Retroviruses 11:373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:875 (1995), Anderson et al., J. Infect. Dis. 174:977-85 (1996), Fries et al., Vaccine 14:428-34 (1996), Gonczol et al., Vaccine 13:1080-5 (1995)). Jinou alternativou je defektní adenovirus nebo adenovirus (GilardiHebenstreit et al., J. Gen. Virol. 71:2425-31 (1990), Prevec et al., J. Infect. Dis. 161:27-30 (1990), Lubec et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:6763-7 (1989), Xiang et al., Virology 219:220-7 (1996)). Mohou být použity také další vhodné virové vektory včetně retrovirů, které jsou sestavovány v buňce s širším rozsahem hostitelů (Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, §9) a atenuované nebo defektní DNA viry jako například herpes simplex virus (HSV) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)) papilomavirus, Epstain-Barr virus (EBV), adeno-associated virus (AAV) ( Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101, Samulski etal., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)), a podobně.

DNA vakcíny

Variantu klasické vakcíny složené z antigenů a adjuvans, představuje in vivo přímé zavedení DNA, kódující antigen, do tkáně, což vede k expresi cizorodých antigenů na buňkách organismu vlastních. Tyto vakcíny jsou tedy nazývány „DNA vakcíny” nebo „vakcíny založené na nukleových kyselinách“. DNA vakcíny jsou popsány v International Patent Publication WO 95/20660 a International Patent Publication WO 93/19183. Možnost přímo injikovat DNA kódující virový protein tak aby vyvolala ochrannou imunitní reakci, byla popsána v řadě experimentálních systémů (Conry et al., Cancer. Res., 54:1164-1168 (1994), Cox et al., Virol, 67:5664-5667 (1993), Davis et al., Hum. Mole. Genet., 2:1847-1851 (1993), Sedegah et al.,

Proč. Nati. Acad. Sci. 91:9866-9870 (1994), Montgomery et al., DNA Cell Bio., 12:777-783 (1993) Ulmer et al., Science 259:1745-1749 (1993), Wang et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 90:41564160 (1993) Xiang et al., Virology, 199:132-140 (1994)). Studie pokoušející se použít tuto strategii k neutralizaci chřipkového viru, používá jak obalové tak vnitřní virové proteiny k indukci produkce protilátek, je však zaměřena zejména na virový hemaglutinační protein (HA) ( Fynan et al., DNA cell Biol., 12:785-789 (1993A), Fynan et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 90:11478-11482 (1993B), Robinson et al., Vaccine, 11:957 (1993), Webster et al., Vaccine, 12:1495-1498(1994)).

Vakcinace pomocí aplikace DNA kódující HIV env protein indukuje jak humorální tak buněčnou imunitní odpověď. To odpovídá závěrům získaným se živým virem ( Raz et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 91:9519-9523 (1994), Ulmer, 1993, supra, Wang, 1993, supra, Xiang, 1994, supra). Studie s fretkami ukazují, že DNA vakciny kódující konzervativní interní virové proteiny chřipky, zároveň s povrchovými glykoproteiny jsou účinnější proti antigenním variantám chřipkového viru, než buď inaktivované nebo subvirionové vakciny (Donnelly et al., Nat. Med., 6:58-587 (1995)). Navíc, u myší byla prokázána opakovatelně indukovaná imunitní odpověď proti DNA kódovaným nukleoproteinům, která přetrvala po celý čas života pokusného zvířete (Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12:771-776 (1993)).

Jak je známo, účinnost exprese antigenní ch genů a/nebo imunogenicitu DNA vakcín může ovlivnit široké spektrum faktorů. Příkladem těchto faktorů může být například reproducibilita inokulace, konstrukce plasmidového vektoru výběr promotoru použitého k řízení exprese antigenního genu a nebo stabilita inzertovaného genu v plasmidů. V závislosti na svém původu, promotory se odlišují v tkáňové specifitě a účinnosti iniciace syntézy mRNA (Xiang et al., Virology, 209:564-579 (1994), Chapman et al., Nucle Acid Res., 19:3979-3986 (1991)). V současnosti je většina virových vakcín v savčích systémech pod kontrolou virových promotorů odvozených od cytomegaloviru (CMV). Takový systém má dobrou účinnost jak při svalové tak kožní inokulaci u celé řady savčích druhů. Další známý faktor který ovlivňuje míru indukce imunitní reakce indukované DNA imunizací, je způsob zavedení DNA; parenterální cesta nezajišťuje dostatečný přenos genu do buněk a míra exprese genu je pak značně variabilní (Montgomery, 1993, supra) Vysokorychlostní zavedení plasmidů pomocí zařízeni gene-gun, zvyšuje imunitní reakci u myší (Fynan, 1993B, supra, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 12:791797 (1993)), především díky vysoké účinnosti transfekce efektivnější prezentaci antigenů dendritickými buňkami. Vektory obsahující vakcínu složenou z nukleových kyselin mohou být do požadovaného objektu zavedeny i jinými metodami, dnes již dobře známými např. transfekcí, elektroporací, mikroinjekcí, transdukcí, buněčnou fůzí, DEAE dextranem, kalcium fosfátovou precipitací, lipofekcí (fůzí lipozómů) nebo pomocí transportéru DNA vektorů (Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992), Wu and Wu J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988), Hartmut et al., Canadian Patent Application No 2,012,311, March 15, 1990).

Bifunkční plasmidy pro viry a DNA vakcíny *

Preferovaná varianta tohoto vynálezu se zaměřuje na konstrukci bifunkční ch plasmidů, které mohou sloužit jako DNA vakcíny a rekombinantní virové vektory. Přímá injekce vyčištěné plasmidové DNA, tzn. ve formě DNA vakcíny, bude indukovat imunitní odpověď organismu proti antigenu tímto genem kódovanému. Tento plasmid může být použit ve formě živého rekombinantního viru použitého jako imunizačního prostředku.

Bifunkční plasmid navrhovaný vynálezem popisuje heterologní gen, nebo inzerční místo heterologního genu, pod kontrolou dvou odlišných sekvencí regulujících expresi: zvířecí regulační sekvence a virové regulační sekvence. Termín „pod kontrolou“ je použit v obvyklém významu, tzn. funkčně nebo operativně spojený s, ve smyslu, že regulační sekvence, jako je promotor, ovlivňuje expresí heterologního genu. V preferované variantě je zvířecí regulační sekvence savčí promotor (navrhovaný vynález však zahrnuje i ptačí promotory), konkrétně, promotorem může být velmi časný promotor cytomegaloviru (CMV) (viz Obr. 7). V jiné konkrétní variantě může být jako virový promotor použit časný promotor viru vakcinie, nebo pozdní promotor viru vakcinie, nejlépe pak oba (Obr. 7). Subjekt může být vakcinován podle střídavého protokolu bifunkčním plasmidem a zároveň, ale v jiném časovém schématu v libovolném pořadí, rekombinantním virem vakcinie, nebo obojím. Tento vakcinační protokol může být doplněn aplikací rekombinantních proteinů vakcinie (infra), nebo může být použit s jinými vakcinačními prostředky.

Jak si každý odborník uvědomí, bifůnkční plasmidy navrhované vynálezem, mohou být použity jako vektory polyenv vakcíny. Tedy, inzercí alespoň 4 až 10 000, lépe pak 4 až 1000, nejlépe 10 až 100, odlišných HIV env genů do bifunkčního plasmidu, vznikne odpovídající sada bifůnkční ch plasmidů použitelných jako polyenv vakcína.

Rekombinantní virové vakcíny

Aktivní imunita vyvolaná vakcinací s HIV env proteinem nebo proteiny dle navrhovaného vynálezu , může zvýšit nebo zesílit buněčnou nebo humorální imunitní odpověď. HIV env protein nebo proteiny, či jejich antigenní fragmenty, mohou být pro přípravu vakcíny smíchány s adjuvans.

Termín adjuvans označuje látku nebo směs látek, která zesiluje imunitní reakci na antigen. Adjuvans může v tkáni sloužit jako zásobník, který pomalu uvolňuje antigen a zároveň jako nespecifický aktivátor imunitního systému zesilující imunitní odpověď ( Hood et al., Immunology sec. ed. 1984, Benjamin/Cumings: Menlo Park, Califomia, p. 384). Ve většině případů, by první aplikace antigenů bez adjuvans nevyvolala dostatečnou imunitní reakci. Jako adjuvans se používají např. kompletní Freundovo adjuvans, nekompletní Freundovo adjuvans, saponin, minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky jako je lysolecithin, pluronic polyoyly, polyanionty, peptidy, olejové nebo cukerné emulze, hemocyanin mořských přílipek, dinitrofenol a potenciálně použitelné lidské adjuvans jako je BCG (bacille CalmetteGuerin) a Corynebacterium Parvum.Výběr adjuvans je závislý na subjektu, který má být vakcinován. Pokud možno, jsou používána farmaceuticky přijatelná adjuvans. Například při vakcinaci lidí není vhodné použít oleje nebo cukerné emulze včetně kompletního a nekompletního Freundova adjuvans. Příkladem adjuvans použitelného pro vakcinaci lidí je alum precipitát (hlinitý gel). V konkrétním případě, infra, rekombinantní HIV env protein je podáván intramuskulárně v aluum precipitátu. Samozřejmě, že HIV env rekombinantní proteinové vakcína může být podávána subkutánně, intradermálně, intraperitoneálně, nebo jiným přijatelným způsobem obvyklým pro vakcinaci.

Podání vakcíny

Dle vynálezu, může být imunizace proti HIV prováděna pomocí samotné rekombinantní virové vakcíny navrhované vynálezem, nebo v kombinaci s DNA vakcínou nebo rekombinantní proteinovou vakcínou, nebo s oběma. V konkrétním případě, rekombinantní HIV env protein v aluum precipitátu je použit i.m. k zesílení imunitní odpovědi.

Každá dávka virové vakcíny může obsahovat 4 až 10 000, lépe pak 4 až 1 000, nejlépe pak 10 až 100, odlišných forem rekombinantního viru, kde každá varianta obsahuje jiný HIV env gen. V jiné konkrétní variantě vynálezu, následné polyenv virové vakcíny mohou mít některé viry společné a jiné odlišné vzhledem k předchozí vakcíně. Například, první vakcína může obsahovat viry vakcinie exprimující HIV env proteiny náhodně označené 1 až 10. Druhá (zesilující) dávka vakcíny pak může obsahovat viry vakcinie (lépe pak jiného viru, jako je virus kanáři ch neštovic, nebo adenovirus) exprimující varianty HIV env proteinu označené 6 až 15 nebo 11 až 20 atd. DNA vakcína nebo rekombinantní proteinová vakcína může být složena z jednoho HIV env proteinového antigenů, nebo mnoha variant antigenů. Je preferováno aby DNA vakcína nebo rekombinantní virová vakcína navrhovaná vynálezem obsahovala více než jeden HIV env proteinový antigen. Stejně jako u následných virových vakcín, HIV env protein nebo protein kódovaný DNA vakcínou nebo rekombinantní proteinová vakcína může být stejná jako HIV env protein exprimovaný v polyenv virové vakcíně, nebo se může částečně či zcela od něj odlišovat. Shrnuto, preferovaná varianta vynálezu představuje použití co největšího možného spektra možností v každém vakcinačním protokolu tak aby byl objekt vystaven maximálnímu počtu variant HIV env proteinu a měl tedy co možná největší šanci vyvinout neutralizující křížovou reaktivitu proti naivnímu HIV izolátu.

Varianty obalového proteinu

Jak bylo řečeno výše, EPV použitelné jako složky vakcíny navrhované vynálezem, mohou být získány z geograficky podobných izolátů, nebo z izolátů z geograficky odlišných lokalit. Jak si každý odborník uvědomí, získání nukleotidů kódujících env (genů) z přirozených izolátů, má řadu výhod: izoláty jsou snadno dostupné, EPV odpovídají přirozeně se vyskytujícím proteinům proti kterým je třeba indukovat imunitní reakci a nové mutace HIV mohou být zachyceny okamžitě z čerstvých izolátů.

Zkratka EPV také zahrnuje polypeptidy s imunogenní aktivitou danou jejich aminokyselinovou sekvencí podobnou epitopu či antigenní determinantě EPV. Tato aminokyselinová sekvence se značně podobá alespoň jednomu z 10 až 900 aminokyselinových fragmentů a/nebo odpovídá sekvenci známého HIV EPV. Tyto EPV mohou mít celkovou homologii nebo identitu jak alespoň 50 % vzhledem ke známým aminokyselinovým sekvencím obalového proteinu, tak 50 až 99 % homologie nebo libovolnou hodnotu v tomto rozmezí, aby indukovali imunitní odpověď proti alespoň jednomu kmenu HIV.

Procento homologie může být určeno například porovnáním sekvence pomocí počítačového * programu GAP, verze 6.0, dostupného od University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Program GAP používá porovnávací metodu podle Needlemana a Wunsche (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), upravenou dle Smitha a Watermana (Adv. Apl. Math. 2:482 (1981)). Zkráceně, program GAP definuje podobnost jako počet seřazených symbolů (např. nukleotidů či aminokyselin), které jsou shodné, děleno celkovým počtem symbolů v kratším z řetězců. Preferované předvolené parametry programu GAP zahrnují: (1) jednotné porovnání matrix (s výstupní hodnotou 1 pro podobné a 0 pro odlišné sekvence) a vážené porovnání matrix dle Gribskova a Burgesse (Nucl. Acid Res. 14:6745 (1986)), jak bylo popsáno Schwarzem a Dayhoffem (eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reserch Foundation, Washington, DC (1979) (2) odečet 3,0 pro každou nekomplementaritu a další odečet • · ► « «

• Μ • 0 0 0 • 0 · • ·»♦ • 0 «00 «0 ··

9

0 t

♦

0 0 0 00

00 0 0 0 * β 0 0 0 «00 0 0

0 0 • 0 00

TABULKA 1: varianty obalového proteinu	. 30		t-	H	X	>*
	cn	O		-	£->
co	2	o	-		W
r-	OS	X	X
co	2	t-
in	o
	3:	M	ϋ.
	□S	2		-	cn
CN			-
r-t		2	α	2	w
20		X	2	o	ctí	o
	cn	o	CM	2	PS	s
oo	2	O	>·	3:	Q
Γ-	2	2	tn	ω
Ό	X	Ctí	Uí	o	H
tn	O	Ctí	htí	o	ω
	cn	E-	w	X	us
ro	M	O	X
CN	2	X		p;
γΗ	>
O rH		OS	X	C-.	HI
	cn	X
co	<
Γ'	>	X
co	t-
tn	US
N*	o
	ω	US
CN
•H		ω
	Ή

o co	f-	ω	>	2	<
	cn
	CD	w	Q
	r-	2	ω	X
	co	2
	tn	>	hi
	M·	£b
	rq	>	w
	CN	C5
	rH	ÍH	cn	<
os
	cn	>
	00	V
	r-	>
	CO	5c	>1
	tn	.J
		2	o	Q	2
	m	ω	U)	σ	O	>
	CN	H	>		w	2
	rH	<	>	o	HC	2
o ΧΓ
	cn	ω	u
	00	o	cn
		H	t-i	CM	o
	co	X	Ht	t-l	CM
	tn		Hi	X	E-
		o	2	M		rC
	rO		Cl	<·	X	Hi
	CN	J	hí	X	<	E-
	·—(	X			M
	r—C rn

1 06	CM
	cn	Q	2	O
	oo	H
	Γ	P*
	co	>
	tn	o
	•φ
	m	X		cn
	CN	H	cn	2
	r4	<
O G0		2	O
	cn	>	Hi
	00	S2S	2
	r*	X
	co	>	<	«	O	2
	tn	ω
		H	PS	<C	US	CM
	m	O	cn	2	<	«
	<N	>·	X
	T—1	<	H	cn	o
O r-		US	OS	2
	<n		ctí
	oo	Q	ω
	r·	cn
	CO
	tn	o
	N*	Cl
	PO	►J
	CN	E-	>
	r-i	Ε-·
	r*Í co

* • · * ·· · · « • ·«' * ♦ • * · • •4 «4 ί» 4 ·· ·· • 4 ♦ · * • « *· « « 44*4 4 ♦ 4 4

0,10 pro každý symbol v každé nekomplementaritě a (3) žádný odečet pro koncové nekomplementarity.

V preferované variantě vynálezu, EPV navrhované vynálezem jsou varianty alespoň jednoho obalového proteinu viru HIV. Je preferováno aby EPV zahrnovaly gpl20 a oligomerizační doménu gp41 stejně jako gpl40 (Hallenberger et al., Virology 193:51-514 (1993)).

Známé obalové proteinu viru HIV obsahují od 750 do 900 aminokyselin. Příklady těchto sekvencí jsou dostupné z komerčních a institucionálních HIV sekvenčních databází, jako je GENEBANK, nebo z publikovaných kompilačních prací, jako je Myers et al., Human Retrovirus and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I and

II., Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Substituce a inzerce do EPV vedoucí k získání dalších EPV, kódovaných nukleovými kyselinami, pro použití v rekombinantním viru nebo polyenv vakcíně dle navrhovaného vynálezu, zahrnují substituce nebo inzerce alespoň jedné aminokyseliny (přesněji 1 až 25 aminokyselin). Je samozřejmě možné provést deleci alespoň jedné aminokyseliny (přesněji 1 až 25 aminokyselin) z řetězce EPV. Je preferováno aby tyto substituce inzerce a delece byly identifikovány pomocí určení sekvence obalových proteinů získaných nukleotidovým sekvenováním alespoň jedné nukieové kyseliny kódující EPV získané z jedince infikovaného HIV.

Nelimitující příklady těchto substitucí, inzercí a deleci mohou být vyrobeny amplifikací DNA a RNA sekvencí kódujících env protein, získaných z pacienta infikovaného HIV-1, a mohou být determinovány běžnými metodami k určení strukturních a funkčních vlastností obalového proteinu nebo EPV. Získané EPV mají pak většinou jiné antigenní vlastnosti než původní EPV. Tyto antigenní vlastnosti mohou být určeny vhodnými metodami např. testováním na panelu monoklonálních protilátek specifických pro obalové proteiny viru HIV pomocí ELISA techniky. Jakékoliv substituce, inzerce, či delece jsou přijatelné dokud výsledný EPV protein indukuje produkci protilátek které se vážou na obalové proteiny viru HIV, ale odlišují se od spektra protilátek indukovaných jiným EPV. Každá z výše popsaných substitucí, inzercí nebo deleci může také zahrnovat modifikovanou nebo neobvyklou aminokyselinu, např. jak je popsáno v 37 C.F.R. § 1.822(2).

Následující Tabulka 1 představuje nelimitující příklady alternativních variant obalových proteinů viru HIV, které mohou být kódované rekombinantním virem dle navrhovaného vynálezu.

< fcfc *· fcfc fcfc *· • fc · ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 19 9 9 9 9 9

999 9 9 9 4f 9 9 999 9 · • fc fcfcfcfc 9 9 9

9 99 99 99 fcfc fcfc

O CN rd		Hd
	σ\	►—I	>
CO	Q
Γ'	ω	E-|
KD	z	O·
tn	2
*7*	O
m	ω	Q	Z
CN	>
rd	2	n
I οττ |		Q	z	cn	>1
th	Z
GO	Z	ctí	H
r-	X
KD	2	hd
in	Z	a
*3*	Ul
m	z	w	Z	Q	Z
CN	w	o	Q
rd	E-
O o		>
	cn	Z	cn
co	>	o	W	(X
r-		2
KO	>	U	>i	Q	z
tn	>	M	►4	2	u,
'j*	ω
m	OI	z	(X	><
(N	Cb
r—i	z	Q	tn	H
	rd Ch

150 1	z	ω	Η	M	tn
	ch	E->	ω	2
	00	Q	<	O
	r-	Z	Ε-·
	KD	Z	H	O	«
	m	.□	>	>	X	Cn
		Q	Z	Z	OI	z
	cn	H	tt	w	z	o
	CN	O
	rd	z	z	Q	tn	M
o		►q	2		·.
	<h	cn	E-<	Z	o
	GO	>
	r*	o	>
	KO	►4	O
	tn	Oi	►4
	n*
	cn	►4	2
	CN	Z	>	cx
	rd	>	ω
o m		o
	<h	Ol
	00	z
	r>	►4
	KD	tn
	tn	o	ω
	n*	o	Μ
	m	z
	CN	J
	»—t	z	Z
	rd CN rd

O oo rd		cn	o	z	w	ω
	ch	E-	tt	Ol
	00	tn	H
	r-	M	>	σ	2	H
	KD	z	Z		Ol
	tn	Cn
	rř	cn	Oi	E-	ω
	m	o
	CN	z	tt
	rd	z	H	Ctí	o
170		M	2	>	«
	<h	ω	Z	o	o:	►4
	co	o	w		cn	z
	r-	ω	o;	Ol	o	z
	KO	ω	Q	Ό
	tn	2	w	Ε-·	hd	>
		w	ω	Z
	cn	Z	ttí	ω	>	E-i
	CN	(X	tt	z	X	o
	rd	o	X	cn	Ol
O KO		3:	z	w	tn
	ch	cn	z	E-<
	00	tn	E-i	>	o
	Γ-	tn	H	Z
	KO	H
	w	>	Z
	-	X-.	tn
	cn	z	tn
	<N	tn	tt	ω
	rd	H	z	M
	rd m Ή

φ-φ φφ Φ Φ • φ φ φ φφφ φ φ φ φφφ φ φ φ φφ

I Φ Φ Φ <

φ φ « φφ φφ φ φ φ φ » φφφ φ φ φ φ φ φ φ · «φ ··

1 2101

Q

<

tn

240 I

ω

O

o

270

2

σ»

Z

Q

E-

cn

σ\

tq

<h

H

X

X

cn

06

co

X

co

cn

H

CD

O

Γ-

Ch

r~

>

M

H

Γ

Oí

σ

cn

f-<

M

to

cn

'Z.

to

X

to

o

ω

m

Q

M

tn

Ch

cn

tn

t->

χ

cn

η*

2

Q

•ď

u

n<

o

rq

O

ω

m

<

m

2

cn

ω’

cn

X

O

2

o

CN

o

<N

tq

r4

Q

X

O

ω

z

rH

H

X

E->

X

ω

o

σ

| 200

M

>

U

[ 230

w

>

►J

•

260 j

X

ta

ω

ch

&

σ

X

«

z

<h

>

<

H

Ch

2

Q

Ui

co

H

>

Σ

tn

CD

cn

£->

00

2

X

05

r-

H

>

r-

H

oi

cn

Γ

U

Q

to

Z

cn

Q

to

X

in

/1

X

E->

o<

tn

tn

o

tn

/5

Eq

’Ο’

ta

Z

05

>

N4

cn

X

2

t-

M*

M

X

rn

ΪΗ

05

X

Z

m

H

H

m

<

>

CN

Ct4

u

CN

W

CN

tq

:»

-H

Cq

u

H

X

rd

H

05

w

X

Σ

r—1

o

) 190

<

cn

t-

I 220

Cq

X

1 OSZ

<

H

ch

><

2

05

cn

X

Ch

s

2

Ch

ta

o

CD

ω

Q

>

o

CD

u5

H

05

o

CD

H

r«

X

O

05

H

r-

ΪΧ

r*

o

co

σ

ta

X

w

to

cn

Z

to

>·

Eq

X

tn

>

n

Σ

X

o

tn

f->

tn

X

χ

05

O

ω

n*

2

w

Xř

M

Σ

m

o

Q

2

m

Η

2

m

O<

X

CN

Cti

O

iii

cn

CN

H

cn

CN

M

—-í

w

J

>

05

iii

r-t

cn

cn

r-4

Ch

181

211

241

• Φ φφ φ φφφφ φ φφφ φ φ φφφφ φ φ φφφ φφ φφ

ΦΦ ·Φ • · φφφ • · φ · φφφ φ φ φ φ φ φφφ • φφ ·♦

ο ο m		>		ctí	Μ	Σ
	σ\	>	Μ	Ω	ο
00	W	ο	Ctí	X	Ω
θ'	ω	ο	X	ca
ιο	ω	X	ca
ΙΛ	fť	W
Τ'
Ο)	co	Η
04	ο
<Η	2
290		Ω	Μ	cn
Ch	Ω
00	Ω
Γ*	σ	X
ΙΟ	Η
ιη	cn	Η
τ’	>
m	>	Η	Ε-<
OJ	CM
r-1	Ctí	btí	ω
Ο 00 04		H
ch	ο
00	κ
θ'	Η
νο	Ο
ιη	Ο	Η	X
τ’	>	α
Ο)	Η	ω	>
OJ	C0	Η
r4	>	ΚΙ
	271

Ο Γ3 ΓΟ		2	W	ití	>·	σ
	σ\	2	ω		ω	X
οο	X	W
θ'	ca
ιο	Ε-	Η4		«	X
ιη	ο
Τ’	2	>	Ε-	2
m	Μ	>
04	ω		Ο	>	Η
γΗ	>	Μ	Ω
Ο 04 m		ω	X	Ε-
cn	σ	W		Ω	Η
00	2	X
Γ*	Ω
1X5	ο	X	Η
ιη	>	*ť
τ’	W	Ω	>
η	Μ	2
04	Η	Μ	2	>
γ—1	X	Ctí	Ω
1 310 ί			>	Η	Ο	►Μ
(Λ	2	ω	Ο
CO	Ω	2	ω
θ'	Η	ω	2	«:	Ω
ΙΟ	X	Μ	Ω	ftí	X
ιη	2	α
Τ’	<	Ω	W	cn	X
m	cn	Ο	<	>
OJ	Ctí	2
rH	ΗΊ	U	>	2
	301

ο ΙΟ m		<
	ch	ο	X	Ω	Ctí	>
CD	Ctí	O
	2	κ	Ω	cn	E-i
10	2	Ω	2	H	M
ιη	Ο	cn		X	2
Τ			Ctí	>	<
η	ř-H	ití	co*	O	>
04	X	Ctí	σ	Ω	<
rH	ο	Ctí	X	Ω	«
I 350		W	£-<	X	Ω	2
Ch	Η	*C	>	Ctí	2
00	>	X	><	ii*	M
θ'	X	H	X	>
ιο	#χ	>	£-<	cn	&
ιη	X	c*	X	2
Τ'	ο	X	Ctí	2
η	X	X	cn	Ω
OJ	ο	<
«—ι	Ctí		ω
Ο τ* CO		ο	X	λ	><
ch	Η	X	2	Ω	ω
00		X	X
θ'	Ctí	>«	><	X	Ctí
ιο	H
ιη	cn	Ctí	2		o
Τ’	X	Ctí	C3	α
ΓΏ	Ctí	2	cn	X	>
OJ	Η	>	btí	Ctí	w
ί—1	2;		><	H	cn
	331

I

·· • fcfc fcfc ·· · · · · • · · · · • ··· fcfc · • · * · • fcfc ·· ·· • fc fcfc • · · · · · •fc · · ·· • fcfc ··· · · • fc · · · •fc ·♦ ··

o σ» m		M	>	E->	ε
	<h	£-	σι
co	X	o	X
Γ-	Z
to	Z	Q
tn	0	X	Q
M*	CU	>-	J	tn
m	o		X	o:
d	ω	X		>
r-i	X	X	Ol	o	►H
o GD m		►4	£m
th	X	to	Ol	X	M
GD	cn	X	Η	w	Ctí
r*	Q	>
to	M	>	.4	H
tn	α	0	X	CK	►4
	x	ω	Ol	ω	z
ro		M	>
d	H	>	<	Hl
r~l	Z		X.	Ctí	Q
I 370		Z	x	Cn	w	Cu
ch	X
00		σ	Q	z
Γ'		ω	H	X	01
to	Oí	o	X	ω	<
in	cn
M*	M	•j	>
m	z	i*í
d	o
i—|	X	><
	361

420 1	0	O	z	X
	Ch	£-	cn	<c	Ctí
	GD	W	H
	Γ-	Z	Q
	to	0
	tn
	’Τ	Cu
	m	Cu
	d	ω	Q
	f-4	o
410		0	0$	>	pt	ω
	Ch	0	>
	GD	z	n	<s
	r-	Cu	J
	to	tn	z		X	X
	tn	X		J
		H	X		X
	m	>		W
	d	K	>
	r-f	ω
0 0 Tť		cu		K	>	Ol
	<h	Q
	CO	O	O
	r*	O	u
	to	cn
	in	tn	X	cu	0	H
	n·	Ol	X	cn	X	Z
	m	X	z	t-		cn
	d	Cu	ω	u
	r-1		>	z	<	X
	«—1 ch m

0 tn n*		Ctí	z
	Ch	O
GD	cu	Ol	►4	Q
r*	►4	a
to	E-	H	>	X
tn	w	J	>
M*	H	z	cu	u	cn
m	Q	z	0'	cn	Ctí
d	cn	z	ω	(X	X
rH	O	ω	X		cn
0		ω	X	o	0
	th	H	X	0	z	0
GD	*z	0	0	cn	H
P	z	w	0		Q
to	cn	z	Q	0	►4
tn	0	X	X	O	X
	ítí	ω	M	H
cn	t-l	H	CU	Z	0
d	cn	0	Q	X
r*H	x		Q	X	X
0 m		f-	X	0	cn
	ch	w	z	>	o
co	z	►4
Γ	Cu	Ctí	Z	cn	0
<O	X	><	O	Cu
tn	t-	w
M·	cn	z		0	c
cn	z	cn	Q	f->
d	Cu	Q
i-H	u	X	w
	H d n*

·· • 4 «4

4 4 4 4 4

4 * 44

444 4 4 · 4 <

4 4 4 4

44 44 44

4 4 4

4 «4 • 44 4 4 «4 4

44

O co xř		M
	<h	z
co	ω
	w	w	ω	>	E-
CO	o	G.
tn	ca	W
	HC	J
n	o	>	ω	£-*
CN	o	o:
r-<	w	o	o	bi	ω
O r· M·		n	b.	ÍH
ch	Oi
00	Οι
Γ	<	Q
to
tn	E	E-		w
N*	<	w
m	Z	Ol	o:
<N	O	Ctí
rd	>	E-	<
o		ω	o	ctí	z	>
		σ
co	χ
Γ'	Ε	H	K	ω	j
CO	Z	Ctí	ití
tn	n	>
n*	M	b<
m	o	ω
CN
r-(	w
	Ή tn ’Τ

O r-1 tn		Z	M
	<7t	Q	z
00	α	w
r·'	s	w
to	Q	z	ω
tn	O
n·	O
m	O			>	n
CN	Gi	J
r4	Ctí	w
500		Ch	M
£Λ	w	>	E-<
00	ω	>		►4
r-	ω	ř-	ω	z	w
to	«	Q	o	ctí	E-
tn	z	V)		x;
Xř	z	E->	cn	<
m	ω	O	z	H	Q
CN	z	Q	w	O	ω
rH		H	ω	Q	o
O σ\		o	>
	σ»	o	w
00	Q
r·	Ctí	cn
tO	H	>	ω
tn
*5*	J	M
m		E-	Ht
<N	O
r-t	E-
	00

o Ν’ tn		Ctí
	σ\	cx	w		X	Z
oo	>	Σ	H
o	>	H
to	ctí	Gi	z
	tn	Ctí
	Ν’	ití	«	ω	<
m	<	co	Oí	E	M
	CN	Xí	K
«-Μ	Ε-·	O)
1 530 1		CM
Ch
00	>	M
r-	o	«
to		H	tu
tn	Gi	>q	H
ν»	w	b!
m	H	>
CN		Ctí	H	O	ω
«—I	>	M
o CN in		>	Q
ch
00
r~	bJ	Z
to		Ch
tn
n*	ω
m	w	z
CN	&	t—<
r-i	X	Ctí
	511

•η

«4 • · * · · • · 4 44 • 4«4 · 4 44 4

4 · 4 4 4

444 44 44 44

4» · ·

4 4 4 » 44

444 4 4 • 4 4

44

O VO VO		H	Σ
	cn	Σ	H	z	z
00	Z	ttí	x	H
r*	Z	Q	co	O	3
VO	3
in	K	Cu
	Ol	Q	z	co	btí
m	ω	Q	2	co	ití
ΓΊ	JI	Σ	o	>	Ctí
rd	CO	H	z	co
1 650		z	Ol
σ\	z	Ctí
00	co	o	co
Γ-	3
VO	co	H	<
tn		CO	tu	z
xf	z
cn	3
CN	CU	z
w	>
o VO		<	H	z	X	to
<h
00	E->	CU	>i
r-	CJ
VO	M	>
tn	»4	£h	X	M
xf	Z	Ctí
cn	CO
m	co	:tí
·—c	CJ	Ctí
	631 I

o Ch VO		ω	a	>
	Ch	z
00	z	H	o	K
r*	ω	co	Q
VO	o
cn	Ol
xf	2	M	E-«	Q	>
cn	o	<
04	co	<c
rd	w	o	a	Z
1 6»°		ω	H	OI	•
Ch	w	►4
00	►J	H	& 5
r-	co	H	z
vo	X	><	tu
tn	n
xf		£-<	H	>	ω
m	co	Z	co	Q	z
CN	H	co
r—t	>	>	M
I 670 |		Z	ω	z
<h	Z	Q	to	CO
00	M	>
Γ	ω	u	X	Ol
vo	Ctí	z	Ol
to	Q	ω
xf	3
m	ω	a	z
n	Σ		M	Ol
r—4	3
	661

720	Σ	H
	th	H	>
	00	tl<
	r-	►4	M
	VO	z	Ctí
	LO	H
	xf		to
	cn	3		-
	<N	►4
	rH	3
O rK f-.		Z	Ol	z
	Ch	H	co
	00	H
	O-	2	co	C3	Q
	vo	tu	co	><	J]
	tn	3
	xf	Z	w
	cn	3
	Ol	JI
	rH	CO	z	O
700		c		Z
	th	2
	00	z	ω	to	Ol
	C	Q	2
	vo	J
	tn	to	O		ítí	Ol
	Xf	►4
	cn	►4
	cn	ω	a	<	z
	r—4	cx	j	ctí	2
	«Η ch vo

• BB ·· ·· *Β ΒΒ

ΒΒ · Β Β Β Β Β ΒΒΒΒ • Β Β Β Β ΒΒ Β Β ΒΒ

Β ΒΒΒ Β Β Β Β Β Β ΒΒΒ Β Β Β Β ΒΒΒΒ ΒΒΒ

ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ

Ο ΧΤ 03
	α\	ω
C0	o	X	m
ρ*	w	w	o	E->	u
to	z
ιη	ΪΜ
*3*	O
ΓΟ		>		H
C4	J	>
rH	z	w	<	O
I 830		z	o	c
σ\	z		υ	O
C0	:*	►4	w
Ρ*	X	ní
<0		M	υ
ΙΛ	«ί	o	w	>	(X
	ω	Q	Z
m	z
ρι	o	►4	H4
r™t	ní	O	►4
| 820		ctí	w	»4
<h	o	X	ní
co	>4
ρ-	►4	w	H	>«
<o	ω	Q	w	X
tn	>	w	►4
5J·	M	H			>
m	m	ití
Pl	H	<	>	z	X
f—4	>	<	M
	811

o Γ- ΟΟ			u		o	>
	O\	«ť	1-4	£-.	>	Cx.
00	o	ní	<
p-	Ol	ní
to	>
tn	>	H	O
5J*	ω		<
m	ΗΗ *
Pl	>	M	<
f-l	«	o	X
098 |		Q		•
<h	L·
00	O	w'	ní	z
p-	W	o	z
to		H
tn	>
xr		>	w
ΓΊ	H	>
Pl	<
r4	t->	n	>	*4
O tn 03			H
<h	Z	Q
CO	J	tu	>
P~	J	z	tu
to	w	z
tn	>	M	ω	H
		>	íu
m	cn
Pl	z	M	w
T—1		ní	Ol
	841

ch oo	•4	σ	>
	00
	P-	H4	u		ní	w
to	ní	o
tn	ω	X
tr		b.
m	o
PJ	o
«—1	Dí
088 |		W	>
<n	Clí
00	n;
p-	Oi	K
to	H	>
tn	X	Z
	n:	►4	H
m	►—4	tu	>
Pl	<	o	M
«-4	ní	o	H
	871

·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · ··«· ··· ···· ····

Λζ · ··· · · · · · · ··· · ·

2j · ····· · · · <·· ·· ·· ·· ·· *·

Stejně tak, dle výše uvedených příkladů specifických substitucí, alternativní substituce mohou být připraveny pomocí běžných postupů tak aby vznikly další EPV dle navrhovaného vynálezu, např. uskutečněním jedné či více substitucí, inzercí nebo delecí v obalovém proteinu nebo EPV tak aby byl umožněn rozvoj další imunitní odpovědi.

Variace v aminokyselinové sekvenci EPV dle navrhovaného vynálezu, mohou být vytvořeny např. mutací DNA. Tyto EPV představují například deleční, inzerční nebo substituční varianty s nukleotidy kódujícími odlišné aminokyseliny v dané aminokyselinové sekvenci. Je jasné, že mutace uskutečněné v nukleových kyselinách kódujících EPV nesmí obsahovat sekvence mimo daný čtecí rámec a pokud možno by neměly vytvářet komplementární domény které by umožnily mRNA vytvářet struktury sekundárního řádu (viz Ausubel (1995 rev), infra, Sambrook (1989) infra).

Nukleové kyseliny kódující EPV mohou být , dle navrhovaného vynálezu, připraveny amplifikací nebo cílenou mutací nukleotidů v DNA či RNA kódujících obalový protein nebo EPV a následně syntetizovány nebo pomocí reversní transktriptázy přepsány do DNA tak aby vznikla DNA či RNA kódující EPV (viz Ausubel (1995 rev.), infra, Sambrook (1989), infra) dle návodů a rad zde popisovaných.

Rekombinantní viry exprimuj ící EPV dle navrhovaného vynálezu, rekombinantní EPV nebo tyto kódující vektory složené z nukleových kyselin, včetně konečné sady EPV kódujících sekvencí jako substitučních nukleotidů, mohou být vyrobeny každým odborníkem v oboru, bez velkých pokusů, podle návodů a rad zde popsaných. Detailní popis proteinové chemie a struktury uvádí Schultz G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978) a Creighton T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). Pro presentaci substitucí nukleotidových sekvencí, jako jsou výběry kodónů, viz Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Assoc., New York NY (1987,1988,1989,1990,1991,1992,1993,1994,1995) dále jen “Ausubel (1995 rev.)”, v §§A. 1.1-A. 1.24, a Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) v Dodatcích C a D.

Tedy každý odborník v oboru s pomocí návodů a rad zde uváděných, bude schopen substituovat jednu aminokyselinu za druhou v dané pozici DNA nebo RNA kódující protein env, tak aby získal alternativní EPV, včetně substitučních delečních nebo inzerčních variant.

Φ «·

ΦΦΦ · φ • · » <

k « • Φ

Způsob určování HIV aktivity

Pro určení anti-HIV aktivity séra nebo buněk získaných ze zvířat individuálně imunizovaných vakcínou dle navrhovaného vynálezu, může být použita jakákoliv známá a/nebo vhodná metoda, tak jak je to běžné v praxi. Známé HIV metodiky jsou například metoda virové infektivity ( viz Chesebro et al., J. Virol. 62:3779-3788 (1988), Aldoviny et al., eds., Techniques in HIV Research pp 71-76 (1990)), neutralizační technika (viz Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:645-648 (1994), Laal et al., Res Hum. Retrovir. 9:781-785 (1993) Hanson J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)), Technika periferních mononukleárů (PMN) (viz Arduino et al., Antimicrob. AgentsChemother. 37:1095-1101 (1990)) a cytotoxický test (Hammond et al., J. Exp. Med 176:1531-1542 (1992), McElrath et al., J. Virol. 68:5074-5083 (1994), Walker et al., Cell Immunol. 119:470-475 (1989), Weinhold et al., AIDS Res. Hum. Retrovir.8:1373 (1992)). Další vhodné měřitelné parametry, jednotlivě, nebo v kombinaci, mohou být např. kvalitativní a kvantitativní měření transkripce, replikace, translace, inkorporace virionu, virulence, virového výtěžku a/nebo morfogeneze.

Konkrétní varianta: Rekombinantní virus vakcinie kódující EPV, polyenv vakcína a způsob jejich výroby a použití.

Přehled: Rekombinantní viry vakcinie (VV) exprimující HIV env proteiny (např. gp41, gpl20 a/nebo gpl60, nebo jejich části) představují materiál použitelný pro produkci a testování směsné vakcíny indukující buď alespoň humorální nebo buněčnou imunitní odpověď proti viru, stejně jako pro analýzu B buněčných a CTL determinant.

Polyenv vakcína, navrhovaná předloženým vynálezem, se skládá ze směsi n odlišných rekombinantních virů vakcinie, kde n je celé číslo od asi 4 do přibližně 10 000 ( nebo jakéhokoliv rozmezí uvnitř této množiny), kde každý vektorový konstrukt exprimuje variantu obalového proteinu viru HIV-1 (např. gp41, gpl20 nebo gpl60). Rekombinantní virus vakcinie funkčně kóduje EPV a je připraven rekombinací divokého viru vakcinie s plasmidem. Mnoho odlišných plasmidů kódujících EPV může být připraveno substitucí jedné sekvence kódující EPV jinou sekvencí, např. za použití restrikčních fragmentů nebo mutagenezí.

Příprava rekombinantního viru vakcinie: Metoda přípravy individuálních plasmidů (každý exprimuje jedinečnou sekvenci proteinu viru HIV) může využít amplifikaci jak DNA tak RNA pro substituci izolované varianty sekvence kódující obalový protein do vektoru (např. pVenv4 nebo pVenvl (Hallenberger et al., Virology 193:510-513 (1993)), který kóduje známou sekvenci • · · · · · · ·· ·· ·· ♦ · · • · · · · · •· ·· ·· pro obalový protein viru HIV (např. dostupná v NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD).

Metody amplifikace DNA a nebo RNA jsou velmi dobře známé a mohou být použity dle navrhovaného vynálezu, bez velkých omylů, podle zde uvedených návodů a rad.Známé metody amplifikace jsou například polymerázová řetězová reakce (PCR) a odvozené amplifikační procesy (viz U.S. patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, Mullis et al., 4,795,699 a 4,921,794 Tábor et al., 5,142,033 Innis, 5,122,464 Wilson etal., 5,091,310 Innis, 5,066,584 Gyllensten et al., 4,889,818 Gelfant et al., 4,994,370 Silver et al., 4,766,067 Biswas, 4,656,134 Rigold) a RNA zprostředkovanou metodu amplifikace která používá anti-sens RNA proti cílové sekvenci jako templát pro syntézu dvojřetězcové DNA (U:S: patent No. 5,130,238 Málek et al., s obchodním jménem NASBA).

Například rekombinantní konstrukt viru vakcinie připravený tímto způsobem může být použit pro imunizaci a indukci HIV specifické T a/nebo B buněčné odpovědi. Jako priméry jsou použity konzervativní sekvence a tudíž je možné úspěšně amplifikovat env geny z mnoha odlišných vzorků získaných od HIV-1 infikovaných pacientů. Základní technika zde popsaná může být podobně použita pro PCR nebo jiné typy amplifikačních primérů, tak aby bylo možno nahradit menší nebo větší části env sekvence z objemného izolátu za ty přítomné ve vektorech kódujících obalový protein viru HIV, viz Ausubel, infia, Sambrook, infra.

EPV kódující nukleové kyseliny: Technika vychází z izolace DNA z buňky nakažené virem RNA a amplifikace env sekvencí pomocí PCR. PCR nebo jiná amplifikační metoda představuje nejjednodušší způsob izolace HIV sekvencí, je však samozřejmě možné použít jakékoliv jiné vhodné metody, jako je například klonování a izolace nukleových kyselin kódujících EPV, nebo EPV proteinů (viz Ausubel, infra, Sambrook, infra). Restrikční místa pro enzymy jsou většinou uvnitř sekvencí PCR nebo jiných amplifikačních primérů, pro usnadnění klonování genu. Izolovaná DNA pro PCR může být izolována z mnoha virových zdrojů včetně čerstvé nebo zamražené krve HIV+ pacientů a buněk, které byly infikovány in vitro izolovaným virem.

Jelikož cílem je produkce nových HIV env konstruktů, polymerázová řetězová reakce (PCR) je většinou použita k amplifikaci 100 až 2 700 párů baží (bp) z env genu, pokaždé z různých pacientů. PCR primér musí být dobře konzervovaná HIV sekvence, vhodná pro amplifikaci env genů ze známých vzorků env genů, izolovaných z různých virů HIV nebo HIV pacientů.Amplifikovaná DNA pak obsahuje části kódující 10 až 900 ( nebo 100 až 400, 400 až 600, 600 až 900 a nebo libovolné rozpětí v rámci daných hodnot) aminokyselin z gpl20 a gp41 (oba tvoří gpl60). Jeden či více variabilních regionů obalového proteinu (VI až V5) a

··· • · • · konstantních regionů (Cl až C5) jsou pokud možno obsaženy v produktu PCR, lépe pak jsou-li obsaženy VI, Cl, V2, C2, V3, C3, V4, C4, a V5 regiony. Navíc může amplifikovaná sekvence obsahovat 1 až 200 aminokyselin mimo štěpitelnou sekvenci pro gpl20/gp41. Pokud je to možné je vhodné amplifikovat celý env gen. Je možné že amplifikovaná sekvence kódující gplóO je ztracená část všech sekvencí kódujících transmembránové domény a/nebo domény cytoplasmatického konce (viz Hallenberger et al., (1994)).

PCR priméry mohou být vytvořeny tak aby restrikční místa obklopily sekvenci obalového proteinu v plasmidu vakcinie tak, že jsou inkorporovány do amplifikované DNA Použitím dobře známé techniky substitučního klonování, mohou být vytvořeny deriváty plasmidu vakcinie, které exprimují varianty sekvencí kódujících obalové proteiny získané od 1 až 10 000 pacientů, substitucí částí pacientovy EPV kódující sekvence za odpovídající část env sekvence v plasmidu vakcinie, stejně jako při použití restrikčních fragmentů pro substituci. Například pVenv4 plasmid a PCR produkt byl inkubován s Knpl a BsmI tak aby byla získána sekvence kódující zkrácený gplóO sl až 639 aminokyselinami, který nemá ani transmembránovou ani cytoplasmatickou koncovou doménu gp41 (viz Hallenberger et al., (1993)).

Po ligaci produktu PCR a pVenv produktu, následuje transformace bakteriálních buněk s ligační směsí pomocí jedné z běžně používaných metod, např. elektroporací, rekombinantní kolonie jsou pak kontrolovány sekvenováním.

Rekombinantní konstrukty viru vakcinie kódující obalové proteiny viru HIV: Viry vakcinie kódující EPV jsou pak rekombinovány s divokým virem v hostitelských buňkách a vybrány jsou plaky obsahující viry exprimující EPV a ty jsou pak uskladněny. Zásobní vzorky virů, stejně jako Vvenv, obsahujících sekvence kódující odlišné EPV, jsou pak smíchány, za použití alespoň 4 až 40 a maximálně asi 10 000 odlišných rekombinantních vektorů tak, aby vytvořily vakcínu navrhovanou předloženým vynálezem.

Rekombinantní plasmidy vakcinie obsahující EPV sekvence, je pak možné sekvenovat nebo testovat pomocí protilátek specifických proti obalovým proteinům viru HIV, tak aby se odlišily jednotlivé varianty. Pro sekvenování je preferována Sangerova metoda použití dideoxy nukleotidů. Metodiku je možné modifikovat od výše zmíněné (Sambrook et al., (1989 infia, United States Biochemical, Sequenase Version 2,0 -DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., (1994)) tak aby bylo možné odečítat přibližně 50 až 300 bp od pozice priméru.

Metody produkce VV expresních vektorů jsou v praxi dobře známé (viz. Mackett, M. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982), Panicali D. and Paoletti E. Proč. Nati. Acad.

• · ·

Sci. (USA) 79:4927-4931 (1982), U.S. Patent No 4,169,763, Mazzara G.P. et al., Methods in Enz. 217:557-581 (1993), Ausubel et al., infřa at §§16,15-16,19). Dříve popsaný pSCll vektor (Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985) je vhodné použít pro výrobu env kódujícího plasmidu, jako je například pVenv4.

Jako virový vektor má virus vakcinie řadu užitečných vlastností, včetně schopnosti umožnit klonování velkým fragmentům cizorodé DNA (větších než 20Kb), udržení si infektivity po inzerci cizorodé DNA, široké spektrum permisivních buněk, relativně vysokou úroveň syntézy proteinů, vhodný přenos, sekreci, procesing a post-translační úpravy diktovaných primární strukturou exprimovaných proteinů a hostitelskou buňkou. Například N-O-glykosylace, fosforylace, myristilace a štěpení, stejně jako sestavování exprimovaných proteinů, probíhající přesným způsobem.

Některé existující varianty vektoru vakcinie jsou použitelné v navrhovaném vynálezu (viz Ausubel et al., infra,§§ 16,15-16,19). Běžně je po vytvoření zásobního vzorku (viz Ausubel et al., infra,§§ 16,16), nukleotidová sekvence kódující EPV umístěna pod kontrolu promotoru viru vakcinie a integrována do genomu vakcinie tak aby si udržel svoji infektivitu (viz Ausubel et al., infra,§§ 16,17). Je také možné expresi zajistit transfekcí plasmidu obsahujícího gen kódující EPV, který je pod kontrolou promotoru vakcinie, do buněk, které byly infikovány divokým kmenem viru vakcinie.

Je vhodné aby hostitelská buňka i vektor vakcinie byly použitelné a vhodné pro vakcinaci savců a zejména lidí. Tyto rekombinantní viry mohou být charakterizovány pomocí řady známých metod (viz Ausubel et al., infřa,§§ 16,18). V další variantě, polymerázový řetězec bakteriofága T7 může být integrován o genomu vakcinie, takže sekvence kódující EPV je exprimována pod kontrolou promotoru T7, buď v transfekované plasmě, plasmidu nebo rekombinantním viru vakcinie.

Použití promotoru viru neštovic má tu výhodu, že buněčná či jiné virové promotory nejsou obvykle rozeznány transkripěním aparátem viru vakcinie. Komponenty promotorů časné i pozdní fáze jsou použité v rekombinantních virech obsažených v polyenv vakcíně tak, aby EPV exprimované v hostitelských buňkách infikovaných rekombinantním virem vakcinie byly presentovány jako antigen v asociaci s hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) třídy I nebo II. Tyto MHC asociované obalové proteiny viru HIV budou pak tvořit cíl pro T buňky a připraví tak vakcinovaného savce na cytotoxickou T buněčnou a/nebo humorální odpověď proti EPV exprimovaným HIV virem. To je dané schopností vektorů viru vakcinie indukovat v hostitelských buňkách MHC prezentaci těchto antigenů, kterých v pozdních fázích infekce • · · · ·· ·· ·· ·· ···· · · · · • · · · · · · · · · ··· · · · · · · ··· · · • ···· · · · • · · · · · · · ·· ubývá. Transkripty vzniklé brzo budou ukončeny po sekvenci TTTTTNT a povedou k neadekvátní MHC presentaci.

Je možné, že tyto terminační motivy uvnitř kódující sekvence genu mohou být alterovány mutací, pokud je použit časný promotor viru neštovic, z důvodů zvýšení presentace antigenů obalových proteinů v hostitelských buňkách (Earl et al., infra (1990)). K napodobení mRNA viru vakcinie, nepřekládaná vedoucí a 3 '-terminální sekvence, jsou ponechány obvykle krátké, pokud jsou použity v plasmidu vakcinie s inkorporovanou sekvencí kódující EPV viru HIV.

Plasmid použitý pro výrobu konstruktů vakcinie, dle předloženého vynálezu, by měl obsahovat místa rozeznávaná restrikčními endonukleázami aby bylo možné inzertovat gen env za promotor vakcinie (viz Ausubel et al., infra,§§ 16,17). Ještě výhodnější je, pokud plasmid již obsahuje sekvence kódující obalový protein, kde se unikátní restrikční místa nacházejí na začátku a na konci sekvence kódující env protein.Stejné restrikční fragmenty sekvencí kódujících EPV mohou pak nahradit odpovídající sekvence v plasmidu. V těchto případech, je hlavní část sekvence kódující EPV inzertována po odstranění většiny sekvence kódující obalový protein z plasmidu.

Je preferováno, aby výsledný konstrukt viru vakcinie (obsahující sekvenci kódující EPV a promotor viru vakcinie) byl obklopen původní virovou DNA, tak aby to umožnilo homologní rekombinaci po transfekci plasmidu do buněk, které byly předtím infikované divokým kmenem viru vakcinie. DNA viru vakcinie obklopující EPV kódující sekvenci je zvolena tak aby rekombinace neporušila žádný z esenciálních virových genů.

Bez selekce je poměr rekombinantní ch k parentálním virům vakcinie obvykle okolo 1:1 000. Ačkoliv tato frekvence je dostatečná na to aby umožnila plakovou hybridizaci (viz Ausubel et al., infra,§§ 6,3 and 6,4) nebo imunoscreening (viz Ausubel et al., infra,§§ 6,7) k určení rekombinantních virů, k identifikaci rekombinantních virů byla vyvinuta celá řada metod. Celá řada těchto selekčních nebo screeningových metod je dnes velmi dobře známá (viz Ausubel et al., infra,§§ 16,17) Obvykle je expresní úsek obklopen segmenty genů vakciniové thymidin kinázy (TK) a rekombinace tedy vede k inaktivaci tohoto enzymu. Viry s TK- fenotypem mohou být pak odlišeny od TK+ virů, infekcí TK- buněčné linie v přítomnosti 5-bromo-deoxyuridin (5BrdU), který musí být thymidin kinázou inkorporovanou ve virovém genomu fosforylován aby se stal letálním. Jiná možnost, která se dá s předchozí variantou kombinovat, je selekce rekombinantních virů pomocí koexprese bakteriálních genů určujících rezistenci k antibiotikům, jako je např. ampicilin (amp), nebo guanninfosforybozyl transferáza (gpt). Dalším příkladem může být koexprese lacZ genu z Escherichia Coli, která umožňuje výběr rekombinantních virových plaků pomocí Xgal (viz Ausubel et al., infra,§§ 16,17).

• · ··· · ·

Rekombinantní viry vakcinie exprimující EPV, dle navrhovaného vynálezu, mohou být eventuálně atenuované nebo inaktivované pomocí známých metod, jako je inaktivace horkem, inkubací s paraformaldehydem, ozářením ultrafialovými paprsky, inkubace s propriolactenem, formovánín hybridů či chimér nebo nějakou jinou metodou (viz Zagury et al., Nátuře 332:728731 (1988), Ito et al., Cancer Res. 50:6915-6918 (1990), Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-1139 (1967), D'Honcht, Vaccine 10(Suppl.):548-552 (1992), Selenka et al., Arch. Hyg. Bacteriol. 153:244-253 (1969), Grunwald-Bearch et al., J. Cancer.Res Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)). Například inaktivace teplem v 60 °C značně redukuje titr viru. Tato inaktivace je bezpečně testována, neboť nekompletní inaktivace může vést ke smrti pacienta (Dorozynsky and Anderson, Science 252:501-502 (1991)).

Tato atenuace nebo inaktivace rekombinantního viru vakcinie, musí být použita pokud pacient má narušený imunitní systém a pokud by podání živé vakciny způsobilo komplikace nebo ohrozilo jeho život.

Farmaceutické složení

Farmaceutická příprava vakciny, dle navrhovaného vynálezu, vhodná pro inokulaci nebo pro parenterální či perorální podání, zahrnuje polyenv rekombinantní virovou vakcínu složenou z alespoň 4 a až 10 000, lépe pak od 4 do 1 000 a nejlépe pak od 10 do 100 odlišných rekombinantních virů, ve formě buněčného lyzátu , membránové frakce, částečně purifíkované nebo zcela purifíkované formy. Polyenv vakcína složená z rekombinantního viru a obsahující buněčný lyzát (nebo jeho membránovou frakci) by měla také obsahovat EPV proteiny exprimované také rekombinantním virem. Zahrnutí exprimovaných EPV proteinů do vakciny, výrazně zvyšuje primární protilátkovou odpověď.

Směs polyenv vakciny by měla mít formu sterilního vodného nebo bezvodého roztoku, suspenze nebo emulze a může také obsahovat pomocné složky nebo vehikula známé v oboru. Každý z alespoň 4-40 až 10 000 odlišných virů, kóduje a exprimuje odlišný EPV, jak je uvedeno výše. DNA kódující EPV mohou být zvoleny tak aby reprezentovaly EPV vyskytující se ve specifické izolované komunitě pacientů s AIDS. Například, vakcína může reprezentovat sekvence vyskytující se v Memphisu, TN a tak může být určena pro použití v Memphisu, TN. Vakciny vytvořené tak aby reprezentovaly geograficky oddělená území, mohou být však samozřejmě použity i mimo danou cílenou oblast.

DNA sekvence kódující EPV mohou být také vybrány tak aby reprezentovaly určitou geograficky vymezenou komunitu, město nebo stát. V jedné polyenv vakcíně může být přítomná • · • * « · · · « · · · ····· · · · · · · · · · • · · · · · · · « · ·· ·· · · ·♦ celá řada klonů. Polyenv vakcína může také dále obsahovat imunomodulátory, jako jsou cytokiny, které zesílí imunitní odpověď proti virové infekci (viz Berkov et al., eds. The Merck Manual, Fifteenth Edition, Merck and Co., Rakway, NJ (1987), Goodman et al., eds. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eigtheen Edition, Pergamon Press, lne. Elamsford, NY (1990) Averyů Drug Treatment: Principles and Practise of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, AIDS Press, LTD., Wiliams and Wilkins, Baltimore, MD /1987), Katzunk, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)), tyto reference a ostatní dosud citované práce zachycují současný stav techniky.Jak je zřejmé odborníkovi, když je vakcína dle navrhovaného vynálezu podávána individuu, může být ve směsi, která bude obsahovat například soli, pufry, adjuvans a jiné substance, které jsou nezbytné pro funkčnost vakcíny. Adjuvans jsou látky, které mohou být použity k specifickému zesílení imunitní odpovědi. Běžně jsou adjuvans a vakcinační směs smíchány před aplikací pacientovi, je však také možné použít oddělené injekce, které je však třeba aplikovat do stejného místa. Adjuvans mohou být rozděleny do několika skupin podle svého složení. Jsou to olejová adjuvans, minerální sole (např. A1K(SO4)2, AlNa(SC>4)2, A1NH₄(SO₄)2, silice, kaolin a karbon), polynukleotidy (např. polylC a polyAU nukleové kyseliny) a některá přirozené substance (např. vosk D z Mycobacterium Tuberculosis, některé složky získané z Corynebacterium parvum nebo Bordetella pertussis a membrány rodu Brucella). Mezi tyto substance prakticky použitelné jako adjuvans patří také saponiny (např. Quil A., Superfos A/S, Denmark). Příklady materiálů, použitelných ve vakcinační ch směsích jsou uvedeny v např. Osol, A., ed. Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341.

Farmaceutická směs polyenv vakcíny dle navrhovaného vynálezu, může také obsahovat alespoň jednu antivirovou chemoterapeutickou složku. Nelimitující příklady mohou být např. gamaglobulin, amantadin, guanidin, hydroxy benzimidazol, interferon-α, interferonβ, interferon-γ, interleukin-16 (IL-16, Kurth, Nátuře, December 8, 1995), thoisemikarbazony, methisazon, rifampin, ribvirin, a analogy pyrimidinů (např. AZT a/nebo 3TC), analogy purinů, foscamet, kyselina fofsonooctová, acyclovir, dideoxynucleosidy a inhibitory proteázy (např. saquinavir (Hoffinann - La Roche), indinavir (Merck), ritonavir (Abbott Labs.), AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals), VX-2/78 (Glaxo Wellcome)), chemokiny (jako je RANTES, ΜΙΡΙα nebo ΜΙΡΙβ (Science 270: 1560-1561)) nebo ganciclivir (viz např. Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 8:1065-1071 (1992), Annu. Rev. Pharmacol. Toxico. 33:149-164 (1993), Antimicrob Agents Chemoter 37:1207-1213 (1993), AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994), Katzung (1992), infra, a reference citované zde na stránkách 798-800 a 680-681.

• ·

Farmaceutické použití

Použití polyenv vakcíny (nebo antiséra které vytváří), může mít buď profylaktický, nebo terapeutický účinek, z čehož výhodnější je profylaktický účinek. Pokud je vakcína použita jako prevence, je živá polyenv vakcína podávána předtím, než jsou detekovány jakékoliv symptomy

HIV infekce nebo nemoci AIDS. Profylaktický účinek vakcinační směsi slouží k prevenci jakékoliv následné infekce virem HIV.

Pokud je vakcína podávána s therapeutickým záměrem, je podávána ve chvíli, kdy jsou již bezpečně zjištěny symptomy infekce. Použití živé virové vakcíny u pacientů infikovaných virem HIV je možné pouze pokud je imunitní systém pacienta shledám schopným účinně reagovat na virovou vakcínu, bez případného rizika možných komplikací ěi dokonce smrti, v případě že živý virus je podáván v množství dostatečném k vyvolání reakce natolik silné aby překonala aktuální virovou infekci.

Pokud je pacientův imunitní systém oslaben, je třeba použít atenuovanou nebo inaktivovanou směs polyenv vakcíny, kde je rekombinantní virus atenuován nebo inaktivován, jak bylo uvedeno výše (viz Berkov (1987) infra, Goodman (1990) infra, Avery (1987), infra a Katzung (1992), infra Dorozynski a Anderson, Science 252:501-502 (1991)).

Směs je farmakologicky přijatelná pokud je tolerována pacientem kterému je aplikována. Látky obsažené ve směsi jsou podávány v therapeutické nebo profylaktické dávce, pokud se jedná o množství vyvolávající farmaceuticky signifikantní odpověď. Vakcína, nebo směs, dle navrhovaného vynálezu, je farmaceuticky signifikantní pokud její podání vyvolá detekovatelné změny ve fyziologii pacienta, zejména zvýšení humorální nebo buněčné imunitní odpovědi proti viru HIV.

Vyvolaná prevence nemusí být absolutní, tzn. HIV infekce nebo nemoc AIDS nemusí být zcela preventována nebo potlačena, po použití je však zřejmé statisticky významné zlepšení, vzhledem ke kontrolní populaci. Účinek může být omezen na snížení intenzity a rychlosti nástupu symptomů nemoci.

Farmaceutické podání

Vakcína navrhovaná předloženým vynálezem, vyvolává rezistenci k jednomu či několika kmenům viru HIV. Navrhovaný vynález se proto soustředí na způsoby prevence nebo atenuace infekce alespoň jedním kmenem viru HIV. Tak jak je zde použita, řečená vakcína preventuje • · ·· nebo likviduje chorobu pokud její podání pacientovi vede k totální nebo částečné atenuaci (tzn. supresi) symptomů či projevů choroby, nebo k totální či částečné imunitě k této chorobě.

Alespoň jedna polyenv vakcína dle navrhovaného vynálezu, může být podána způsobem tak, aby bylo dosaženo zamýšleného cíle, za použití farmaceutické směsi, jak zde byla popsána. Například, tato směs může být podána různými parenterálními způsoby tak jako subkutánně, intravenózně, intradermálně, intramuskulámě, intraperitoneálně, intranasálně, transdermálně nebo bukální cestou. Preferovaná je varianta subkutánního podání. Parenterální podání, může být prostřednictvím injekce tvořící bolus, nebo postupnou perfůzí (viz Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987) infra a Katzung (1992), infra).

Typickým protokolem pro prevenci, supresi, nebo léčbu choroby, nebo podmínkou, která usnadní buněčnou imunitní odpověď pomocí aktivní specifické buněčné imunoterapie, představuje aplikace efektivního množství vakcinační směsi, jak byla popsána výše, podáním jedné therapeutické dávky, nebo opakovanou imunizací sekundárními dávkami v období od jednoho týdne do zhruba 24 měsíců.

Podle navrhovaného vynálezu, je efektivní množství vakcinační směsi to, které je dostatečné pro vyvolání požadovaného biologického efektu, v tomto případě je to buď buněčná nebo humorální imunitní odpověď proti viru HIV. Je samozřejmé, že efektivní dávka závisí na věku, pohlaví, zdravotním stavu a váze pacienta, typu předešlé léčby pokud nějaká proběhla, frekvenci therapie a typu požadovaného efektu. Rozmezí efektivních dávek, uváděné níže, nemůže být bráno jako limit vynálezu a reprezentuje pouze preferované varianty. Nejvhodnější dávkování musí být zvoleno individuálně pro každého pacienta, podle uvážení odborníků, bez velkého experimentování (viz Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987) infra, Ebadi. Pharmacology, Little Brown and Co., Boston, Ma (1985) a Katsung (1992), infra).

Obecně se dá říci, že dávka pro dospělého pacienta bude přibližně od 10⁵ do 10⁹ plaque forming units (pfu)/kg nebo clony forming units (cfu)/kg na dávku, kde je preferováno 10⁶ až 10⁸. Jakákoliv dávka je použita, musí být v bezpečném a přitom efektivním množství determinovatelném známými metodami, jak je zde také popsáno.

Subjekt

Objektem kterému má být aplikována vakcína dle navrhovaného vynálezu, může být jakýkoliv savec, který je schopen vyvinout specifickou imunitu proti viru HIV, kde buněčná odpověď je zprostředkována proteiny MHC třídy I nebo II. Ze savců jsou preferovanými objekty savci z řádu primátů (včetně lidí, šimpanzů, lidoopů a opiček). Nejpreferovanějšími objekty jsou lidé.

·· ·· ·· ·· t · · · } t · · > * ·· i · ·· • · · · ·· ···· · « · · · 9 9 9 « · • · « ··

Subjekty jsou pokud možno infikovány virem HIV nebo modelovou infekcí HIV napodobující (viz Hu et al., Nátuře 328:721-723 (1987)).

Nyní po obecném popisu vynálezu, je smysl snadněji pochopitelný z referencí a příkladů, které následují, pouze jako ilustrace, a nemohou být brány jako limity daného vynálezu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1: Příprava exprese HIV env proteinu ve virovém vektoru vakcinie

Nomenklatura: pro zjednodušení, je konstrukt rekombinantního viru někdy označován Vvenv konstrukt, zatímco specifický konstrukt viru vakcinie je označován podle pacienta, nebo depozitáře (např. ATCC nebo GenBank), který sloužil jako zdroj DNA kódující protein env, použité v konstruktu. Například Vvenv-Doe označuje virový vektor vakcinie ve kterém je použita sekvence kódující env protein získaná z pacienta Doe, nebo Vvenv-U28305 označuje virový vektor vakcinie ve kterém je použita sekvence kódující env protein získaná z GenBank pod označením No. U28305.

Polyenv vakcína je složena z 4 až 100 odlišných rekombinantní ch virů vakcinie, z nichž každý exprimuje unikátní obalový protein viru HIV-1. Pro zjednodušení je každý individuální virus označen Vvenv a konečná směs virů se označuje polyenv.

Při přípravě každého Vvenv je použit plasmid označovaný jako pVenv4 a divoký typ viru vakcinie označovaný NYCDH, popsaný dále. Další detaily popisuje Ryan et al., „Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization“ in Immunology Methods Manual, Lefkovits, ed., Academie Press (1996).

Vektory a hostitelské buňky: Dříve popsaný vektor pSC (Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)) může být použit pro rekombinaci několika HIV genů do genomu viru vakcinie. Plasmid pSCll obsahuje lacZ gen (reportér gen, pomocí kterého mohou být transformované bakterie a V V rekombinanty mohou být snadno identifikované díky jeho βgalaktosidázové aktivitě) a další části tohoto plasmidu nesou geny kódující thymidin kinázu (TK) a resistenci k ampicilinu (amp). Geny klonované do pSCll jsou inzertované do VV genomu homologní rekombinaci mezi TK genem divokého typu viru a částí TK genu obsaženou v pSCll. Inzerce plasmidové DNA do virového TK lokusu inaktivuje virový gen, takže rekombinantní virus může být snadno selektován z pozadí TK⁺ virů, kultivací v bromdeoxyuridinu (BudR). Tak aby bylo možné vybrat TK viry, které přežívají v této selekci, musí být inkubovány v buňkách, které neexprimují vlastní aktivní TK enzym, jako je například buněčná linie ΤΚΊ43, která je TK-deficitním derivátem linie lidského osteosarkomu R970-5 • ·· ·· ·· ·· ·· *; ; ι ι ι·..* ί ; *·· · i :>* ~r. :

··· · · ·· ♦ '· · · · · (Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975)) a umožňuje růst VV (Weir et al., infra (1982)).

Produkce expresních genových segmentů viru HIV může být zajištěna inzercí celého genu do restrikěního místa Smál na pSCll vektoru. Exprese celého genu může být kontrolována prostřednictvím P7.5K promotoru.

Jako alternativa ke klonování kompletních HIV genů, může jeden zastoupit částečné genové sekvence, které již byly klonovány do pSCll. Například, konstrukt označený pVenvl byl připraven z pSCll a exprimuje gen kódující BH10 HIV obalový protein (env) (Hallenberger et al., infra (1993), Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987)). Konstrukt může být použit jako výchozí vektor, k substituci a expresi variabilních domén obalových proteinů z HIV izolátů. Podobně pVenv4 vektor byl vytvořen z pSCll tak aby exprimoval BH10 env protein zkrácený o transmembránovou a cytoplasmatickou koncovou doménu kódovanou sekvencí gp41 ale se Zachovalou oligomerizační doménou (Hallenberger et al., infra (1993). Jak je odborníkovi zřejmé, termín oligomerizační doména je použit pouze funkčně tak, aby popsal tu část gp41 která umožňuje oligomerizaci env proteinů, tzn. jedná se o strukturu zodpovědnou za oligomerizaci. Vektor pVenv4 kóduje zkrácený gpl60 (také gplóOt, gpl40) u kterého byla zjištěno že vytváří terciální strukturu, podobná té, kterou tvoří gp41/gpl20 oligomer (dimer, trimer nebo tetramer), prezentovaný na povrchu buněk infikovaných virem HIV. Terciální struktura je udržována v obou formách - sekretované i membránové (Hallenberger et al., infra (1993)). Tento vektor je s výhodou použit jako výchozí vektor pro substituci izolovaných alternativních sekvencí proteinu env.

V tomto příkladě, příprava každého Vvenv konstruktu zahrnuje použití pVenv4 a divokého typu viru vakcinie NYCDH a vhodné hostitelské buňky jak bude detailně popsáno dále.

PVenv4: Vektor pVenv4, byl připraven inzercí sekvence kódující HIV-1 obalový protein do rekombinantního vektoru viru vakcinie pSCll (Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993), Chakrabarti et al., Mol.Cell Biology 5:3403-3409 (1985)). Sekvence HIV-1 byly derivovány z laboratorních vzorků živého viru. Sekvence byla nazvána BH10 (Ratner et al., Nátuře 313:277-284 (1985)). Jedinečné sekvence kódující obalové proteiny získané z pacientů infikovaných HIV-1 mohou být pomocí PCR technik amplifikovány a substituovány do BH10 env sekvence tak aby vznikl nový vektor. Například následující primery mohou být použity pro PCR.

(A) Sense, pozice 5785 (SEQ ID NO:1) AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA • ·

··· · • · ·* 4 ί ·· * · I (Β) Antisense, pozice 7694 (SEQ ID NO:2) CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT (C) KpnI-sense, pozice 5903 (SEQ ID NO:3) GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT (D) Bsml-antisense, pozice 7695 (SEQ ID NO:4) CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG (E) (volitelné) DralII-sense, pozice 6153 (SEQ ID NO:5) CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG (F) (volitelné) Bsu36I-antisense, pozice 6917 (SEQ ID NO:6) TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG

Primery jsou zapsány ve směru od 5'do 3'. Restrikční místa jsou podtržena (číslování pozic je založeno na sekvenci BH10 (Ratner et al., Nátuře 313:277-284 (1985)).

Strategie PCR: Pro produkci nových HIV-1 env konstruktů, je k amplifikací 188 párů baží (bp) genu kódujícího obalový protein, izolovaného ze čtyřiceti odlišných vzorků získaných od pacientů, použita polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR primery představují silně konzervativní sekvence viru HIV-1 a je tedy možné úspěšně amplifikovat geny kódující env z celé řady odlišných vzorků získaných od HIV-1 infikovaných pacientů. Amplifikovaná DNA zahrnuje celý protein gpl20 kromě zhruba 10 vysoce konzervativních aminokyselin tvořících amino konec proteinu. V PCR produktu jsou obsaženy všechny variabilní domény obalového proteinu (VI až V5). Navíc tato amplifikovaná sekvence kóduje přibližně 100 aminokyselin za kontaktním místem gpl20/gp41.

PCR primery zahrnují restrikční místa pro enzymy KpnI a BsmI, které obklopují sekvenci kódující obalový protein BH10 v pVenv4 a jsou tedy inkorporovány do amplifikovaného DNA produktu.

První kolo PCR: v 500ml mikrocentrifugační zkumavce rozmíchat:

• 1 μΐ Primeru A (SEQ ID NO: 1), 300 ng/μΐ • 1 μΐ Primeru B (SEQ ID NO:2), 300 ng/μΐ

• 2,5 μΐ 10 mM každého ze 4 dNTP • 1 pg DNA • 10 μg IOX PCR pufru • HPLC H20 do 99 μΐ

Rozmíchat zásobní roztok taq polymerázy a přidat 1 μΐ k PCR reakci. Dobře promíchat. Přelít minerálním olejem.

Reakci nechat běžet v termálním cycleru následuj ícně:

• Inkubovat při 95 °C, 3 min do roztavení DNA • Nechat proběhnout 40 cyklů: 95 °C, 1 min, 45 °C, 2 min, 72 °C, 3,5 min.

Druhé kolo PCR: Připravit PCR reakci stejně tak jak byla popsána výše ale s priméry C a D (SEQ ID NO:3 a 4) a bez DNA. Přenést konečný roztok z první reakce do 95 μΐ. Přelít minerálním olejem. Ponořit opatrně špičku a odebrat z pod oleje 5 μΐ z první PCR reakce. Namíchat vzorek na druhou reakci pod vrstvou oleje a nechat proběhnout cykly jako napoprvé.Třicet cyklů je obvykle dostačující. Je vhodné kontrolovat produkt odebráním 2 μΐ na gelovou analýzu po každých 10 cyklech , dokud není identifikovatelný zřetelný proužek okolo 1 800 bp.

Použitím dobře známé substituční klonovací techniky, byly vytvořeny deriváty pVenv4, které exprimují env sekvence od jednoho do až 40 pacientů, namísto BH10 sekvence obalového proteinu. Plasmid pVenv a PCR produkty byly nejprve nastřihány restrikčními endonukleázami KpnI a BsmI, nastříhaný pVenv4 byl pak dělen na agarózovém gelu a byl vyizolován větší fragment. Malý fragment (1 800 bp fragment ) BH10 env byl odstraněn. Nastříhaný PCR produkt byl také izolován a ligován do velkého fragmentu pVenv4, tak aby vznikla chimérická sekvence kódující obalový protein, nyní však obsahující 1 800 bp variantní env sekvence z pacientovy DNA. Následuje ligace PCR produktu a pVenv4 produktu, bakteriální hostitelské buňky jsou transformovány ligační směsí pomocí libovolné, běžně používané metody, včetně např. elektroporace a rekombinantní kolonie jsou selektovány a analyzovány sekvenováním. Plasmid pVenv4, nebo rekombinanty vyrobené pomocí pVenv4 usnadněné inzerce genů do genomu viru vakcinie homologní rekombinací mezi thymidin kinázovými geny (TK) divokého typu viru a TK sekvencí uvnitř plasmidů. Inzercí DNA pVenv4 do virového TK lokusu získáme viry vakcinie s genem kódujícím obalový protein viru HlV-lpod kontrolou P7.5K časného/pozdního promotoru. Virus je atenuovaný v růstové aktivitě díky přerušení TK lokusu.

•f ) ' 4 <<♦.·

I •i »· ·· • · β 4

4 44

4 « · • · ♦

44

Další součástí pVenv4 je lacZ gen kódující enzym s β-galaktosidázovou aktivitou. Aktivita genu lacZ může být použita k selekci rekombinant viru vakcinie (viz. níže).

Obalový protein exprimovaný pomocí pVenv4 je zkrácen o transmembránovou/C-terminální gp41 sekvenci. Vektor je exprimován jako oligomemí struktura, která se objevuje uvnitř buněk I jako sekreto váná forma.

Virus vakcinie NYCDH: Každý nový substituovaný plasmid je individuálně rekombinován s divokým typem viru vakcinie NYCDH.Virus byl získán z ATCC (No. VR-325) a byl přečištěn plakovou metodou před použitím (Buck, C. and Paulino, M.S.eds., American Type Culture Collection Cátalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae. 6^th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990)).

Bakteriální hostitelské buňky: Plasmid může být inkubován v libovolném hostitelském organismu, tak jak je v praxi běžné (viz Ausubel, infra (1995 rev), §§ 16.15-16.19). Nelimitujícím příkladem mohou být buňky DH5a.

TK-deficitní buňky: Transformace a substituce viru vakcinie je prováděna na lidské Tkl43B linii, která je derivátem lidské osteosarkomální linie R970-5 (Rhim et al., (1975) infra), která umožňuje růst VV (Weir et al (1982) infra). Každý rekombinant viru vakcinie obsahující unikátní sekvenci HIV env genu je selektován na základě exprese lacZ genu (virové plaky jsou přelity Bluo-gal a β-galaktosidázová aktivita se projeví modrým zabarvením plaku. Mohou proběhnout dvě kola PCR.

PŘÍKLAD 2: Příprava polyenv vakcíny

Věro buňky: konečným krokem výroby je inkubace Vvenv konstruktů na Věro buňkách nově získaných z ATCC (No. CCL81 nebo X38) klonovaných a napěstovaných pro produkci viru. Věro buňky byly doporučeny Světovou Zdravotnickou organizací pro výrobu vakcín (Hay, R. et al., eds. American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7^th Ed., . American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), p. 48).

Věro buňky rostou v Dulbecco's Modified Eagles Medium (Bio-Whittaker), s doplněným glutaminem (Bio-Whittaker) a tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem (Hyclone, lne.). Je také možné použít bezsérová média. Každý Vvenv konstrukt je inokulován na separátní povlak Věro buněk a sebrán ve chvíli kdy buňky začnou vykazovat znaky cytopathického efektu virové infekce. Buňky jsou po sebrání a před mražením důkladně promyty v PBS (Bio-Whittaker). Buňky jsou pak rozbity pomocí zamražení a roztavení, sonikací nebo centrifugací při nízkých •Φ φφ φφ ·· ·· • φφφφ Φ·Φ· · ΦΦφ Φ ΦΦΦ

99 9 9 9 9 9 · ΦΦΦΦ ·

Φ φ Φ Φ · ΦΦ· «ΦΦΦΦ Φ· ·· ·· ·♦ rychlostech v centrifuze. Alikvoty supenatantu jsou pak skladovány v -70 °C. Obalový protein je přítomný v lysátu v koncentraci natolik vysoké, aby umožnil tvorbu protilátek specifických proti HIV obalovému proteinu (což je detekovatelné ELISA technikou) v savčím modelu, I když je VV atenuovaný, např. zahřátím preparátu na 60 °C na 1 hod.

Produkty vakcinie: každý typ viru (Vvenv konstruktu) z Věro buněk je individuálně zamražen a následně titrován a bezpečně testován. Po ukončení testů, alikvoty těchto virů jsou smíchány tak aby vznikla vakcína s alespoň 10⁸ pfu/ml (pfu znamená plaque forming unit). Pokud je použito 40Vvenv konstruktů, každý z nich je přítomen ve vakcíně ve zhruba stejném množství, každý Vvenv je použit v titru 2,5 χ 10⁶ pfu/ml v konečné vakcíně. To je celkem 1 χ 10⁸ pfu.

Otestování polyenv vakciny

Myši: myši mohou být infikovány pomocí intraperitoneální injekce 1 χ 10⁷ pfu env exprimuj ících VV. Protilátky mohou být identifikovány pomocí HIV ELISA neutralizační techniky, jak je popsána výše, tři týdny po injekci VV.

Před výrobou vakciny pro použití u lidí, je třeba připravit podobnou skupinu virů a nechat test proběhnout na myších. Tyto viry byly podávány myším buď intraperitoneálně nebo subkutánně. Pomocí ELISA techniky (enzyme-linked imunosorbent assay) bylo pak otestováno sérum na přítomnost specifických sérových protilátek proti viru HIV. Tato technika zhmuje potažení jamek rozbitým HIV-1 (HTLVuib) a zablokování destiček bovinním sérovým albuminem. Sérové vzorky byly pak přidávány v ředěních 1:100, 1:1 000, 1:10 000 v PBS. Byly použity goat-anti-mouse protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou a jako substrát sloužil pnitrofenyl fosfát. Barevná reakce byla zastavena roztokem hydroxidu sodného a měření optické denzity proběhlo na ELISA - readeru při 405 nm.

Jak ukazuje obr.2, jednoduchá aplikace 10⁶ až 10⁷ pfu viru vakcinie (obsahující jednu sekvenci kódující obalový protein HIV-1 a exprimovaný na membráně vázaný obalový protein) s buněčným lyzátem vyvolává silnou protilátko vou odpověď proti HIV-1, která vydržela po celou dobu experimentu - tzn. 6 měsíců. Tato protilátko vá odpověď je značně silnější, než dříve popisovaná reakce na jinou imunizaci. Takto vysoká protilátko vá odpověď může být způsobena přítomností na membráně vázaného obalového proteinu ve vakcíně.Jak ukazuje obr. 3 tyto reakce jsou závislé na dávce. Slabší reakce byla pozorována u savců, kterým byla podána dávka 10⁶ pfu než u zvířat kterým bylo podáno 10⁷ pfu.

999

99 ·· ·· • 9 · 9 *999 • 9 99 · · *9

9« 99 «9 99 ·9 9 · 9 9 · 9 9

9 9 99 99

Byly připraveny také směsi virů vakcinie exprimuj ících odlišné HIV-1 obalové proteiny. Když bylo myším aplikováno 107pfu směsi virů, intenzita jejich imunitní reakce byla v podstatě stejná, jako při podání jediného rekombinantního viru vakcinie (obr 4). Smíchání velkého počtu různých env-exprimuj ících virů vakcinie, nebylo popsáno, ale předpokládá se že povede ke vzniku širokého spektra neutralizačních protilátek.

Lidé: Testování směsi virů je zatím v před klinickou fází, a první pokusy budou prováděny pouze pro určení účinné dávky a testování bezpečnosti.

Klinické pokusy testující maximální možné dávky budou sestaveny ze čtyřech skupin dobrovolníků. Každá skupina pak dostane jednu z následujících dávek vakcíny:

(1) 2 xlO⁴ pfu (2) 2x10⁵ pfu (3) 2 xlO⁶ pfu (4) 2x10⁷ pfu

Každý dobrovolník dostane subkutánně směsnou virovou vakcínu v 0,5 ml fyziologického roztoku.

PŘÍKLAD 3: Indukce primární imunity pomocí virové vakcíny založené na expresi mnoha typů HIV-1 obalových proteinů virem vakcinie u šimpanzů

Populace izolátů virů HIV-1 je vyzbrojena přesně vypočítaným množstvím typů obalových proteinů. Env proteiny jsou výhradně virem kódované externí proteiny, které jsou cílem neutralizačních protilátek, ačkoliv protilátky indukované jedním izolátem, nemusí nezbytně neutralizovat jiný. Z tohoto důvodu jsme připravili směs HIV-1 vakcín, polyenv, kde je exprimována celá řada variant env proteinu. Výroba vakcíny začíná přípravou třiceti odlišných VV-rekombinantů, z nichž každý exprimuje odlišný env protein. Vvenv jsou pak testovány , jak individuálně, tak v kombinacích (polyenv) na šimpanzím modelu. Čtyři šimpanzi byli imunizováni subkutánně třemi injekcemi VVenv jednoho typu (šimpanzi 1,2) nebo pomocí polyenv vakcíny (šimpanzi 3,4) následovanými jednou intramuskulámí injekcí rekombinantního proteinu gpl20/gp41 v aluum precipitátu. Bezpečnost vakcíny bylo možné demonstrovat na všech čtyřech zvířatech, z nichž pouze u dvou se projevili známky ulcerace v místě vpichu. Vzorky séra byly testovány celou řadou testů určujících vazbu na HIV a jeho neutralizační schopnosti. Protilátky ze šimpanzů 3 a 4 měly nejvyšší vazebnou aktivitu. Neutralizační funkce byla demonstrována jek proti laboratornímu tak proti primárnímu izolátu viru HIV-1, z nichž ani jeden nebyl přítomný ve vakcíně. Tedy indukce lymfocytů pomocí směsi env proteinů, tedy ·· ·· « · · · • 9 99

999 9 9

9 9

99 • *· ·· ·· ·· · · · · · * • « · · · ·*

999 99 99 99

9 9 9 9 9

9 99 99 99 představuje účinnou metodu pomocí které mohou být indukovány vysoce kvalitní protilátky proti řadě odlišných kmenů HIV-1.

Materiál a metody:

PVenv4 a VV rekombinantní vektor: pVenv4 byl dříve připraven zavedením stop kodónu do BH10 env sekvence a inzercí modifikovaného genu kódujícího env protein BH10 do plasmidů pSCll. Proteinový produkt env plasmidů pVenv4 je zkrácen na 640 aminokyselin, je však nadále schopen sekrece a oligomerizace. Produkce rekombinantních VV, Venv4, exprimujících tento zkrácený BH10 env protein, byl již dříve popsán (Hallenberger et al., Virology 191:510514(1993)).

PCR amplifkace env sekvencí izolovaných z HIV-1 infikovaných pacientů: Pro amplifikaci HIV env sekvencí bylo použito PCR. Konkrétně, ze vzorků izolovaných z krve pacientů pozitivních na HIV-1, u kterých byla již dříve diagnostikována přítomnost viru HIV. Další vzorky byly získány buď izolací z pacientů s klinickými symptomy AIDS, nebo z repozitářů zabývajících se výzkumem AIDS. Z krve nebo ze vzorků infikovaných buněk byla nejprve izolována DNA postupným přikapáváním vzorku do lyzačního roztoku obsahujícího SDS a inkubací po dobu 30 min, v 65 °C. Po přidání proteináz v koncentraci 0,5 mg/ml, byl lyzát inkubován v 45 °C přes noc. Dvě fenolové extrakce byly následované precipitací v ethanolu a resuspendováním DNA ve vodě.

Všechny vzorky DNA prošly dvěma koly amplifikace PCR podle standartních postupů. Sekvence pro primery byly zvoleny podle publikované sekvence BH10 (Ratner et al., Nátuře 313:277-284 (1985)). K získání fragmentů obsahujících sekvence všech variabilních oblastí a částí gp41, byly použity stejné primery, jaké byly popsány v příkladu 1. Produkty PCR byly následně klonovány substitucí do pVenv4 vektoru za použití standartních metod. Sekvenování nového plasmidů proběhlo dle Sangerovy metody za použití primeru CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG (SEQ ID No.5).

Příprava Vvenv: Nové VV rekombinanty (Vvenv) byly připraveny transfekcí VV (NYCDH

ATCC) infikovaných buněk s nově substituovaným rekombinantním plasmidem (viz výše). Pro transfekcí byly použity Transfectam (Promega) a Lipofectamin (Gibco, BRL), dle návodů přiložených výrobcem. VV byly nakonec vyčištěny plakovou technikou.

·· ·· ·* *· · · · · · · • · · · * ·· • ··· · · · · · • · · · · · «·« ·· ·· ·· ·· ·· • · · · • · «· • ··♦ · · • · · ·· ··

Imunizace: Buněčné lyzáty Vvenv infikovaných buněk byly podány šimpanzům subkutánní injekcí. Byl použit VVenv buď pouze jednoho typu, nebo ve směsi. Celkové množství VVV udávané v pfu bylo podobné ve všech injekcích ( asi 10⁷ pfu). Intramuskulámí infekce obsahovala směs přibližně 40 pg gpl20 (Cat # 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 pg gp41 (Cat # 036001, Intracel) a 500 pg aluum precipitátu (Rehsorptar Aluminium hydroxid Adsorptiv gel, Intergen Co., Purchase, NY) na dávku.

ELISA technika: Pět ELISA technik bylo použito následovně: Abbott ELISA # 1

ELISA # 1 - klinická Elisa od firmy Abbott zakoupena od Abbott Laboratories a provedená dle návodu doporučeného výrobcem (HIV AB HIV-l/HIV-2 (rDNA) El A, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

ELISA # 2 - jako antigen zde sloužil rekombinantní Mn-gpl60 (Quality Biological, lne. Gaithersburg, MD) v koncentraci lpg/jamku. Destičky byly blokovány a testy proběhly s vzorky séra ředěného trojkovou řadou. Destičky byly pak promyty a značeny pomocí anti-human IgG protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou.

ELISA # 3 - ELISA destičky byly potaženy s LAI-gpl20 (CHO-derived protein, Intracel) v koncentraci 1 pg/ml. Vzorky séra byly přidány v ředění 1:100 a značeny pomocí anti-human IgG protilátky (Mouše anti-human IgGl-ΑΡ, cat # 9050-4, Southern Biological Associates, lne. Birmingham, AL) konjugované s alkalickou fosfatázou, jako substrát sloužil p-nitrofenyl fosfát. Měření optické denzity proběhlo při 405 nm.

ELISA # 4 - tato ELISA byla stejná jako ELISA # 3, s tím rozdílem že ELISA destičky byly potaženy IIIB-gpl20 (baculovirus-derived protein, Intracel, cat # 12001, Cambrige, MA) v koncentraci 1 pg/ml.

ELISA # 5 - tato ELISA byla stejná jako ELISA # 3, s tím rozdílem že ELISA destičky byly potaženy lyzátem viru IIIB (Organon Teknika Co., Durham, NY) v koncentraci 1 pg/ml.

Neutralizační technika: Tato technika byla prováděna s laboratorními nebo primárními izoláty (Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26:231-237 (1988), Montefiori et al., Journal of Infectious Diseases 173:60-67 (1996)). Laboratorní izoláty: viry byly mixovány s vzorky séra ředěného 1:20 a naneseny na buněčné linie MT-2 nebo CEM-xl74. Pro určení životnosti buněk bylo použito barvení neutrální červení. Jako pozitivní výsledek byla brána 35 až 40 % redukce úmrtnosti buněk vzhledem ke kontrolnímu vzorku. Primární izoláty: viry byly mixovány s vzorky séra ředěného 1:4 a naneseny na PHA stimulované PBMC. Technika byla použita pro • φφ «· ·* φφφφ φφφφ φφφ φ φ φφ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφφ Φ· φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φφφ

ΦΦΙ Φ Φ φ φ φ φφ φφ ρ24. Redukce infektivity viru alespoň 75 % vzhledem ke kontrole bylo považováno za pozitivní výsledek.

Závěr

Příprava nových Vvenv rekombinantních virů vakcinie: Z důvodů přípravy nových VV rekombinantů (Vvenv), z nichž každý exprimuje odlišný HIV-1 env protein, byla ze vzorků HIV-1 nejprve izolována DNA. Většina DNA byla izolována z krve pacientů kteří vykazovali vnější příznaky choroby a byli dříve diagnostikováni jako HIV-1 pozitivní. Další vzorky DNA byly získány z AIDS Research and Reference Reagent Repository. PCR poběhlo pomocí páru primérů obsahujících restrikční místa pro KpnI a Bsml. Fragmenty byly pak substutituovány do vektoru pVenv4, zobrazeném na obr 5 ( pVenv původně exprimuje zkrácený HIV-1 protein BH10), v restrikčních místech KpnI a Bsml.Tímto způsobem je původní BH10 sekvence pro gpl20 (VI až V5) a gp41 nahrazena sekvencemi získanými jako produkty PCR. Z každého substituovaného plasmidu je připraven nový VV rekombinantní virus (Vvenv).

Tato metoda představuje jednoduchý způsob pomocí kterého je obrovská diverzita env kódujících sekvencí vnesena do unikátních VV rekombinantů (Vvenv). Je zajímavé že většina sekvencí je produktivní, z čehož vyplývá, že env sekvence v provirovém genomu (ze kterého je derivována většina PCR produktů), bývají defektní jen velmi zřídka

Pokud je směs Vvenv použita ve vakcíně, je možné dosáhnout obrovské diversity.

Imunizace šimpanzů s jedním nebo se směsí Vvenv: Pro testování jednoho klonu i směsné rekombinantní vakcíny byli použiti čtyři šimpanzi.Protokol imunizace je uveden v tabulce 2. První tři injekce obsahovaly V V, zatímco poslední injekce obsahovala kombinaci gpl20, gp41 a aluum precipitátu a byla podána intramuskulámě.3impanzi 1 a 2 dostali pouze jednu variantu viru vakcinie, respektive obalového proteinu, podanou ve všech prvních třech injekcích. Šimpanzi 3 a 4 dostali směs 10 rekombinantních VV (respektive env v první infekci), 10 dalších odlišných v druhé injekci a 10 posledních unikátních env variant v poslední injekci, což je celkem 30odlišných virových vektorů před sekundární imunizační dávkou proteinu. Všichni šimpanzi dostali podobná množství viru vakcinie udávaná v pfo a podobná množství rekombinantního proteinu.

·· 19

9 9

9 99 • 9 9

9 1

Tabulka 2

Imunizační protokol šimpanzů imunizovaných směsí VV rekombinantů • 44 • 4 4 ·

4 4 • 444 • 4

444 44

44

9 9 9

9 99

991 9 · • 4 ·

44

	Datum	Injekce
Šimpanzi 1,2	9.1.1996	VV (Env #1)
	16.4.1996	VV (Env #1)
	11.6.1996	VV (Env #1)
	30.7.1996	rekombinantní gpl20 + rekombinantní gp41 + aluum precipitát
Šimpanzi 3,4	9.1.1996	VV (Env #1 až 10)
	16.4.1996	VV(Env#ll až 20)
	11.6.1996	VV (Env #21 až 30)
	30.7.1997	rekombinantní gpl20 + rekombinantní gp41 + aluum precipitát

Rekombinantní Vvenv mohou být aplikovány bez vzniku lézí. Všichni čtyři šimpanzi byli monitorováni kvůli příznakům systémové choroby nebo tvorby lézí v místě infekce.

Zvířata byla denně testována na projevy diarhey, rhinorhey, kašlání, kýchání, rapidní respirace, letargie, omezené pohyblivosti a ztráty chuti, žádný z těchto příznaků nebyl u testovaných zvířat pozorován po celou dobu testu. Fotografie místa injekce pořízené v pravidelných intervalech po první imunizační dávce VV, ukazují zduření ve všech čtyřech případech. Lehké léze vzniklé na místě injikace u šimpanzů 1 a 3, jsou typické pro vakcinaci virem neštovic, u šimpanzů 2 a 4 se neobjevily. Žádné příznaky choroby, zduření či lézí nebyly zřetelné po druhé, třetí I čtvrté injekci u žádného ze zvířat, což ukazuje že specifická anti V V imunita byla indukována první injekcí.

Injekce Vvenv následované sekundární dávkou proteinu indukují tvorbu ELISA pozitivních protilátek. HlV-specifické protilátky byly testovány během celého imunizačního procesu pomocí pěti odlišných ELISA technik. ELISA techniky byly použity k měření relativní kvality, spíše než ·*· • · · · · ·· · < · ·· · · ·· • · ·· · ♦ ·· · · · • · « · · · · · · ··· ·« ·· ♦* ·· ·· absolutní kvantity protilátek v každém zvířeti. Ve většině případů, testy probíhaly s virovými fragmenty, které ztratily prostorovou a oligomerickou strukturu typickou pro nativní env protein. V těchto případech se předpokládá, že se v ELISA testu váže pouze subset HIV specifických protilátek.Výsledky získané Abbott ELISA testem jsou uvedeny na obr 6. Šimpanz 3 překročil hranice pozitivity po první VV imunizaci, zatímco šimpanz 4 tuto hranici překročil po druhé VVenv imunizaci. Intenzita imunitní reakce šimpanzů 3 a 4 na konci imunizačního procesu překročila dalece odpověď šimpanzů 1 a 2 V případě ELISA testu # 2 s MN gpl60, byl jediným silně odpovídajícím šimpanzem šimpanz 3. Tato reakce byla měřena pouze po prvních třech injekcích a nebyla tedy zesílena sekundární imunizací s proteinem. Reakce na CHO-LAI navázaný na ELISA destičkách (ELISA # 3) za použití stejného antigenu jaký byl použitý ve vyčištěné formě pro sekundární imunizaci, byla silně pozitivní opět u šimpanze 3. V ELISA testu # 4 s destičkami s navázaným IIB-gpl20, šimpanz 2 vykazuje silné pozadí a díky němu I pravděpodobně nejvyšší odpověď ze všech zvířatReakce měřené ELISA technikou # 5 s Oragon Technika lyzátem viru IIIB byla pozitivní u všech tří zvířat.

Neutralizační reakce proti primárním a laboratorním izolátům. Neutralizační reakce byly testovány se séry všech zvířat, proti primárním a laboratorním izolátům. První technika proběhla na T buněčné linii, pozdější pak na seronegativních PHA stimulovaných PBMC. Ve všech těchto případech neobsahovaly izoláty žádný z kmenů přítomných v HIV-1 vakcíně.

Jak ukazuje tabulka 3, vzorky ze šimpanzů 2, 3 a 4 vykazují pozitivní ovlivnění (35 až 40 % inhibice růstu viru) efektu proti MN laboratornímu izolátu na T buňkách. Tato technika se dvěma jinými laboratorními viry (první IIIB (Lockey et al., Aids. Res. Hum. Retroviruses 12:1297-1299 (1996) a druhý SF2) nepřinesla pozitivní výsledky s žádným vzorkem.Výsledky neutralizační reakce (Montefiory et al., 1988, supra, Montefiory et al., 1996, supra) se všemi čtyřmi primárními izoláty testované na PHA stimulovaných PBMC, jsou zobrazeny. Virus je zřejmě velmi obtížné tímto způsobem neutralizovat, a séra pacientů vykazují negativní výsledky i když je použito ředění 1:2 (Fenyo et al., AIDS 10:S97-S106 (1996), Moore and Ho AIDS 9:S117S136 (1995), Montefiory et al., 1996, supra). Je zajímavé, že sérum ze šimpanze 4 ředěné 1:4, bylo schopno neutralizovat jeden z testovaných primárních izolátů. Situace je tedy odlišná od zkušeností ostatních s env vakcínou, stejně jako v mnoha předešlých případech, séra ze zvířat imunizovaných env vykazují negativní neutralizační reakci proti primárním izolátům (Steele Journal of NIH Research 6:40-42 (1994), Moore, Nátuře 376:115 (1995)).

fe·· • · · · · • · · ·· ··· · · · · · • · · · · ·« ·« ·· ·· ·· • · · · • · ·· • >·· · · • · · ·· ··

Tabulka 3

Neutralizace virových kmenů nepřítomných ve vakcíně pomocí šimpanzích antisér

Izolát Šimpanz 1	Šimpanz 2	Šimpanz 3	Šimpanz 4
Laboratorní	pozitivní	pozitivní	pozitivní
kmen MN	reakce	reakce	reakce
Primární #1 -	-	-	-
Primární # 2 -	-	-	-
Primární #3 -	-	-	pozitivní

Primární #4 Směs Vvenv indukuje tvorbu kvalitnějších anti HIV-1 specifických protilátek, než jeden kmen Vvenv. Závěry ELISA techniky a neutralizační reakce jsou shrnuty v tabulce 4, která zobrazuje ty šimpanze jejichž séra vykazovala nej silnější reakci ve výše popsaných sedmi testech. Jak jez tabulky vidět, šimpanzi 3 a 4 reagovali pozitivně v pěti testech ze sedmi, zatímco šimpanzi 1 a 2 reagovali pozitivně pouze ve třech případech ze sedmi. Z toho vyplývá, že polyenv vakcína indukuje tvorby kvalitnějších protilátek, než jeden kmen env vakcíny.

• · ·· • · · · • · · · »· · ·

Tabulka 4

Shrnutí výsledků ELISA technik a neutralizačních testů

Šimpanz s nej silnější reakcí po aplikaci směsi VV

Technika

Šimpanz s nej silnější reakcí po aplikaci jednoho typu VV

Abbott (IIIB gp41)

- ELISA # 1

MNgplóOBAC

- ELISA # 2 šimpanz 3 a 4 šimpanz 3

IIIB-gpl20-BAC šimpanz 2

- ELISA # 3

LAI-gpl20-CHO

- ELISA # 4 šimpanz 3

Illb virový lyzát šimpanz 1 a 2

- ELISA # 5 šimpanz 3 a 4

Neutralizační reakce šimpanz 2

- laboratorní izoláty šimpanz 3 a 4

Neutralizační reakce šimpanz 4

- primární izoláty

Diskuse

Experimenty popsané v těchto příkladech byly připraveny tak, aby testovaly bezpečnost HIV-1 vakcíny založené na viru vakcinie a srovnaly účinnost indukce imunitní odpovědi vyvolané jedním kmenem viru nebo směsí virů exprimujících obalové proteiny. Závěry ukazují, že virus • · • · · ··· · · · · _

....... · · ··;? · • · · · · · · · «· ·· ·· ·· ·· vakcinie může být použit jako imunogen bez hrozby tvorby otevřených lézí a za druhé bylo prokázáno, že vakcínou obsahující směs obalových proteinů je možné indukovat velmi širokou anti HIV-1 specifickou imunitní reakci.

Šimpanzí model, umožňuje testování bezpečnosti polyenv vakcíny na primátech. Konkrétně jsme se zajímali o případnou tvorbu otevřených lézí, čímž by mohl inokulovaný živý V V ohrozit neimunizovaného pacienta. V případě HIV, existuje vážná hrozba, že AIDS pozitivní pacienti by nemuseli být schopni zastavit infekci VV. Z tohoto důvodu jsme testovali použití subkutánní vakcinace na šimpanzích, s otázkou, zdaje možné vyhnou se tvorbě otevřených lézí. Skutečně, v tomto případě pouze u dvou ze čtyř šimpanzů se otevřené léze objevily. Podobných výsledků jsme dosáhli při klinických testech za použití subkutánní injikace dávek viru vakcinie NYCDH, při očkování proti neštovicím (Connor et al., Journal of Infectious Diseases 135:167-175 (1977), Benenson et al., Journal of Infectious Diseases 153:135-144 (1977)).

Je pravděpodobné, že se zvýšenou opatrností při aplikační proceduře a následnou péčí o místo vpichu se bude možné tvorbě otevřených lézí zcela vyhnout. Tyto výsledky ukazují, že není třeba virus vakcinie vyloučit jako virový vektor v HIV-1 vakcínách, z důvodů bezpečnosti.

Směs obalových proteinů byla testována na myších (příklad 2) a králících. V experimentech na myším modelu byly protilátky testovány pop jedné injekci Vvenv, zatímco u králíků byla primární dávkou DNA vakcína a Vvenv byla použita jako sekundární dávka. Experimenty ukazují, že VVenv může indukovat jako primární dávka i zesilovat jako sekundární dávka produkci anti HIV-1 protilátek a primární izoláty mohou neutralizovány touto humorální odpovědí. Ke zjištění potenciálu směsi VVenv (polyenv), byli šimpanzi rozděleni do dvou skupin. První skupinu tvořili dva šimpanzi, kteří obdrželi imunizační dávku pouze jedním kmenem Vvenv, zatímco šimpanzi 3 a 4, byli imunizováni směsí celkem třiceti odlišných typů Vvenv.

Po ukončení imunizace viry vakcinie, všichni čtyři šimpanzi dostali ještě jednu sekundární dávku gpl20/gp41 v aluum precipitátu. Séra ze všech čtyřech šimpanzů byla testována pěti odlišnými ELISA testy, z nichž každý používá jiný fragment a/nebo konfiguraci env. Je zajímavé, že šimpanzi 1 a 2 ve směsi odpovídají silně pouze v jednom z těchto ELISA testů, zatímco séra ze šimpanzů 3 a 4 ve směsi odpovídají ve 4 těchto testech. V každém z nich byla však měřena pouze frakce HIV-1 specifických protilátek v každém zvířeti, závěry čehož ukazují že směsná vakcína indukuje široké spektrum protilátek s vysokou vazebnou aktivitou.

Neutralizační technika byla také použita pro testování proti jak laboratorním tak primárním izolátům. Je zajímavé, že pozitivní odpověď proti primárním izolátům byla zaznamenána u šimpanze 4, ačkoliv primární izoláty nebyly specificky přítomné v směsné vakcíně. Závěry • · *

těchto experimentů také prokazují, že směsná polyenv vakcína indukuje široké spektrum protilátek. Zvýšení komplexity antigenů ve vakcíně může vést ke zvýšení diversity aktivovaných lymfocytů a tedy I protilátkové odpovědi.

Důkazy, že neutralizační protilátky mohou být vytvářeny proti primárnímu izolátu, který však nebyl přítomný ve vakcíně ukazují, že proteiny s odlišnou primární strukturou sdílejí podobné konformační motivy. Toto tvrzení, je také podpořeno důkazy, kdy imunitní odpověď HIV-1 pozitivních pacientů, náhodně vybraných z osob vystavených myriádám mutačně odlišných virů, chrání před superinfekcí podáním jiného kmenu. Použití polyenv reprezentuje první případ, kdy byla na šimpanzím systému modelována situace HIV-1 pozitivních pacientů. To znamená, že neutralizační protilátky jsou indukovány širokým spektrem proteinů, namísto jedním typem env proteinu.

Shrnuto, testovali jsme směsnou HIV-1 vakcínu založenou na V V zvanou polyenv na šimpanzím modelu. Byly demonstrovány tyto příklady:

1) VV může být použit jako vakcína, aniž by indukoval tvorbu otevřených kožních lézí.

2) Tato vakcína indukuje tvorbu širokého spektra anti HIV-1 specifických protilátek

3) Směs env konstruktů (polyenv) vykazuje indukci specifických protilátek vyšší kvality, než jeden env konstrukt.

Virus vakcinie je již dlouho známý jako potenciální vakcína, jak v divoké, tak v rekombinantní formě. Účinnost VV, je v jeho schopnosti indukovat jak cytotoxickou T-buněčnou tak Bbuněčnou imunitní odpověď. VV je jediná vakcína, která byla schopna kompletně zlikvidovat chorobu (neštovice) v lidské populaci. Výsledky uváděné v tomto příkladě naznačují, že rekombinantní VV vektory by v budoucnu mohly posloužit ke kontrole HIV-1 infekce.

PŘÍKLAD 4: Příprava bifunkčního plasmidů

DNA vakcína se ukázala být silným induktorem protilátkové i CTL reakce v řadě odlišných systémů (chřipka, HIV-1, atd.).DNA vakcíny proti chřipce a HIV-1 jsou v současné době v klinické fázi testování se zdravými dospělými dobrovolníky. Virus vakcinie, také slouží jako základ pro řadu dalších vakcinačních programů. Ve skutečnosti je VV jediná vakcína, která byla dosud schopna kompletně zlikvidovat chorobu (neštovice) v lidské populaci. Celá řada rekombinantní ch virů vakcinie indukuje ochrannou imunitní reakci, což dokazuje mnoho studií se zvířaty. Výše uvedená data ukazují účinnost polyenv vakcíny a kombinací vakcinačních strategií, např. DNA vakcíny a virové vakcíny.

Byl vytvořen bifunkční plasmid, který může sloužit jako DNA vakcína i jako V V rekombinantní vektor. Obr 7, ukazuje mapu tohoto plasmidů, který obsahuje CMV promotor, pro expresi v • · • · » · · « savčích buňkách a časný a pozdní promotor viru vakcinie, pro přípravu rekombinantního vektoru vakcinie. Přímá injekce vyčištěné plasmidové DNA, může být použita k indukci imunitní odpovědi proti env proteinu viru HIV u testovaných subjektů. Plasmid také může být použit k přípravě a testování živého, rekombinantního viru vakcinie, který slouží jako nosič env proteinu viru HIV.

Pacienti mohou být vakcinováni podle komplikovaného protokolu, používajícího jak DNA vakcinaci tak imunizaci rekombinantním kmenem viru vakcinie, podávaných v libovolném počtu, pořadí, ve směsi či v jednotlivých injekcích a/nebo v kombinaci s dalšími nosiči vakcíny. Smysl navrhovaného vynálezu, není limitován konkrétními příklady tak jak jsou zde uvedeny. Celá řada variant a možností, které zde nejsou uvedeny, vyplývá ze předchozích popisů a připojených vyobrazení a budou zcela zřejmá každému odborníkovi. Tyto modifikace jsou však zahrnuty ve smyslu připojených nároků. Dále je zřejmé, že všechny uvedené hodnoty týkající se počtu párů baží nukleotidové sekvence, nebo počtu aminokyselin, všechny molekulové váhy, udávané pro nukleové kyseliny a pro polypeptidy, jsou pouze přibližné a jsou zde uváděny jen pro popis.

Je zde citována řada publikací, které jsou zde uváděny v plné délce.

Seznam citací:

Ausubel et al., eds Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.,New York, NY (1987,1988,1989,1990,1991,1992,1993,1994,1995)

Avery's Drug Treatment: Principles and Practise of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, AIDS Press, LTD., Wiliams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)

Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994)

Berkov et al., eds. The Merck Manual, Fifteenth Edition, Merck and Co., Rakway, NJ (1987) Bimboim, H.C. and Doly., Nucleic Acid Res. 7:1513-1523 (1979)

Buck, C. and Paulino, M.S.eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae. 6^th Ed., American Type Culture Collection,

Rockville, MD (1990) • · ·· ·· ► · · « » · · · » · · « · « ·· · · • · *·· ·

Φ· · ·

8 ·· > I • ·

Bums and Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994)

Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)

Cooney et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993)

Creighton T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983)

DeVita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3^rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992)

D'Honcht, Vaccine 10(Suppl.):548-552 (1992)

Dorozynsky and Anderson, Science 252:501-502 (1991)

Ebadi. Pharmacology, Littlr Brown and Co., Boston, Ma (1985)

Eichberg, Int Conf. AIDS 7:88(1991)

Embretson et al., Nátuře 362:359-362 (1993)

Enami et al., J. Virol. 65:2711-2713 (1991)

Fauci, Science 264: 1072-1073) (May 1994)

Goodman et al., eds. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eigtheen Edition, Pergamon Press, Inc. Elamsford, NY (1990)

Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. (Suppl. 2):S 141 -143 (1994)

Gribskov a Burgess (Nucl. Acid Res. 14:6745 (1986)

Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992), J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993) • · · · · ♦ * • · ·· 99

9 · • · · ·· · · « 9 · « • · · ♦

Grundwald-Bearch et al., J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)

Hallenberger et al., Virology 193:51-514 (1993)

Hay, R. et al., eds. American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7^th Ed.,. American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), p. 48

Hirsch, M.S., and Curran, J. „Human imunodeficiency viruses, biology and medical aspects“, Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), pp. 1545-1570

Hu et al., Nátuře 328:721-723 (1987)

Ish-Horowicz, D. and Burke, J.F., Nucleic Acids Res. 9:2987-2998 (1981)

Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498 (1991)

Ito et al., Cancer. Res. 50:6915-6918 (1990)

Javaherian et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:6768-6772 (1989)

Katzung, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)

Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):S 139-143 (1994)

Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989)

Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987)

Luytjes et al., Cell 59:1107-1113 (1989)

Mackett, M. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982) • · ♦ φ φ · · φ • φ ·· 4

Mazzara G.P. et al., Methods in Enz. 217:557-581 (1993)

McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994)

Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)

Osol, A., ed. Remington'sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341.

Panicali D. and Paoletti E. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:4927-4931 (1982)

Pantaleo et al., Nátuře 362:355-358 (1993)

Rhim, J.S. et al., Int J. Cancer 15:23-29 (1975)

Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 8:1065-1071 (1992)

Richman: Annu Rev. Pharmacol. Toxico 33:149-146 (1993)

Richman: Antimicrob Agents Chemother 37:1207-1213 (1993)

Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994)

Richmond and McKinney, eds. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 3^rd Edition, U.S. Dept. of Health & Human Services, Washington DC (1993)

Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)

Schultz G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978)

Schwarz a Dayhoff eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reserch

Foundation, Washington, DC (1979)

Selenkaet al., Arch. Hyg. Bacteriol. 153:244-253 (1969)

Smith a Waterman Adv. Apl. Math. 2:482 (1981)

Starcích et al., Cell 45:637 (1986)

Towbin, H. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 76:4350 (1979)

United States Biochemical, Sequenase Version 2,0 -DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, lne., (1994)

Weir et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 79:1210-1214 (1982)

Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-1139 (1967)

Wong-Staal, „Human Imunodeficienci viruses and their replication“, Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), pp 1529-1543

Wrin et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)

Wu et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978)

Zagury et al., Nátuře 332:728-731 (1988) • φ ♦ ♦ • ·φ • ΦΦ • φ

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Celkové informace:

(i) Aplikant: St. Jude Children's Research Hospital

332 North Lauderdale PO Box 318

Memphis. TN 38101-0318 United States of America

Aplikanti/ vynálezci: Hurwitz, Julia L.

Coleclough Christopher Owens Randall J.

Slobod Karen (ii) Název vynálezu: Způsob přípravy a použití virových vektorů, pro směsnou polyenv vakcínu proti viru HIV (iii) Počet sekvencí: 7 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: Klauber & Jackson (B) Ulice: 411 Hackensack Avenue (C) Město: Hackensack (D) Stát:NJ (E) Země: USA (F) zip: 07601 (v) Počítačové médium:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Ralease # 1.0, Verze # 1.30 (vi) Aplikační data:

(A) Číslo aplikace: bude připojeno (B) Datum podání: v příloze (C) Klasifikace:

(vii) Zástupce/Agent:

(A) Jméno: Paul F. Fehlner (B) Registrační číslo: 35,135 (C) Reference/číslo složky: 13401011/PCT t

(viii) Telekomunikační informace:

(A) Talefon: 201-487-5800 (B) Telefax: 201-343-1684 (2) Informace o sekvenci Č. 1:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 27 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.l: AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTA (3) Informace o sekvenci Č. 2:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.2: CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT (4) Informace o sekvenci Č.3:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 32 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.3: GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT • · * I ·· • · · (5) Informace o sekvenci Č. 4:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 34 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.4: CCAGAGATTT ATTACTCCAA CTAGCATTCC AAGG (6) Informace o sekvenci Č. 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 28 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ IDNo.5: CATGTGTAA AATTAACCCC ACTCTGTG (7) Informace o sekvenci C. 6:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.6: TACAATTTCT GGGTCCCCTC CTGAGG (8) Informace o sekvenci Č. 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 880 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina φ φ φ φ φ φφφ • · · φ φ · · · ·· φφ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φ • ΦΦ φφ φφ • · • φ φ φ φ φ φ · (C) Počet řetězců: oba (D) Topologie: oba (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.7:

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Val

Ala

Met

Arg

Val

Lys

Glu

Ser

Gin

Met

Lys

1

5

-

10

15

Lys

Gin

His

Leu

Trp

Arg

Trp

Gly

Trp

Arg

Trp

Gly

Thr

Met

Leu

Leu

20

25*

30

Gly

Leu

Met

Ile

Cys

Ser

Ala

Thr

Glu

Lys

Leu

Trp

Val

Thr

Val

Tyr

35

40

45

Tyr

Gly

Val

Pro

Val

Trp

Lys

Glu,Ala

Thr

Thr

Thr

Leu

Phe

Cys

Ala

50

55

60

Ser

Asp

Ala

Lys

Ala

Tyr

Asp

Thr

Glu

Val

His

Asn

Val

Trp

Ala

Thr

65

70

75

80

His

Ala

Cys

Val

Pro

Thr

Asp

Pro

Asn

Pro

Gin

Glu

Val

Val

Leu

Val

85

90

95

Asn

Val

Thr

Glu

Asn

Phe

Asn

Met

Trp

Lys

Asn

Asp

Met

Val

Glu

Gin

100

105

110

Met

His

Glu

Asp

Ile

Ile

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Ser

Leu

Lys

Pro

Cys

115

120

125

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Leu

Cys

Val

Ser

Leu

Lys

Cys

Thr

Asp

Leu

Lys

130 135 140

Asn 145

Asp

Thr

Asn

Thr

Ser 150

Asn

Asn

Val

Thr

Ser 155

Ser

Ser

Trp

Gly

Arg 160

Asn

Ile

Met

Glu

Glu 165

Gly

Glu

Ile

Lys

Asn 170

Cys

Ser

Phe

Asn

Ile 175

Ser

Thr

Ser

Ile

Arg 180

Gly

Lys

Val

Gin

Lys 185

Glu

Tyr

Ala

Phe

Phe 190

Tyr

Lys

Leu

Asp

Ile 195

Ile

Pro

Ile

Asp

Lys 200

Gly

Asn

Asp

Ser

Asn 205

Asp

Thr

Thr

Ser

Tyr 210

Lys

Phe

Thr

Leu

Thr 215

Ser

Cys

Asn

Thr

Ser 220

Val

Ile

Thr

Gin

Ala 225

Cys

Pro

Lys

Val

Ser 230

Phe

Glu

Pro

Ile

Pro 235

Ile

His

Tyr

Cys

Ala 240

Pro

Ala

Gly

Phe

Ala 245

Ile

Leu

Lys

Cys

Asn 250

Asn

Lys

Thr

Phe

Asn 255

Gly

Thr

Gly

Pro

Cys 260

Thr

Asn

Val

Ser

Thr 265

Val

Gin

Cys

Thr

His 270

Gly

Ile

Arg

Pro

Val 275

Val

Ser

Thr

Gin

Leu 280

Leu

Leu

Asn

Gly

Ser 285

Leu

Ala

Glu

I ♦ · ·· • « · * • 1 11 lil 1 · • 1 Φ ·* ·♦ • 1 • 1 ·♦ φ· • 1 1 1 • 1 11 • 11 ι • · * · ·· ♦·

Glu Glu Val

Val

Ile

Arg Ser 295

Ala Asn

Phe Thr Asp Asn Ala 300

Lys

Thr

290

Ile

Ile

Val

Gin

Leu

Asn

Gin

Ser

Val

Glu

Ile

Asn

Cys

Thr

Arg

Pro

305

310

315

320

Asn

Asn

Asn

Thr

Arg

Lys

Ser

Ile

Arg

Ile

Gin

Arg

Gly

Phe

Gly

Arg

325

330

335

Ala

Phe

Val

Thr

Ile

Gly

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

Met

Arg

Gin

Ala

His

340

345

350

Cys

Asn

Ile

Ser

Arg

Ala

Lys

Trp

Asn

Asn

Thr

Leu

Lys

Gin

Ile

Asp

355

-

360

365

Ser

Lvs

Leu

Arg

Glu

Gin

Phe

Gly

Asn

Asn

Lys

Thr

Ile

Ile

Phe

Lys

370

375

380

Gin

Ser

Ser

Gly

Gly

Asp

Pro

Glu

Ile

Val

Thr

His

Ser

Phe

Asn

Cys

385

390

395

400

Gly

Gly

Glu

Phe

Phe

Tyr

Cys

Asn.

Ser

Thr

Gin

Leu

Phe

Asn

Ser

Thf

405

410

415

Trp

Phe

Asn

Ser

Thr

Trp

Ser

Thr

Lys

Gly

Ser

Asn

Asn

Thr

Glu

Gly

420

425

430

Ser

Asp

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Cys

Arg

Ile

Lys

Gin

Ile

Ile

Asn

Met

435

440

445

Trp

Gin

Glu

Val

Gly

Lys

Ala

Met

Tyr

Ala

Pro

Pro

Ile

Ser

Gly

Gin

450

455

460

Ile

Arg

Cys

Ser

Ser

Asn

Ile

Thr

Gly

Leu

Leu

Leu

Thr

Arg

Asp

Gly

465

470

475

480

Gly

Ala

Asn

Glu

Asn

Asn

Glu

Ser

Glu

Ile

Phe

Arg

Pro

Gly

Gly

Gly

485

490

495

Asp

Met

Arg

Asp

Asn

Trp

Arg

Ser

Glu

Leu

Tyr

Lys

Tyr

Lys

Val

Val

500

505

510

Lys

Ile

Glu

Pro

Leu

Gly

Val

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Lys

Arg

Arg

Val

515

520

525

Val

Gin

Arg

Glu

Lys

Arg

Ala

Val

Gly

Glu

Ile

Gly

Ala

Leu

Phe

Leu

530

535

540

Gly

Phe

Leu

Gly

Ala

Ala

Gly

Ser

Thr

Met

Gly

Ala

Ala

Ser

Met

Thr

545

550

555

560

Leu

. Thr

Val

Gin

. Ala

i Arg

Gin

. Leu

i Leu Ser Gly Ile

Val

Gin Gin Gin

565 570 575

Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu 5Θ0 585 590

Thr Val Trp Gly Ile Lys Gin Leu Gin Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu 595 600 605

Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly 610 615 620

Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn 625 630 635 640

9 «

fcfc • fcfc • · · · fc * » • »♦* • · »·♦ fcfc • ♦ · · • · fcfc

V 9 9 9 9

9 · ·

9 9» • * • fc • · fc ♦ • fc

Lys

Ser

Leu

Glu

Gin 645

Ile

Trp

Asn

Asn

Met 650

Thr

Trp

Met

Glu

Trp 655

Asp

Arg

Glu

Ile

Asn 660

Asn

Tyr

Thr

Ser

Leu 665

Ile

His

Ser

Leu

Ile 670

Glu

Glu

Ser

Gin

Asn 675

Gin

Gin

Glu

Lys

Asn 680

Glu

Gin

Glu

Leu

Leu 685

Glu

Leu

Asp

Lys

Trp 690

Ala

Ser

Leu

Trp

Asn 695

Trp

Phe

Asn

Ile

Thr 700

Asn

Trp

Leu

Trp

Tvr 705

Ile

Lys

Leu

Phe

Ile 710

Met

Ile

Val

Gly

Gly 715

Leu

Val

Gly

Leu

Arg 720

Ile

Val

Phe

Ala

Val 725

Leu

Ser

Val

Val

Asn 730

Arg

Val

Arg

Gin

Gly 735

Tyr

Ser

Pro

Leu

Ser 740

Phe

Gin

Thr

His

Leu 745

Pro

Ile

Pro

Arg

Gly 750

Pro

Asp

Arg

Pro

Glu 755

Gly

Ile

Glu

Glu

Glu, Gly 760 '

Gly

Glu

Arg

Asp 765

Arg

Asp

Ser

Ile 770

Arg

Leu

Val

Asn

Gly 775

Ser s

Leu

Ala

Leu

Ile 780

Trp

Asp

Asp

Leu

Arg 785

Ser

Leu

Cys

Leu

Phe 790

Ser

Tyr

His

Arg

Leu 795

Arg

Asp

Leu

Leu

Leu 800

Ile

Val

Thr

Arg

Ile 805

Val

Glu

Leu

Leu

Gly 810

Arg

Arg

Gly

Trp

Glu 815

Ala

Leu

Lys

Tyr

Trp 820

Trp

Asn

Leu

Leu

Gin 825

Tyr

Trp

Ser

Gin

Glu 830

Leu

Lys

Asn

Ser

Ala 835

Val

Ser

Leu

Leu

Asn 840

Ala

Thr

Ala

Ile

Ala 845

Val

Ala

Glu

Gly

Thr 850

Asp

Arg

Val

Ile

Glu 855

Val

Val

Gin

Gly

Ala 860

Tyr

Arg

Ala

Ile

Arg 865

His

Ile

Pro

Arg

Arg 670

Ile

Arg

Gin

Gly

Leu 875

Glu

Arg

Ile

Leu

Leu 880

T>V 2242-32

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polyenv vakcína vyznačující se tím, že je složená z alespoň 4 do přibližně 10 000 odlišných rekombinantní ch virů, z nichž každý obsahuje variantu env (EV) nukleotidové sekvence kódující odlišnou variantu obalového proteinu lidského viru získané imunodeficience (HIV), a kde

   a) nukleotidová sekvence EV kóduje jak variabilní tak konstantní oblasti variant obalového proteinu

   b) polyenv vakcína je schopna vyvolat alespoň buď buněčnou nebo humorální imunitní odpověď u savců proti kmenům viru HIV.
2. 2. Polyenv vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje od přibližně 10 do přibližně 100 rekombinantní ch virů exprimujících odlišné varianty proteinu env viru HIV.
3. 3. Polyenv vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že použitý rekombinantní virus je buď vakcinie, virus kanáři ch neštovic, adeno virus, nebo adeno - asociovaný virus (AAV).
4. 4. Polyenv vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že varianta obalového proteinu obsahuje gpl20 a část gp41 umožňující oligomerizaci env proteinů.
5. 5. Polyenv vakcína podle nároku 4 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence EV obsahuje Knpl - BsmI restrikční fragment nukleotidové sekvence kódující obalový protein viru HIV.
6. 6. Polyenv vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence EV je izolovaná z pacientů infikovaných virem HIV, z geograficky odlišných oblastí nebo z pacientů infikovaných virem HIV z odlišných prostředí.
7. 7. Polyenv vakcína podle nároku 9 vyznačující se tím, že vakcína obsahuje varianty obalového proteinu exprimované rekombinantním virem.
8. 8. Polyenv vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans a antivirové chemoterapeutické složky.
9. 9. Způsob výroby polyenv vakciny složené ze směsi alespoň 4 až do přibližně 10 000 odlišných rekombinantních virů vyznačující se tím, že

   i) každý rekombinantní virus obsahuje variantu env (EV) nukleotidové sekvence kódující odlišnou variantu obalového proteinu viru HIV ii) nukleotidová sekvence EV kóduje jak variabilní tak konstatní oblasti varianty obalového proteinu iii) polyenv vakcína je schopná indukovat alespoň buď buněčnou nebo humorální imunitní odpověď u savců proti kmenům HIV.
10. 10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že je kombinováno od přibližně 10 do přibližně 100 rekombinantních virů obsahujících odlišné varianty env viru HIV.
11. 11. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že použitý rekombinantní virus je buď vakcinie, virus kanářích neštovic, adenovirus, nebo adeno - asociovaný virus (AAV).
12. 12. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že varianta obalového proteinu obsahuje gpl20 a část gp41 umožňující oligomerizaci env proteinů.
13. 13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence EV obsahuje Knpl BsmI restrikční fragment nukleotidové sekvence kódující obalový protein viru HIV.
14. 14. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence EV je izolovaná z pacientů infikovaných virem HIV, z geograficky odlišných oblastí nebo z pacientů infikovaných virem HIV z odlišných prostředí.
15. 15. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že vakcína obsahuje varianty obalového proteinu exprimované rekombinantním virem.
16. 16. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans a antivirové chemoterapeutické složky.
17. 17. Polyenv vakcína vyznačující se tím, že byla získána způsobem podle nároku 9.

    ·· ·*· ♦ 4

    4 · 4 4

    4 «< · • 4·

    4· ♦ · * * • · 4 4 • 4 *· • 4 4

    4 ·

    44'*- * 4 ·

    4*
18. 18. Způsob indukce humorální, buněčné nebo obou typů imunitních reakcí proti lidskému viru získané imunodeficience (HIV) u savců vyznačující se tím, že je vyvolána efektivním množstvím polyenv vakcíny dle nároků 1 až 8.
19. 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že rekombinantní virus je virus vakcinie a vakcína je podávána subkutánně.
20. 20. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že savcům je podáváno efektivní množství vakcíny podle nároků 1 až 8, kde rekombinantní virus obsažený v další polyenv vakcíně je jiného druhu než rekombinantní virus dle nároku 18.
21. 21. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že humorální, buněčná nebo oba typy imunitních reakcí jsou vyvolávány (primární dávka) i zintenzivňovány (sekundární dávka) (i) aplikací efektivního množství alespoň jednoho rekombinantního proteinu viru HIV, nebo (ii) efektivního množství alespoň jednoho DNA vektoru kódujícího expresivní rekombinantní env protein viru HIV (iii) nebo obojí, kde DNA vektor může být aplikován jako primární dávka, nebo zároveň s rekombinantním HIV env proteinem.
22. 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že env protein viru HIV je ve směsi s adjuvans, nebo je podáván intramuskulámě, nebo obojí, či kde DNA vektor je aplikován pomocí zařízení gene gun.
23. 23. Bifunkční plasmid podle nároku 24 vyznačující se tím, že zvířecí sekvence kontrolující expresi je velmi časný promotor cytomegaloviru (CMV) a virová sekvence kontrolující expresi je časný promotor viru vakcinie, nebo pozdní promotor viru vakcinie, nebo obojí.
24. 24. Bifunkční plasmid podle nároku 24 obsahující heterologní gen vyznačující se tím, že heterologní gen je nukleotidové sekvence env varianty (EV) obsahující jak variabilní tak konstantní sekvence variant obalového proteinu viru HIV.