UA73712C2 - Multi-envelope vaccines against hiv, method for generating cellular and/or humoral immune response against hiv in mammals, bifunctional plasmid used for producing recombinant viruses comprising anti-hiv vaccine - Google Patents

Multi-envelope vaccines against hiv, method for generating cellular and/or humoral immune response against hiv in mammals, bifunctional plasmid used for producing recombinant viruses comprising anti-hiv vaccine Download PDF

Info

Publication number
UA73712C2
UA73712C2 UA98084523A UA98084523A UA73712C2 UA 73712 C2 UA73712 C2 UA 73712C2 UA 98084523 A UA98084523 A UA 98084523A UA 98084523 A UA98084523 A UA 98084523A UA 73712 C2 UA73712 C2 UA 73712C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
hiv
virus
vaccine
envelope
recombinant
Prior art date
Application number
UA98084523A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of UA73712C2 publication Critical patent/UA73712C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Опис винаходу
Ця робота була частково підтримана грантами МС! КО1-СА57419-03 та грантом Сапсег Сепіег Зуррогї Соге 2 РЗО-СА21765, грантами МІН-МІАІЮ АІ-32529 та РО1-АІ31596-04. Згідно з цим, уряд США має певні права на цей винахід.
Даний винахід відноситься до вірусних вакцин, зокрема до поліоболонкових вірусних вакцин проти вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), до способу генерації гуморальної та/або клітинної відповіді та біфункціональної плазміди.
Вірус СНІД може призвести до загибелі десятків мільйонів життів до 2000 року, складаючи першочергову турботу у галузі охорони здоров'я в усьому світі |дивись ЮОе Міга та ін., АІО5З, ЄКоіІоду, Оіадповзів, Тгтеаітепі апа Ргемепіоп, З еайіоп, У.В.Іірріпсой Со., РнНіадеірніа, РА (1992); Муопд-егаїЇ, у книзі Мігоіоду, рр.1529-1543; та Нігзсп та ін., у книзі Мігоіоду, рр.1545-1570)Ї. Завдання розробки ефективної вакцини проти
ВІЛ кидає особливий виклик імунологам, оскільки фермент зворотної транскриптази, що бере участь у реплікації т ВІЛ, має високу ступінь помилок. Це призводить до появи багатьох мутантних штамів ВІЛ, які мають білки зовнішнього покриття чи оболонки з варіантними білкових послідовностей. Ці варіантні оболонкові білки часто розпізнаються імунною системою ссавця, яка продукує щодня більше 10 9 нових лімфоцитів з єдиною метою боротьби з чужими антигенами, як різні антигени. В- та Т-клітини є, відповідно, гуморальними та клітинними ор / Компонентами імунної реакції.
Гарний приклад кількісної сили такої імунної реакції продемонстровано у ВІЛ-інфікованих пацієнтів та
ЗІМ-інфікованих макак. У кожному випадку відбуваються послідовні цикли інфекції, імуногенності та утворення варіантних ВІЛ чи ІМ |МУгіп та ін., У. Асаціг,. Іттипе Оеїйс. Зупаг., 7:211-219 (1994); Вигпз апа Оезговіегв,
Сиг. Торісв МісгобріоЇ. Іттипої., 188:185-219 (19943). З кожним циклом різноманітність антигенних детермінант сч 25 ВІЛ (і відповідних імунних реакцій) підвищується, так що ці імунні реакції нейтралізують широкий спектр варіантів ЗІМ та ВІЛ, і суперінфекція у значній мірі інгібується. (о)
Однак у пацієнтів, які страждають на СНІД, розвиваються компромісні імунні реакції, яких вже недостатньо для того, щоб попередити перемогу вірусної інфекції ВІЛ над імунною системою пацієнта. Частково це може бути викликано утворенням варіантів ВІЛ, що мають варіантні оболонкові білки, які не розпізнаються імунною сч зр Системою пацієнта, і тому уникають знищення (Зсі. Атег., Ацд. 1995). У таких випадках, навіть якщо імунна реакція здатна попередити інфекцію де помо, (наприклад, персистентну мутацію вірусу у привілейованих «- секвенованих ділянках), інфекція ВІЛ може згодом перемогти імунну реакцію пацієнта |Рапіаїео та ін., Майиге, їм 362:355-358 (1993); Етьгеївгоп та ін., Майшге, 362:359-362 (1993)).
Ідентифікація антигенних детермінант В- та Т-клітин у вірусів ВІЛ залишається незавершеною. Оболонковий со 35 білок ВІЛ було охарактеризовано як такий, що має варіабельну (М1-М5) та сталу (С1-С5) ділянки. Пептид, М характерний для ділянки М3, було названо головною нейтралізуючою детермінантою (ГНД) (РМО, ргіпсіраї! пецігаїігіпуд дебегтіпап Юамайегіап та ін., Ргос. Май. Асад. Зсі (О5А), 86:6768-6772 (1989)), хоч інші ділянки оболонкового білка також можуть бути причетними до викликання імунної реакції. Повна довжина оболонкового білка ВІЛ становить від 850 до 900 амінокислот, причому варіації довжини спричинені « гіпермутацією (|еагсісп та ін., СеїЇ, 45:637 (1986)). -о
Перші вакцини проти ВІЛ, для яких було проведено клінічні випробування, були розроблені таким чином, щоб с симулювати для імунної системи окремі оболонкові білки, або їх ділянки. Однак нейтралізуючі реакції щодо :з» якогось окремого чи кількох оболонкових білків не розпізнають різні ізоляти ВІЛ, і люди не були захищені проти інфекції (Веїзне та ін., у). Ат. Мей. Аззос, 272:431-431 (1994); патент США Мо5169763; публікація РСТ УМО 415 87/06262; 7адигу та ін., Майшге, 332:728-731 (1988); Кіепу та ін., Іпї Сопі. АІЮБ, 5:541 (1989); Еіспрега, -1 Іпї. Сопі. АІЮО5, 7:88 (1991); Соопеу та ін., Ргос. Май. Асай. сі (05А), 90:1882-1886 (1993); Сгапат та ін.,
У. Іпїесї. Оів., 166:244-252 (1992); 9. Іпївсії. Оів., 167:533-537 (1993); Кеегег та ін, АБ Кев. Нит. і95) Кеїгоміг., 10 (Зиррі.2):5139-143, (1994); Согве, АІО5Б Кев. Нит. Кеїгоміг., 10 (Биррі.2):5141-143, (1994); -1 МеЕЇїгайй та ін., 9. Іптесі. Оів., 169:41-47 (1994); Рашсі, Зсіепсе, 264:1072-1073 (Мау 1994)).
Відповідно з цим, існує довгоочікувана та нагальна потреба виявлення вакцин та способів, що викликають -й імунну реакцію, достатню для лікування чи попередження ВіІЛ-інфекцій.
Кз Задачею винаходу є надання вірусної вакцини, здатної викликати у ссавця клітинну та/або гуморальну відповідь проти ВІЛ. Зокрема, перевагою поліоболонкової вакцини за винаходом є те, що вона викликає більш сильну імунну реакцію. Сила даного винаходу полягає у його здатності поповнювати популяцію В-клітина, вв Хелперних Т-клітин та цитотоксичних Т-клітин, що представляють собою складові імунної реакції для забезпечення ефективного гуморального та клітинного імунітету. Наприклад, даний винахід викликає широкий (Ф) спектр дій ВІЛ-специфічних антитіл. Тести на нейтралізацію ВІЛ демонструють, що одержані антитіла мають г найвищу якість. Несподівано виявилося, що винахід може генерувати імунну реакцію проти "наївних" штамів ВІЛ, тобто штамів ВІЛ, оболонкові білки яких не включено до поліоболонкової вірусної вакцини. во Задача винаходу вирішується поліоболонковою вакциною, що містить, принаймні, від приблизно 4 до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів, кожний з яких експресує певний варіант білка оболонки (епху) вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), причому вказаний варіант містить як варіабельні, так і константні ділянки білка оболонки ВІЛ, і дана вакцина здатна викликати у ссавця, принаймні, клітинну та гуморальну відповідь проти штаму ВІЛ. ве Згідно з переважним варіантом винаходу поліоболонкова вірусна вакцина містить від приблизно 10 до приблизно 100 різних рекомбінантних вірусів, що екс пресують певний варіант оболонки ВІЛ.
Згідно з другим варіантом, якому надається перевага, рекомбінантні віруси обираються із групи, що складається з коров'ячої віспи, аденовірусу та аденоасоційованого вірусу (ААВ).
Згідно з наступним варіантом втілення, якому надається перевага, вакцина рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи за винаходом вводиться підшкірно. Перевагою винаходу є те, що підшкірне введення вірусу коров'ячої віспи не призводить до утворення пошкодження, що дозволяє уникнути вивільнення інфекційної коров'ячої віспи, яка становить потенційну загрозу для імунокомпромісного населення.
Бажано, поліоболонкова вакцина рекомбінантного вірусу за винаходом включає лізат інфікованих вірусом клітин росту, наприклад, клітин веро, що містять на додаток до інфекційного вірусу експресовані варіанти 7/0 білків оболонки (далі: оболонкового білка). Включення лізату варіантів оболонкових білків, який сприяє імунній реакції, є особливою відзнакою даного винаходу, оскільки звичайно вірус очищають від лізату клітин росту.
У вакцинах згідно з винаходом варіант білка оболонки ВІЛ належить вірусу, виділеному у хворих, інфікованих вірусом імунодефіциту людини з географічно обмеженого району або варіантами ВІЛ.
Автори даного винаходу знайшли, що поліоболонкові вакцини за даним винаходом викликають несподівано підсилені імунні реакції за рахунок експресії та/"або представлення багатьох варіантів оболонкового білка, кожен з яких містить як константні, так і варіабельну ділянки, бажано такого, що має структуру, яка є по суті аналогічною до структури природного оболонкового білка ВІЛ. Підсилені імунні реакції розпізнають штами ВІЛ окрім тих штамів, що експресують оболонкові білки, які представлені в поліоболонковій вакцині. Таким чином, го вакцина за винаходом забезпечує підсилені імунні відповіді на широкий круг штамів ВІЛ, які придатні для лікування або попередження зараження (або тривалої інфекції внаслідок мутації) різних штамів вірусу.
Даний винахід пропонує також нуклеїнову кислоту варіанту оболонки (епм магіапі, ЕМ), що кодує (або є комплементарним до) принаймні один антигенний детермінант варіанту оболонкового білка (ВОБ). ВОБ бажано кодується рекомбінантним вірусом, як це додатково передбачено у поліоболонковій вакцині за даним винаходом. с
Варіант нуклеїнової кислоти включає принаймні одну мутацію, що надає кодованому ВОБ різних антигенних властивостей, або тривимірну структуру. і)
Даний винахід пропонує також композицію вакцини, до якої входять поліоболонкова вакцина за даним винаходом та фармацевтично прийнятний носій чи розріджувач. Композиція вакцини може додатково включати ад'ювант та/або цитокін, який підсилює імунну реакцію поліоболонкової вакцини щодо принаймні одного штаму с зо ВІЛ У ссавця при введенні йому композиції вакцини. Поліоболонкова вакцина за даним винаходом здатна індукувати імунну реакцію, яка включає принаймні одну гуморальну імунну реакцію (наприклад, антитіла) і -- клітинну імунну реакцію (наприклад, активацію В-клітин, хелперних Т-клітин та цитотоксичних Т-клітин (СТІ). М
Даний винахід також пропонує спосіб викликання імунної реакції до ВІЛ-інфекції у ссавця, який є профілактичним щодо ВІЛ-інфекції. Спосіб включає введення ссавцю композиції вакцини, яка включає ме) поліоболонкову вакцину за даним винаходом, яка захищає ссавця проти клінічної ВІЛ-пов'язаної патології, ї- спричиненої інфекцією щонайменше одним штамом ВІЛ.
Даний винахід також пропонує спосіб викликання імунної реакції до ВІЛ-інфекції у ссавця з метою лікування
ВІЛ-інфекції. Спосіб включає введення ссавцю композиції що включає інактивовану чи послаблену поліоболонкову вакцину за даним винаходом, яка викликає у ссавця підсилену, порівняно з контрольною групою, « імунну реакцію проти клінічної вірусної патології, спричиненої щонайменше одним штамом ВІЛ. з с У другому варіанті здійснення винаходу профілактичний або терапевтичний спосіб викликання імунної . відповіді проти ВІЛ включає введення ефективної кількості двох поліоболонкових вірусних вакцин, що містять, и?» принаймні, від приблизно 4 до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів, кожний з яких експресує певний варіант білка оболонки (епу) вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), в яких рекомбінантні віруси імунодефіциту людини (ВІЛ) належать до різних типів. -І Специфічна до ВІЛ імунна відповідь (гуморальна та/або клітинна імунна відповідь), викликається поліоболонковою вакциною з рекомбінантних вірусів згідно з даним винаходом, може бути додатково о праймований або підсилений шляхом (а) введення ефективної кількості, принаймні, одного рекомбінантного -І білка оболонки ВІЛ та/або (б) ефективної кількості, принаймні, одного ДНК-вектора, що забезпечує експресію рекомбінантного білка оболонки ВІЛ, причому ДНК-вектор може бути введений перед, після або одночасно з - рекомбінантним білком оболонки ВІЛ.
Ге Бажано, коли рекомбінантний білок оболонки ВІЛ перед введенням змішують з ад'ювантом та/або вводять внутрішньом'язово, та/(або рекомбінантний білок оболонки ВІЛ змішують з адювантом та вводять внутрішньом'язово. ДНК-вектор вводять згідно з методикою "вистрілювання генів".
Описані вище способи за винаходом забезпечують стимул для створення методами генної інженерії нового плазмідного вектора. Даний винахід пропонує біфункціональну плазміду, що використовується для одержання (Ф, рекомбінантних вірусів, що входять до складу вакцини за винаходом, що містить ксеногенний ген, який кодує ка варіант білка оболонки ВІЛ, що включає як варіабельні, так і константні ділянки вказаного білка, причому даний ген знаходиться під контролем послідовностей, що регулюють експресію, двох типів, а саме, послідовності бо передраннього промотора цитомегаловірусу та послідовності раннього промотора вірусу коров'ячої віспи та/або пізнього промотора вірусу коров'ячої віспи.
Інші об'єкти, особливості, переваги, галузі застосування та варіанти втілення даного винаходу будуть зрозумілі для кваліфікованих спеціалістів в даній галузі техніки із наведеного нижче детального опису та прикладів, що стосуються даного винаходу. 65 Фігура 1. Схематичне зображення орієнтації гена ВІЛ-1 у геномі вірусу коров'ячої віспи. Ген оболонки
ВІЛ-1 розташований між правим та лівим сегментами локусу тимідинкінази. Сайт Ніпап знаходиться на С-кінці гена оболонки ВІЛ-1. Відповідна вставка дає змогу одержати фрагмент Ніпаї розміром приблизно 7КЬ. Аналіз методом саузерн-блотінга цього набору генів підтверджує положення та точну орієнтацію гена оболонки ВІЛ-1.
Фігура 2. Графічне зображення даних, що показують довгостроковість ВІЛ-специфічної реакції антитіл у моделях ссавців. Зображено результати тестування типових зразків мишачої сироватки методом ЕГІЗА на
ВІЛ-специфічні антитіла. Кожен зразок розводили у співвідношенні 1:100 (суцільні стовпчики), 1:1000 (заштриховані стовпчики) та 1:10000 (незафарбовані стовпчики) перед проведенням аналізу на
ЕПЗА-планшетах з нанесеним ВІЛ-1. Зразки у підданих тестуванню мишей відбирали через різний час (1 місяць, 4 місяці та 6 місяців) після ін'єкції 10 7 ри (бляшкоутворюючих одиниць) комплексу вірусу коров'ячої віспи, який 70 експресує один оболонковий білок ВІЛ-1. Мишей у контрольній групі імунізували вірусом коров'ячої віспи, який не містив оболонкової послідовності. Наведено величини стандартної похибки виміру.
Фігура 3. Графічне зображення даних, що показують вплив дози вірусу коров'ячої віспи на індукування принаймні однієї імунної реакції, включаючи продукування ВІЛ-специфічних антитіл. Типові зразки мишачої сироватки піддавали аналізу методом ЕГІЗА на планшетах з нанесеним ВІЛ-1. Зразки сироватки відбирали у 75 мишей, яким було зроблено ін'єкцію 109, 1092 та 107 ри (бляшкоутворюючих одиниць) одного вірусу коров'ячої віспи, що експресує оболонковий білок ВІЛ-1. Тестування зразків сироватки проводили приблизно через три тижня після ін'єкції Кожен зразок розводили у співвідношенні 1:100 (суцільні стовпчики), 1:1000 (заштриховані стовпчики) та 1:10000 (незафарбовані стовпчики) перед проведенням аналізу на
ЕПІЗА-планшетах з нанесеним ВІЛ-1. Наведено величини стандартної похибки виміру.
Фігура 4. Графічне зображення даних, які показують, що змішування комплексів вірусу коров'ячої віспи не компрометує вироблення ВІЛ-специфічних антитіл у ссавців, яким було зроблено ін'єкцію. Типові зразки мишачої сироватки піддавали аналізу методом Е/ ІЗА приблизно через 2 місяці після ін'єкції 10 7 ри (бляшкоутворюючих одиниць) вірусу коров'ячої віспи, що експресує оболонковий білок ВІЛ-1. Позначкою "окремий" помічено зразок від миши, яка одержала один вірус коров'ячої віспи. Позначкою "суміш" помічено зразок від миші, яка одержала с суміш вірусів коров'ячої віспи, що експресують п'ять різних оболонкових білків. Кожен зразок розводили у о співвідношенні 1:100 (суцільні стовпчики), 1:1000 (заштриховані стовпчики) та 1:10000 (незафарбовані стовпчики) перед проведенням аналізу на ЕІ І5А-планшетах з нанесеним ВІЛ-1. Наведено величини стандартної похибки виміру.
Фігура 5. Продукування нових рекомбінацій вірусу коров'ячої віспи шляхом заміщення продуктів РСК для с рЕмепу4 ВН1І0. Показано спосіб заміщення послідовностей. Продукти РОК заміщували на відповідні оболонкові «- послідовності ВНІО в унікальних сайтах рестрикції ферменту Крпі і Взті. Після розриву плазміди і лігування з продуктами РСК нові плазміди піддавали рекомбінації з М/ (вірусами коров'ячої віспи) дикого типу для створення і - векторів експресії МУ. со
Фігура 6. Визначення реакції після імунізації методом ЕПІЗА за Ебботом. Сироватку від усіх чотирьох шимпанзе піддавали клінічному аналізу за методом Еббота (дивись Матеріали та методи нижче). Результати для - кожного зразка сироватки (вісь У) наведено у залежності від дати кожного тесту (вісь Х). Сильні реакції спостерігались у шимпанзе, імунізованих змішаною оболонковою вакциною вірусу коров'ячої віспи.
Фігура 7. Карта біфункціональної плазміди, яка може діяти як вакцина ДНК і як рекомбінуючий вектор вірусу « коров'ячої віспи. Присутність безпосереднього раннього промотора цитомегаловірусу (ЦМВ), і пізнього та раннього промоторів вірусу коров'ячої віспи (МУ) дозволяє експресію чужорідного гена як у клітинах ссавця, так т с і у клітинах, інфікованих МУ. ч Відкриття несподівано підсилених імунних реакцій на змішані поліоболонкові вакцини ВІЛ. Попередні спроби » одержати вакцини проти різних штамів ВІЛ були сфокусовані на одній чи кількох варіабельних ділянках др120 чи ор160. Очікувалось, що такі варіабельні ділянки, присутні у вакцині, забезпечать широкий спектр захисту проти інфекції ВІЛ. Однак такі вакцини були невдалими, оскільки індукована вакциною імунна реакція не розпізнавала - багато різних штамів ВІЛ. Таким чином, існує нагальна потреба створення вакцин, які викликають імунні реакції о на різноманітні штами ВІЛ, так щоб ці вакцини були придатними для лікування та/або попередження ВІЛ.
Автори даного винаходу знайшли, що несподівано підсилені первинна та вторинна (бустінг) імунні реакції - можуть бути індуковані проти кількох чи багатьох різних штамів ВІЛ шляхом використання поліоболонкових щ--ьл 70 вакцин, які містять суміш від щонайменше 4 до 1000 і, можливо, до 10000 рекомбінантних вірусів, кожен з яких кодує окремий варіант оболонкового білка (ВОБ). Вакцина може також містити експресовані вірусами ВОБ, кі» наприклад, такі, що продукуються клітинами-хазяїнами, використаними для продукування вірусу.
Терміни "праймування" чи "первинний" і "повторна імунізація" чи "бустінг" використовуються у даному опису стосовно первинної та послідуючої імунізацій, відповідно, тобто у відповідності до визначень, які ці терміни звичайно мають в імунології.
Ге! ЕРМ-кодуюча нуклеїнова кислота (нуклеїнова кислота варіанту оболонки (ЕМ)) може бути ізольованою із однієї чи різних популяцій (наприклад, географічних) людей, інфікованих ВІЛ. За іншим варіантом, різні де нуклеїнові кислоти ЕМ можуть бути одержані із будь-якого джерела і відібрані на підставі результатів пошуку у послідовностях відмінностей у кодуючих послідовностях, або шляхом оцінки відмінностей у викликаних 60 гуморальній та/або клітинній імунних реакціях на множинні штами ВІЛ, іп міго чи іп мімо, згідно з відомими методами.
Первинне відкриття стосувалось вакцин рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи. Однак будь-якому фахівцю з середнім рівнем підготовки у цій галузі зрозуміло, що будь-який рекомбінантний вірус може бути використаний для експресії поліоболонкових антигенів для вакцини за даним винаходом. Крім того, використання множинних б5 вірусних вакцин може усунути антивірусні імунні реакції, які можуть зменшити ефективність повторної імунізації вірусною вакциною (завдяки можливому підсиленню енергійної антивірусної реакції).
Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що автори винаходу знайшли також, що повторна імунізація оболонковим білком чи білками рекомбінантного ВІЛ, бажано білками, додатково підсилює способи імунізації за винаходом.
Оболонковий білок чи білки ВІЛ можуть співпадати з оболонковими білками, ексресованими у поліоболонковій
Вакцині, або ж вони можуть бути іншими оболонковими білками ВІЛ.
Аналогічно, кваліфікованому фахівцю зрозуміло, що способи імунізації за даним винаходом підсилюються шляхом використання вакцини ДНК. Вакцина ДНК може використовуватись як засіб повторної імунізації, наприклад, як описано вище для білків рекомбінантного ВІЛ. За іншим варіантом, вакцина ДНК може бути використана для первинної імунізації, а рекомбінантна вірусна вакцина чи вакцини будуть використані для 7/0 підсилення анти-ВІЛ амінної реакції. Як і для вакцини рекомбінантного оболонкового білка для повторної імунізації, вакцина ДНК може включати один чи кілька векторів для експресії одного чи кількох генів оболонки
ВІЛ. Крім того, гени оболонки ВІЛ можуть співпадати з генами, що експресуються вакциною рекомбінантного вірусу, або можуть відрізнятись від них. За варіантом втілення, якому надається перевага, вектори готують для експресії у вакцині рекомбінантного вірусу та у інфікованих вірусною нуклеїновою кислотою клітинах ссавця, як /5 частину вакцини ДНК.
Було знайдено, що ця імунна реакція (гуморальна та/або клітинна) є ефективною для широкого спектра штамів інфекційного вірусу, такого як ВІЛ, і не обмежена штамами вірусу, які експресують конкретні варіанти оболонкових білків (ЕРМ), що входять до поліоболонкової вакцини. Даний винахід, таким чином, пропонує множинні варіанти оболонкових білків, кодовані рекомбінантною вірусною вакциною, які забезпечують несподівано підсилені імунні реакції на множинні штами ВІЛ.
Поліоболонкові вакцини та вакцинація.
Таким чином, даний винахід за одним із аспектів пропонує поліоболонкові вакцини з використанням від щонайменше 4 і до 10000 різних рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, кожен з яких експресує окремий варіант оболонкового білка або його антигенну частку. Як зрозуміло фахівцю у цій галузі, може бути с ов Використано від 4 до біля 1000, або бажано від біля 10 до біля 100 різних рекомбінантних вірусів. Навіть рядовому фахівцю у цій галузі зрозуміло, що для вакцин можуть бути використані інші віруси. Приклади і) придатних вірусів, які можуть бути використані як рекомбінантні вірусні хазяїни для вакцин, включають, на додаток до коров'ячої віспи, віспу канарейок, аденовірус та аденоасоційований вірус. Запропоновані також способи виготовлення та використання таких поліоболонкових вакцин. с зо Поліоболонкова вакцина за даним винаходом індукує принаймні одну із гуморальної та клітинної імунних реакцій у ссавця, якому було введено поліоболонкову вакцину, але реакція на вакцину є субклінічною, або - ефективно підсилює принаймні одну імунну реакцію на принаймні один штам ВІЛ, так що введення вакцини є М придатним з метою вакцинації.
Вірусні вакцини. Для приготування поліоболонкових вірусних вакцин, призначених для введення ме) поліоболонкових антигенів ВІЛ, можуть бути використані різні віруси-хазяїни, одержані методами генної ї- інженерії ("рекомбінантні віруси"). Особлива перевага надається вірусним вакцинам, завдяки тому, що вірусний компонент промотує сильну імунну реакцію з метою активації В-лімфоцитів, кооперуючих Т-лімфоцитів та цитотоксичних Т-лімфоцитів. Чисельні види вірусів можуть бути використані як рекомбінантні вірусні хазяїни для вакцин за винаходом. Рекомбінантним вірусом для вірусної вакцини, якому надається перевага, є вірус « Коров'ячої віспи |Міжнародна патентна публікація МУО 87/06262, 22 жовтня 1987, Мозз та ін.; Соопеу та ін., з с Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90:1882-6 (1993); ОСгапйат та ін., У. Іпївсї Оів. 166:244-52 (1992); МесЕїга(й та . ін., У. Іпїесі. Оів. 169:41-7 (1994)). За іншим варіантом втілення, може бути використана рекомбінантна віспа и?» канарейок (|Ріаїрих та ін, АБ Кез Нит. Кеїгомігизез 11:373-81 (1995), еташт іп АБЗ Кевз. Нит.
Кеїгомігизез 11:875 (1995); Апдегезоп ота ін., У. ІпТєсї Оів. 174:977-85.(1996); Бпез та ін., Массіпе 14:428-34 (1996); бопсго! та ін., Массіпе 13:1080-5 (1995)). Іншим варіантом є аденовірус, нездатний до -І самостійного відтворювання, або аденовірус (|Сіагаі-Нерепзігей та ін., 9. (зеп. МігоІЇ. 71:2425-31 (1990);
Ргемес та ін., 9. Іпївсї Оів. 161:27-30 (1990); Ії ирескК та ін., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 86:6763-7 (1989); о Хіапд та ін., Мігоїюсду 219:220-7 (1996)|. Інші придатні вірусні вектори включають ретровіруси, що спаковані у -І клітинах з амфотропним рядом хазяїнів | дивись МіПег, Нитап Сепе Тег. 1:5-14 (1990); А!Чвибеї та ін., Ситепі 5ор Ртоїосоїв іп Моїесціаг Віоіоду, 591, та послаблений чи нездатний до самостійного відтворення вірук ДНК, такий - як вірус простого герпесу (НМ), але не обмежуючись ним |дивись, наприклад., Карій та ін., Моїес. Сеї).
Ге Мецговсі. 2:320-330 (1991)), папіломавірус, вірус Епштейна-Барра (ЕВМ), аденоасоційований вірус (ААМ) дивись, наприклад, ЗатиївКі та ін., У. Мігої. 61:3096-3101 (1987); ЗатиївКі та ін., 9. МігоЇ. 63:3822-3828 (1989) і т.Ін.
Вакцини ДНК. Альтернативний варіант до традиційної вакцини, яка містить антиген та ад'ювант, включає пряме введення до тканин суб'єкта іп мімо ДНК, що кодує антиген, для експресії антигену клітинами тканини
Ф) суб'єкта. Такі вакцини у даному опису називаються "вакцинами ДНК" або "вакцинами на основі нуклеїнових ка кислот". Вакцини ДНК описані у міжнародній патентній публікації М/О 95/20660 та у міжнародній патентній публікації МО 93/19183. Здатність безпосередньо введеної ДНК, яка кодує вірусний білок, викликати захисну бо імунну реакцію, була продемонстрована на численних експериментальних системах |Сопгу та ін., Сапсег Кезв., 54:1164-1168 (1994); Сох та ін., МігоІ., 67:5664-5667 (1993); ЮОаміз та ін., Нит. МоЇе. Сепеї, 2:1847-1851 (1993); Зедеданй та ін., Ргос. Май. Асай. осі, 91:9866-9870 (1994); Мопідотегу та ін, ОМА сеї! Віо., 12:777-783 (1993); ШОІтег та ін., Зсіепсе, 259:1745-1749 (1993); МуУапуд та ін., Ргос. Май. Асай. бо5сі., 90:4156-4160 (1993); Хіапуд та ін., Мігоїосду, 199:132-140 (19943). У дослідженнях з оцінки цієї стратегії при 65 нейтралізації вірусу грипу для індукування продукування антитіл було використано як оболонкові, так і внутрішні вірусні білки, але особлива увага була сконцентрована на вірусному білка гемаглютиніну (НА) (Бупап та ін, ОМА СеїЇ ВіоІ.,, 12:785-789 (1993За); Рупап та ін., Ргос. Май. Асай. Зсі., 90:11478-11482 (19935);
Кобіпвоп та ін., Массіпе, 11:957, (1993); Мерзіег та ін., Массіпе, 12:1495-1498 (1994)|.
Вакцинація шляхом прямого введення ДНК, яка кодує оболонковий білок ВІЛ, для викликання захисної імунної реакції, продукує як клітина-медійовані, так і гуморальні реакції. Це аналогічно результатам, одержаним з живими вірусами (Ка; та ін., Ргос. Май). Асай. Зсі., 91:9519-9523 (1994); ОІтег, 1993, вище;
УУапо, 1993, вище; Хіапод, 1994, вище). Дослідження з тхорами свідчать, що вакцини ДНК проти збережених внутрішніх вірусних білків грипу, разом з поверхневими глікопротеїнами, є більш ефективними проти антигенних варіантів вірусу грипу, ніж інактивовані вакцини чи вакцини субвіріонів (Ооппейу та ін., Маї. Медаісіпе, 7/0 8:583-587 (1995). Дійсно, для мишей було описано відтворювані імунні реакції на ДНК кодуючі нуклеопротеїни, що зберігались по суті протягом усього життя тварини (Мапкашсказ та ін., ОМА Сеїі Віої., 12:771-776 (1993)|.
Як добре відомо фахівцям у цій галузі, на ефективність експресії антигенних генів та/або імуногенність вакцин ДНК може впливати велика кількість факторів. Приклади таких факторів включають повторюваність інокуляції, конструкція плазмідного вектора, вибір промотора, використаного для збудження експресії /5 антигенних генів і стабільність гена-вставки у плазміді. В залежності від походження, промотори відрізняються по специфічності щодо тканин та ефективності інгібування синтезу мРНК ІХіапод та ін., Мігоїоду, 209:564-579 (1994); Спартап та іІН.,Мисіе Асіаз. Кев., 19:3979-3986 (1991)). Досі більшість вакцин ДНК у системах ссавців були основані на вірусних промоторах, одержаних із цитомегаловірусу (СММ). Вони виявляють добру ефективність при інокуляції м'язів та шкіри ряду видів ссавців. Іншим відомим фактором, що впливає на імунну 2о реакцію, викликану імунізацією ДНК, є спосіб введення ДНК; парентеральні маршрути можуть дати низькі рівні переносу гена та призвести до значної варіабільності експресії гена |Мопідотегу, 1993, вище). Високошвидкісна інокуляція плазмід за допомогою генного пострілу підсилює імунну реакцію у мишей (Бупап, 19938, вище;
Еізепьгацп та ін., ОМА Сеї| Віоі, 12:791-797 (1993)), гадано завдяки більшій ефективності трансфекції ДНК і більш ефективній презентації антигена дендритними клітинами. Вектори, що містять вакцину на основі сч ов нуклеїнової кислоти за винаходом, можуть також бути введені потрібному хазяїну іншими відомими фахівцям методами, наприклад, трансфекцією, електропорацією, мікроін'єкцією, трансдукцією, злиттям клітин, і)
РЕАЕ-декстраном, осадженням кальційфосфату, ліпофекцією (злиттям ліпосом) або векторним перенесенням
ДНК |дивись, наприклад, МУ та ін., 9. Віої. Спет. 267:963-967 (1992); Ми апа МУ, 9. ВіоЇ. Спет. 263:14621-14624 (1988); Нагтиї та ін., Канадська патентна заявка Мо2012311, подана 15 березня 1990р.. с зо Біфункціональні плазміди для вірусних вакцин та вакцин ДНК. Один із аспектів даного винаходу, якому надається перевага, стосується інженерії біфункціональних плазмід, які можуть виконувати рольвакцини ДНК та (7 рекомбінантного вірусного вектора. Пряма ін'єкція очищеної плазмідної ДНК, тобто при її використанні як М вакцини ДНК, викличе імунну реакцію до антигену, що експресується плазмідою у піддослідних суб'єктів.
Плазміда буде також корисною при використанні живих рекомбінантних вірусів як носіїв імунізації. ме)
Біфункціональна плазміда за винаходом пропонує гетерологічний ген, або ділянку вставки гетерологічного ї- гена, що знаходиться під контролем двох різних послідовностей регулювання експресії: тваринної послідовності регулювання експресії та вірусної послідовності регулювання експресії. Термін "під контролем" використовується у звичайному сенсі, тобто дієво чи оперативно зв'язаний з чимось, у тому сенсі, що послідовність регулювання експресії, така як промотор, забезпечує експресію гетерологічного гена. За « варіантом втілення, якому надається перевага тваринна послідовність регулювання експресії є промотором з с ссавця (даний винахід розглядає також пташині промотори); за конкретним варіантом втілення, промотор є безпосереднім раннім промотором цитомегаловірусу (СММ) (дивись Фіг.7). За іншим конкретним варіантом ;» втілення, вірусний промотор є раннім промотором вірусу коров'ячої віспи, або пізнім промотором вірусу коров'ячої віспи, або, бажано, обома (Фігура 7). Суб'єкти можуть бути вакциновані за багаторівневою схемою,
Коли біфункціональна плазміда вводиться як ДНК, і, іншим часом, але у будь-якому порядку, як рекомбінантна -І вірусна вакцина. Винахід пропонує одиничне чи багатократне введення біфункціональної плазміди як вакцини
ДНК, або як рекомбінантної вірусної вакцини, обо обох. Така схема вакцинації може бути доповнена введенням о вакцин рекомбінантного білка (нижче), або може бути використана з додатковими носіями вакцин. -І Для рядового фахівця у цій галузі зрозуміло, що біфункціональні плазміди за винаходом можуть бути 5р Використані як вектори поліоболонкової вакцини. Так, шляхом вставки до біфункціональних плазмід від - щонайменше 4 до біля 10000, бажано від 4 до 1000, більш бажано від 10 до 100, різних генів оболонки ВІЛ
Ге можна одержати відповідний набір біфункціональних плазмід, придатних для використання як поліоболонкова вакцина.
Вакцини рекомбінантного білка. Активний імунітет, викликаний вакцинацією оболонковим білком чи білками бв ВІЛ за даним винаходом може створити чи підсилити клітинну чи гуморальну імунну реакцію. Оболонковий білок чи білки ВІЛ, або їх антигенні фрагменти, можуть бути одержані у суміші з ад'ювантом для виготовлення вакцини.
Ф) Термін "ад'ювант" стосується сполуки чи суміші, яка підсилює імунну реакцію на антиген. Ад'ювант може ка правити за тканинне депо, що повільно вивільняє антиген, а також за активатор лімфоїдної системи, який неспецифічно підсилює імунну реакцію (ІНоса та ін., Іттипоіоду, Зесопа Еа., 1984, ВепіатіпСиттіпдвг: Мепіо во Рагк, Саїйогпіа, р.384). Часто первинне введення самого антигену, без ад'юванта, не викликає гуморальної чи клітинної імунної реакції. Ад'юванти включають повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда, сапонін, мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, масляні чи вуглеводневі емульсії, гемоціаніни молюска блюдечко, динітрофенол, і потенційно придатні ад'юванти людини, такі як ВСО (расіШе СаІтене-Сиегіп) та Согуперасіегійт рагуит. Вибір 65 ад'юванта залежить від об'єкта вакцинації. Бажано використовується фармацевтично прийнятний ад'ювант.
Наприклад, у вакцинах для людини треба уникати ад'ювантів на основі масляних чи вуглеводневих емульсій,
включаючи повний та неповний ад'ювант Фрейнда. Одним з прикладів ад'юванта, придатного для використання на людях, є гель оксиду алюмінію (аішт). За конкретним варіантом втілення, який описано нижче, оболонковий білок рекомбінантного ВІЛ вводять внутрішньом'язово у гелі оксиду алюмінію. За іншим варіантом, оболонковий білок рекомбінантного ВІЛ може бути введений підшкірно, інтрадермально, інтраперітонеально або іншим придатним шляхом введення вакцини.
Введення вакцини. Згідно з винаходом, імунізація проти ВІЛ може бути здійснена за допомогою самої лише рекомбінантної вірусної вакцини за винаходом або у сполученні з вакциною ДНК чи рекомбінантної білкової вакцини, або обох. За конкретним варіантом втілення оболонковий білок рекомбінантного ВІЛ у гелі оксиду /о алюмінію вводять внутрішньом'язово для підсилення імунної реакції.
Кожна доза вірусної вакцини може містити одні й ті самі від 4 до 10000, бажано від 4 до 1000, і більш бажано від 10 до 100, різних рекомбінантних вірусів, кожен з яких експресує окремий оболонковий ген ВІЛ. За іншим варіантом, віруси у наступних вакцинах можуть експресувати інші оболонкові гени ВІЛ. За ще іншим варіантом втілення наступні поліоболонкові вірусні вакцини можуть мати частину вірусів, які є спільними з /5 попередньою вакциною, і інші віруси, що відрізняються від неї. Наприклад, праймуюча вакцина може містити віруси коров'ячої віспи, що експресують оболонкові білки ВІЛ, довільно позначені 1-10. Друга (бустерна) вакцина може містити віруси коров'ячої віспи (або бажано інший вірус, такий як вірус віспи канарейок чи аденовірус), що експресують оболонкові білки ВІЛ 6-15, або 11-20 і т.ін.
Вакцина ДНК чи рекомбінантна білкова вакцина можуть мати окремий антиген оболонкового білка ВІЛ чи
Множинні антигени. Бажано, вакцина ДНК чи рекомбінантна білкова вакцина, призначена для використання за винаходом, включає більше одного антигена оболонкових білків ВІЛ. Як і у випадку вірусних вакцин для наступного введення, оболонковий білок ВІЛ або білок вакцини ДНК чи рекомбінантної білкової вакцини може відповідати оболонковому білка ВІЛ, що експресується поліоболонковою вірусною вакциною, або може відрізнятись від будь-якого з оболонкових білків поліоболонкової вакцини. сч
Загалом, варіант втілення винаходу, якому надається перевага, пропонує забезпечення максимально можливої різноманітності у кожному протоколі вакцинації для того, щоб піддати реципієнта дії найбільшої і) кількості оболонкових білків ВІЛ і, таким чином, створити найширші можливості для нейтралізуючої рекомбінаційної здатності щодо природного ізоляту ВІЛ.
Варіанти оболонкового білка с зо Як було вказано вище, варіанти оболонкового білка, призначені для використання у вакцинах за винаходом, можуть бути одержані із географічно локалізованих ізолятів, чи кладів (сіаде), або із географічно -- різноманітних ізолятів, тобто різних кладів. Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що одержання оболонкових М нуклеотидів (тобто, генів) із природних ізолятів має численні переваги: ізоляти є легкодоступними, варіанти оболонкового білка відповідають білкам, що зустрічаються у природних умовах, імунітет до яких є бажаним, і ме) мутації ВІЛ можуть бути швидко виявлені із нових ізолятів. ї-
Варіанти оболонкового білка включають також поліпептиди, які мають імуногенну активність, викликану амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності варіанта оболонкового білка щодо принаймні одного епітопу чи антигенного детермінанта. Ця амінокислотна послідовність по суті відповідає щонайменше одному фрагменту довжиною 100-900 амінокислот та/або узагальнюючій типовій послідовності відомого варіанта « оболонкового білка ВІЛ. Такий варіант оболонкового білка може мати загальну . гомологію чи ідентичність щодо -плв) с відомої амінокислотної послідовності оболонкового білка щонайменше 5095, таку як гомологію у 50-9995, або будь-який інтервал чи значення у зазначеному інтервалі, і викликає імуногенну реакцію проти принаймні одного ;» штаму ВІЛ.
Ступінь гомології у відсотках може бути визначена, наприклад, шляхом порівняння інформації про послідовності за допомогою комп'ютерної програми БАР версії 6.0, яка може бути одержана від комп'ютерної -І групи по генетиці університету Вісконсину (МУ СО). Програма САР використовує спосіб вирівнювання, запропонований Меедіетап апа МУспеспи |У. Мої. Віо!. 48:443 (1970))| у модифікації Зті(й апа УУа(егтап (|Адуи. о Аррі. Маїй. 2:482 (1981)). Стисло, програма ЗАР визначає подібність як відношення кількості вирівняних -І символів (тобто, нуклеотидів чи амінокислот), що є аналогічними, до загальної кількості символів у коротшій 5р із двох послідовностей. Параметри за умовчанням програми САР, яким надається перевага, включають: (1) - одиничну матрицю порівняння (яка містить значення 1 для збігів та О для розбіжностей) і зважену матрицю
Ге порівняння за Сгірвеком апа Вигдевв, Мисі. Асідв Кев. 14:6745 (1986), яку описано у книзі 5спмаг апа
Баупоїї, едз., АШЦаз ої Ргоївеіп Зедцепсе апа Зігисішге, Майопа! Віотедіса! Кезеагспй Еошпааїйоп, УУазпіпдіоп, ре (1979), рр.353-358; (2) штраф, який дорівнює 3,0 для кожного розриву, та додатковий штраф у 0,10 для дв Кожного символу у кожному розриві; і (3) відсутність штрафів для кінцевих розривів.
За варіантом втілення, якому надається перевага, варіант оболонкового білка за даним винаходом є
Ф) варіантною формою принаймні одного оболонкового білка ВІЛ. Бажано, варіант оболонкового білка включає ка др120 і ділянку олігомеризації др41, як др140 ІНаїІепбегодег та ін.уігоїоду 193:510-514 (1993)).
Відомі оболонкові білки ВІЛ містять приблизно від 750 до 900 амінокислот. Приклади таких послідовностей бо Можуть бути легко одержані із комерційних баз даних послідовностей ВІЛ та баз даних, що належать установам, таких як ЗЕМВАМК, або із опублікованих збірок, таких як Муегз та ін., едв., Нитап Кеїгомігизез апа АІЮ5, А
Согрогайоп апа Апаїувів ої Мисівїс Асій апа Атіпо Асій бедцепсев, Мої. апа ІІ, ТНеогеїйїіса! Віоюду апа
Віорпузісв, І оз АІатоз, ММ (1993). Заміни чи вставки у варіанті оболонкового білка для одержання додаткового варіанта оболонкового білка, кодованого нуклеїновою кислотою, призначеного для використання у 65 рекомбінантній вірусній чи полі оболонковій вакцині за даним винаходом, можуть включати заміни чи вставки принаймні одного амінокислотного залишку (наприклад, 1-25 амінокислот). За іншим варіантом, принаймні одна амінокислота (наприклад, 1-25 амінокислот) може бути вилучена із послідовності варіанта оболонкового білка.
Бажано, такі заміни, вставки чи делеції ідентифікують на основі визначення послідовності оболонкових білків шляхом секвенування нуклеотиду принаймні однієї нуклеїнової кислоти, кодуючої варіант оболонкового білка, одержаного від особи, інфікованої ВІЛ.
Необмежуючі приклади таких замін, вставок чи делецій бажано одержують шляхом ампліфікації послідовностей оболонкових ДНК чи РНК від пацієнтів, інфікованих ВІЛ-1, які можуть бути визначені звичайним експериментуванням для забезпечення модифікованих структурних та функціональних властивостей оболонкового білка чи варіанта оболонкового білка. Одержані таким чином варіанти оболонкового білка бажано /0 мають антигенні властивості, що відрізняються від вихідного ВІЛ. Такі антигенні відмінності можуть бути визначені за допомогою придатних методів аналізу, наприклад, шляхом тестування з набором моноклональних антитіл, специфічних до оболонкових білків ВІЛ, методом твердофазного імуносорбентного аналізу (ЕП ІЗА).
Може бути використані будь-які заміни, вставки чи делеції, за умови, що одержаний варіант оболонкового білка спричинює утворення антитіл, які зв'язуються з оболонковими білками ВІЛ, але має набір амінокислот, що 7/5 Відрізняється від антитіл, утворюваних другим варіантом оболонкового білка. Кожна із зазначених вище замін, вставок чи делецій може також включати модифіковану чи незвичайну амінокислоту, наприклад, як описано у
С.вЕ.К. 51.822(р)(2).
У наведеній нижче Таблиці 1 представлено необмежуючі приклади альтернативних варіантів оболонкових білків ВІЛ, які можуть бути кодовані рекомбінантним вірусом за даним винаходом. що о Бссвпопотяя пер БрспсопрІ її ГГ тк)єу о|к|т)|х| и міну кр) 5ро|н)ік)к|о|н|х| кн) к)к|сін)в| ні с, т
А-АЧАА А Я ЕРУ А НЕНЕНУНАНЕНЕНЯ нАНААЯА-НеЕНЯЯНІ сч 17117711) тн) ік|ку|5|хУ| ну сів фр інфеї вк, нини нняк нити няння о р кет Івін о|5р 1531 1 1 177: 1
ШИ схклелклилклвяклкя 3213151 6|7|819| /1/2|31«156| їв І
Іміх»|сс|ц|м 1 с|5| |в |тіе|кісін У т У у усім ніків) кі, т | сч
ІсІ:|8|нІ1|1/т|5|и| |У|У|510) |У|к| | | 51 || |); ев) | в
А|міа трмітівіь) | сіло) |. | | 7 7 хх 1 717 рун 1, «- хіні ст ІвІс| 1 рів он 7 ГГ рег їм- ше з зер пев тяЯ пров т | о 61 тіс|ксі|к|в|ріві|кх |у о|тіє! мінні «Га ті нс! ето | м
Зо шк) АРЕНА НА 25 А А Я ер 2 А А А 1. А р -
ПОГ тнуз тік Тк 7 Гл кс 111111
Глухі о гг
ПСП « - с Ав Еря п ве Тт « з |нІверо || сх нт е|нік|німунік|ні|о| ніх || ом) нн) |в 1) т "» АНА АНА
Пере тЕр нин Ми лико МО поки НЛО Ку | 1475 77111111 1 ЄСбуг -І 9 я ЕРЕВЕре преррвр вОрпр рр зісін|о|о|5|в|к|»/сІу кс |т| ис || кі сто тгік|ніоіт) ні -І "| | ее, | ЇЇ 7 7 є ун) сі) |тінікн| |кун)хууттіа ву є
ААУ рин - І Сг77711171717,1 17711 ніс) кув 7 1 ще ГОСП 107 7 1101171 сукріеь| у 1, об Ерлклвлсльлій зл елктклклнакслелійнуклкакльвкава кт ай 11 |т|85|нНІнН) У тів в|5|н|сІн|нІ1п|н є ву ов 1 Кк н|сСбз| кун: 8| т в нік|8|е|к!| |ттікІні нка ток е|к|н|т!к |ву ку тік) в
Ф) | | ДЛ. 1 те 15|оні|хУ) 71, совка То! | |в! он | т юю ники ния Ми пови Ноя ноя Во Ноя по НС НК СЯ ВЗ Моно НБН ЕС ПОС ЛИ НО ОХ ВОНО ТАЄ НОЯ НЯ НЯ ЗА НАХ МНИХ МИСІ 60 б5 я реве ев прреверт перпррв зві |1|к|сі|кі|х|сік|в| УА ку|к| |в Гі в|1|о|к|сін|о|5| рК |н/ о рр ют и Те Ер к-т ее
Іх|кін|со|нін|кіІу|к|т|Уу| |нІв|т| |6|х|к| с сін| 7 | | | 1 |ті 51 151 1 Їсінр ("| | 1715 1 (1515, 15 | 17 оо Блез зт Біт те 70 211 ееерирятюти АЕН ТЕ ет Тр ІЕЕ 5|т|т|нілі!н; |т|н|к|кі |1|н| ;5|к|т т|м!к| / ГТ 5 |1|т
І (5|н"ГТі| | 1 |к«|н|у/ 1); | |в) Го|5| 1: | | | | 7! | |і 51 | ГГ | її Ге; | ІЇк! | 17! ГО! 1111 1 І
ТТ ча о Бппзплтттяя зач Бітотеазття З 241 ТАНЯ нн УААН ре вм! |2| /т|сіт |у м|м)|ке! | |к|о)АЇк! /5І |к|еГо| їЇк
ІІ 1 1 ні!) 1 111, вивів |в 8 15| їні 11/71 11 ||| ес! | 715 11 ПЕ ГПСПИТІТГІтІо Їх о Бпрогзптелт ПІпотаз тертя біз з пи и ре Із |"|а|вів| |. м 1|т|5/ниі|т! ГГ ЇЇ | Їк| 71) Їт! «7! 7 71:17 | | ная синяни сч
ІІ |У; | ЇЇ 7 7 |з |" | 17 15 | І | віків) о
ГГ Є 1771717 ГТ 11117 11 111 якіс о
Вик ми Мо ли Ми ішов лк пи ВИ Мо он о НООХ НОЯ НЯ НН ННЯ Но ПОН ННЯ НО Но Ж МОХ МОЖ ЖЖ НК НЕСТИ НИМ НИК оо Бвнпвпртпттче Бізе тя Біпзтоазптятет піз |к| нку тонік) тітку о) уні о5іх| || ні ств в| ні ну с зо Іс Іміс|вр | о|1:1|8|ні5 |У в хі! ни|в|хн| |к)|в|РГІ1| АХ У 1 8 т
Пен ее ННА НИ «- ін 177151 |в|х; ; |в) ху; 1 |; | ох! ГУ| ки) || | ех 711 1кІ їк1 1! 1 7 17 1 7 1777) 171 177111 їкі | в. со 0 Бспзтлєзот 1/2) «|5Щ1617|819| /2/2|з:3|«/5|61 7151 331 КДЕЛЕЛЕЧЕНКЛЕнНШЕНЕ ВЕХЕЗКЛЕ ЛЕЛЕК ЛЕЛЕНЕЯЕЛЕЧЕНЕ НЕ ВЕЛЕЧ ННІ М.
Ік|хІнік|кі| |х|нін|Ініх А віІк|сіх|тів|х|тікк|к|ї|5|6і)ії11о01|к
Іу|к|5іІо|нуі |х|к|м)г?/5| |5|ві!к|т|н|у|м|е|кІо|5ікіх| ні | | ш
Іт|івн|8|0|ті| |к! ГУ; ; (мім|5/ ме е|о Іо о|сіУ| | тів
І-І: 9 2 (5 1 7 177 177 ре |у трнін|кхіху|х) нутітр ГУ « - с М ку кукакяеякавя тка какая кла ктка кла т клк кока валки . зі |н|сін!1|5|в|А|кініні|ніт| иІко| гуо|5|к йІк| в о | є с н| нік ту т "» 2АААРНААНиЄАНА ЕТ еле НИ
І | |тіхуінік|т ої |5|к|к|М || (ауто, |суліні|с|в| Г
АНА А ее кА Я АЕН щ 45 І 171 Її рА(5|к| ||о; | |н|г: | (кіс: (гої | ДОДДЧчЇП оо ооо Бгазпттте БІіпззозя Бттаалтятяя зз1і |:|к|к|о|5|5|сісірісе|к | п1|у|тініз|є|н|сіІв|сі| є є е|усікі|5Їт | о - (Уу|5|н|нін|а|сісі Гр 1У|т|ніу|ч| 11; 614 | 1 от 5| с
А АЮ рр - ІА! а|к|с) | ЇЇ Г"| | | Тк! Їм! 7 7 гу | А Я ЛА ЛА Р-А-РУ-А газ Ік/ |5|чи|тІ | 1 191 | 1 7 їкі | |! Те 7 1 777 7 17 17 їжі 440 ооо Бпппрвтпррр пр приро пероповитов
ДИ ЗЕАКХКЯКаКАКЛЛЕЛЕЯ СЯЕЛЕЛИЯ ЛЕЛЯ КЛЕЯКЯ СТЕЛЕЛЕА Я БАКА Кт в ПСЗИНСЯ ВЕ НС ПЕЧИВА СУЯ СУА ВЕ ВЕ НСС ЧИ ВЕ ОСА СТЮ ВЕНА СЯ ВСАА НС СЗТ ВЕСНИ ПЕРУЯ ВЕК СТА НСТЯ ВАННА пет шикСя Я ЯН КАЄ НК КС АС НС СЯ НЯ ВЕЧН ВСЯ НС СЯ ДСС ВСЕ АС НС ВЕ КЕ НСЯА КС ВКА МЕЧА ВСЯ ВОНА ВН (Ф) А-АРН-А- А 2-34 24 ЕЕ ЕТ ЕН НН-- юю 11 їх: 121 | 1 кв |н"|сг|о|т1)|о0ї |85|х)к|5| 1 | 1 во бе ші 7Т в | : й Ттетю : пдрерурюя
ГТ ви : ЕЕ пі:
Баня кі НЕ нин шшізякаш ние БЕН:
ЕЕ НЕ НЕ з | || 1| | ЕК | | -- -- : пе наиНнННнн т - НЕ
ВЕЕЕЕННЕеННВУ т. н- ЕЕ
УНН пен
А--- ої ТЕЕВЕН ТЕ ЧЕ Те ---- прерчея НЕ Не х в. е ства 5 т ши я г - ВВББАНВНКЕ Не ї.
В -е |у | я на в ТО ш- що Ге се
ЕЛЕЛЕнКЙ 151 ннННННи ЕЕ - рин Уві ши о це Й с: ії
АННУ ши ние Ер НННе ївї р УА не ІЕТЕН : няня 7 НЕЕЕТЕЕ т т 70 А-А- 6-й шк що пон чнння я - - - А -4 ЕНН ВЕ ши Ге ниашнвнани я
САНЯ ее ші шкака ях :
СЕРЕ -- ка 5 ня ї
НЕ Я г 7 І си -- - нт
ЕЕ НЯ с перен ши шини В пе
І5 ОТ -- - те ; і ши ши шк т т : т зи те 4 ня шк яння ПЕН, шк шк 5 Я ВНЕен І: се) я ка : те 71 е| | || г ш , Е г | га тат м ве: ї
ПенАНННЯ шк - : . - ї ВВННннеНННе х: пе
І || - т : т
В нини нянння : : тя вза и 77 рретрі: ше Не: : я що я З ши шк ше ши |з || пиизі яБЕе я --А4-1- пров Не т : певне в п т рт ---- --е : не
АНА яти ние лише -- вне
ЛЕЛЯ паниилвненнння -- ее т то ! не ЕВ 5 р УТ Гк шк т ми шк кі покзниклна нини клклклкакткякя цо НЕ
А А АРЧ р перою пз Н ТЕ | 1 | - тт т т гра з ТТ НЕ Е й (о) | кзнкяся НЕ Не
НЕЮ шкзкзна : Во
РИ а | ш- пи зай З ї
ЕНя кві ня їЕ Й 7 ши н-щ - | й с і, - і їй і щі т |і Я
РЕННЯ шк ! ля її | м || шщ- Н-- - ! : шви «ТЕТЕ ЕЕ ЕНН 7 Не п я :
Еч | 2 п Не З нене еннениНН 555 п не : 311 11 с | Кз 5 НЕ : : (г | 7 лиш шк - Е ще ЕЕ те - 8 - г | но ла С
І) шщ я -е : є : ! ЗБЕНЕЕНЕНЕ се З КЛЕНИ прі. ІА тре 7
ННІ | ще ГРН НЕ пе ли ши . » -АА-А-А-АН- НННБВННеНе ЕЕ й ши т ВЕНЕННи ее : о поуе ПЕН ї «ВЕБ канананаклкана ртрене - СЯ тре нин СЯ Ек те й ЕНН се - Шиненння кла какя Г в шишки ши ннжнанин ЕНрЕЕЕЕЕЕЕ
ГК) ши шк ше ше КЕ КлБлкя НЕНЕНЕе ТЕ клани БЕ а ван ша Пенн Нв
ННЯ 7505
ЕЕ ЕЕЕЕНННЯ
Й перереете зсз не -- (А | НН -- 1 о | ш : й ЧАТ ши (Ф;
Го) 60 -12-
Шсиклелелнякя м зві пліт пре веото псиаєи й тк п |мреуа|ьхує пиере и еЕТЕТЕ ЕНН ЕТАТЯ хв сві й Гелі хх Уроків і т|сілітіків |в: , 1191 1171
А рр в ши ше ши ши ши ВИШІ гг, вк ше шк мо М ОВ
Бл пот портр то зі стін в|т|віке| вовк во! т|в|є|к|в|ств|нівн|ої квіт я і |17ік|ті ну |о| || и|с|о|к|о)н|т)|о|сісо)| | |о|с|сік|с|т| н|Му с ріст крн тт кві тіо|втвр 1 1-3 1 117151 феї Тео і | ее ха вої 7 |! | | | 1 11 17 17177171 ке) вікі кі 1 118; 51572111 во о Бвзпотяя пев твтя прот звис» ніаїз||к|ц|х|н|вівісів|8І||сі|в|аіурні»| ставі и
РЕЯ рр ре ррРЕ р рерЕЕЕеЕи тет Те 151 ср 171 внут тінт 10181 |8р51етртісі хі г 171 с, ої 7 1 1се| | | їх Тс 17 1 1 17 Сг
АП ПС
1312131 и|515|7Щ 815 | 2|1:31|51 6171515) )/1|2|3:|«1515Ї Ге 5 «рр еру ер юю юю юр рот а уА| кто р рерЕрУТЮ ри
Гі |хівівіті| |кісрсії| фніз1і1сі |1рсіхіхі інфра сч -А АННА АННА Я Я А 5 о прерртет тт рового вого перерв сч
Ік|ні|в|кіУ|8| ніх та тах а|е|с|т |оук|х|т1|івуУ| У оо, У рр и - 05! |е5| |кІУ|к! ТУ! | || | |нІк| ЛУ. |к|х| |х|су) | Їк|т| є поки шо во зх Ши Ши ох НЕО Ж НО Же он Ноя В Лк ст но Б НН ВА Мо Б тя Ноя Во Вс КС ВСЯ ща иа м и п по по ВИ ТЯ ро при по НООННОЯ ВОНО КОХ ПО ооо нини Ндони КОНІ Ману НК ВК КН Ман КН ЖОНАЄ ДИКІ МО НИК
ОО Бпатітянтяя о Блптяін о о (31213141 5151718|5| (112): 51516| 78 ча
Зо в івент в в'я і: ко сб) тр осінні |У) | / |к!ксіц ро) ;. вл Кл Ле ше пи ШМ пи НО М МОЛ НО ЗОНИ ОЕМ НИЖНЯ ЕС ЛИН ПБС ИН п 1211 по ПИ «
Відповідно до цього, на основі наведених вище прикладів конкретних заміщень, альтернативні заміни можуть в) с бути зроблені за допомогою рутинних експериментів для одержання альтернативних варіантів оболонкових "з білків за даним винаходом, наприклад, шляхом проведення однієї чи кількох замін, вставок чи делецій у " оболонкових білках ВІЛ, які призведуть до одержання відмінних імунних реакцій.
Варіації амінокислотної послідовності у варіанті оболонкового білка за даним винаходом можуть бути одержані, наприклад, шляхом мутації ДНК. Такі варіанти оболонкового білка включають, наприклад, делеції,
Ш- вставки чи заміщення нуклеотидів, кодуючих різні амінокислотні залишки в амінокислотній послідовності.
Га Очевидно, що мутації, зроблені в кодуючих варіант оболонкового білка нуклеїнових кислотах, не повинні зсувати послідовність із рамки зчитування і бажано не повинні створювати комплементарних доменів, які можуть ш- утворювати вторинні структури мРНК |дивись наприклад, А!зирбеї (1995 гем.), іпіта; зхатьгоок (1989), іптга|. -шо 70 Нуклеїнова кислота, що кодує варіант оболонкового білка за даним винаходом, може бути також одержана ампліфікацією чи сайт-специфічним мутагенезом у ДНК чи РНК, кодуючих оболонковий білок чи варіант г» оболонкового білка, і наступним синтезом чи зворотною транскрипцією кодуючої ДНК для одержання ДНК чи
РНК, що кодують варіант оболонкового білка |дивись, наприклад, А!йзибре! (1995 гем.), іпіїтах;х Затьгоок (1989), іпїга), на основі опису та посібника, які наведено тут.
Рекомбінантні віруси, що експресують варіант оболонкового білка за даним винаходом, рекомбінантні
ГФ) варіанти оболонкового білка, або вектори нуклеїнових кислот, що кодують їх, включають обмежений набір послідовностей, що кодують варіанти оболонкового білка як заміщуючі нуклеотиди, які можуть бути одержані о рядовим фахівцем у цій галузі за стандартними методиками без зайвих експериментів за допомогою наведених тут описів та інструкцій. Детальний опис хімії та структури білків дивись у. Зспці2, О.Е. та ін., Ргіпсіріез 60 ої Ргоївіп Зігисійге, Зргіпдег-Мегіад, Мем Жогк, МУ (1978), та Стгеідпіоп, Т.Е., Ргоївіпв: Бігисішге апа
Моїіесшціаг Ргорегіієв, МУ.Н.Ргеетап «5 Со., Зап Егапсізсо, СА (1983). Про представлення заміщень у нуклеотидних послідовностях, таких як кодони, яким надається перевага, дивись А!йзибеї! та ін. едв., Ситепі Ргоїосоїв іп
Моїіесшціаг Віоїоду, Сгеепе Рибіїзвпіпд Авзос., Мем/ Могк, ММ (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) (тут та далі "Аивире! (1995 гем.)) У 55А.1.1-А.1.24, і ЗатргооК, 9. та ін., тоіесціаг Сіопіпд: А бо | арогаїогу Мапиа!), Зесопіа Еаййоп, Сої4 Зргіпд Нагрог Іарогайїогу Ргезвз, Со Зргіпд Нагрог, МУ (1989), у
Додатках С та 0.
Таким чином, рядовий фахівець у цій галузі, користуючись наведеними тут описами та порадами, зрозуміє, як здійснити заміщення інших амінокислотних залишків у інших положеннях оболонкової ДНК чи РНК для одержання альтернативного варіанта оболонкових білків, включаючи варіанти з заміщенням, делеціями чи вставками.
Відбірні аналізи для визначення ВІЛ-активності
Для визначення анти-ВІЛ активності сироватки чи клітин, одержаних від особи, імунізованої вакциною за винаходом, може бути використаний будь-який відомий та/або придатний метод відбірного, аналізу, відомий /о фахівцям у цій галузі. Наприклад, відомі аналізи на ВІЛ включають аналізи вірусної інфекційності |дивись, наприклад, СПпезерго та ін., у. МігоіЇ.,, 62:3779-3788 (1988); АїІдоміпі та ін., едв., Тесппідоев іп НІМ
Кезеагсі, рр.71-76 (1990)); аналізи нейтралізації |дивись, наприклад, СоїЇдіпд та ін, АБ Кев. Нит.
Кеїгоміг., 10:633-643 (1994); Напзоп., АІЮО5Б Кевз Нит. Кеїгоміг., 10:645-648 (1994); аа та ін., Кев. Нит.
Кеїгоміг., 9:781-785 (1993); Напвоп, У. Асаціге. Іттипе Оеїїс. Зупаг, 7:211-219 (19943); аналізи периферійних одноядерних клітин (РММ) |дивись, наприклад, Агаціпо та ін., Апіїтісгор Адепіз СпетоїНег. 37:1095-1101 (1990)); і аналізи цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ) Ідивись, наприклад, Наттопа та ін., У. Ехр.
Меай., 176:1531-1542 (1992); МеЕїгайфй та ін., 9. Мігої. 68:5074-5083 (1994); МУУаЇКег та ін., СеїЇ Іттипої., 119:470-475 (1989); МУеійоїй та ін., АБ Кев. Нит. Кеїгоміг., 8:1373 (1992)). Інши придатні методи, самі чи у будь-якій комбінації, включають кількісні та/або якісні виміри транскрипції, реплікації, трансляції,
Включення віріонів, вірулентності, вірусного врожаю та/або морфогенезу, але не обмежуючись ними.
Конкретний варіант втілення: Рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що кодує варіанти оболонкового білка, поліоболонкові вакцини та способи їх виготовлення та використання
Огляд. Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи (МУ), що експресують оболонкові білки ВІЛ (наприклад, др 41, ор120 та/або др160, або їх частину), дозволяють одержати матеріали, придатні для виготовлення та тестування сч ов Змішаних вакцин, що індукують принаймні одну із гуморальної та клітинної імунної реакції проти вірусу, а також для аналізів детермінантів В-клітин та СТІ. (8)
Поліоболонкова вакцина за даним винаходом складається із суміші п разних рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, де п є цілим числом від приблизно 4 до приблизно 10000 (або будь-яким інтервалом чи значенням в зазначеному інтервалі), де кожен векторний фрагмент вірусу коров'ячої віспи експресує варіант с зо оболонкового білка ВІЛ-1 (ЕРМ) (наприклад, (9р41, др120 чи одр160). Рекомбінантний вірус коров'ячої віспи функціонально кодує варіант оболонкового білка і може бути одержаний рекомбінацією вірусу коров'ячої віспи -- дикого типу з плазмідою. Множинні, відмінні одна від одної плазміди, що кодують варіанти оболонкового білка, М можуть бути одержані шляхом заміщення однієї кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка на іншу, наприклад, з використанням рестрикційного фрагменту чи мутагенезу. о
Одержання рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи. Способи одержання індивідуальних плазмід (кожна з яких ї- експресує унікальну послідовність білка ВІЛ) можуть використовувати метод ампліфікації ДНК чи РНК для заміщення ізольованих послідовностей варіанта оболонкового білка у векторі (наприклад, рМепм4 чи рМепм1
ІНанепрегд та ін.,Мігоїоду, 193:510-514 (1993)), який кодує відому послідовність оболонкового білка ВІЛ (наприклад, доступну для одержання від МІАІЮО АІЮ5 Кезеагсі 5 Кегегепсе Кеадепі Ргодгат, КоскмШе, МО). «
Методи ампліфікації РНК чи ДНК добре відомі фахівцям і можуть бути використані згідно з даним винаходом пт») с без проведення зайвих експериментів на основі наведених тут описів та порад. Відомі методи ампліфікації ДНК чи РНК включають ланцюгову полімеразну реакцію (РСК) та споріднені процеси ампліфікації, але не з обмежуються ними |дивись, наприклад, патенти США МоМо 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, на ім'я Миїйїз та ін., 4795699 та 4921794 на ім'я Табог та ін; 5142033 на ім'я Іппів; 5122464 на ім'я М/їзоп та ін., 5091310 на ім'я Іппів; 5066584 на ім'я СуПепвіеп та ін; 4889818 на ім'я СеМапа та ін; 4994370 на ім'я 5іїмег та ін; -І 4766067 на ім'я Вівмжаз; 4656134 на ім'я Кіпдоід| та РНК-медійовану ампліфікацію, що використовує антисмислову РНК до цільової послідовності як шаблон для синтезу дволанцюгової ДНК (патент США Мо5130238 о на ім'я Маїйек та ін., з торговою назвою МАЗВА)Ї. -І Наприклад, фрагменти рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, одержані цим шляхом, можуть бути 5ор Використані для імунізації та викликання ВіІЛ-специфічної реакції Т-клітин та/або В-клітин. Праймери - використовують збережені послідовності ВІЛ і, таким чином, успішно ампліфікують оболонкові гени із багатьох
Ге різних зразків від пацієнтів, хворих на ВІЛ-1. Аналогічно, описана тут базова методика може бути використана з РСК чи іншими типами праймерів ампліфікації для заміщення менших чи більших ділянок оболонкових послідовностей із польових ізолятів та ділянки, які були знайдені у векторах, кодуючих оболонковий білок ВІЛ.
Дивись, наприклад, А!,зибеї, нижче; ЗатрбгоокК, нижче.
Нуклеїнові кислоти, що кодують варіант оболонкового білка. Методика починається з ізоляції ДНК із
Ф) інфікованих ВІЛ клітин і ампліфікації оболонкових послідовностей методом ланцюгової полімеразної реакції ка (РСК). Продукти РСК чи інших методів ампліфікації є найпростішим способом ізоляції послідовностей ВІЛ, але можуть бути використані будь-які інші придатні та відомі методи, такі як клонування та ізоляція нуклеїнових бо Кислот чи білків, що кодують варіант оболонкового білка (дивись А!ЇЄзиреї, нижче; ЗатрбгооК, нижче).
Рестрикційні ділянки ферментів бажано вводяться до РОК чи інших послідовностей праймування ампліфікації з метою сприяння клонуванню генів.
Ізольована ДНК для РСК може бути одержана із численних джерел вірусу, включаючи свіжу чи заморожену цільну кров від ВІЛ-позитивних пацієнтів та клітин, які були інфіковані вірусними ізолятами іп міго. 65 Для одержання нових оболонкових фрагментів ВІЛ бажано використовується ланцюгова полімеразна реакція (РСК) для ампліфікації 100-2700 комплементарних пар основ (Бр) оболонкового гена із кожного окремого зразка від пацієнта, хворого на ВІЛ. Праймери РСК можуть представляти добре збережені послідовності ВІЛ, які є придатними для ампліфікації оболонкових генів із відомих зразків оболонкових генів, ізольованих ВІЛ чи різних зразків від хворих на ВІЛ пацієнтів. Ампліфікована ДНК бажано включає ділянку, що кодує 10-900 (наприклад, 100-400, 400-600 чи 600-900, або будь-який інтервал чи значення у цьому інтервалі) амінокислот із др120 і ор4і1 (які удвох складають др160). Продукти РСК бажано включають один чи кілька варіабельних ділянок (М1-М5) та сталих ділянок (С1-С5) оболонки, більш бажано більшу частину із ділянок М1, С1, М2, С2, М3, С3, М4, С4 та
М5. Крім того, ампліфіковані послідовності можуть кодувати 1-200 амінокислот, розташованих за місцем розщеплення для одр120/др41. Бажано, ампліфікується більша частина оболонкового гена або ген цілком. 70 Можливо, відсутня частина послідовності, що кодує др160, або всі послідовності, що кодують трансмембранний домен та/або домен цитоплазматичного хвоста |дивись, наприклад, НаїЇІепбего та ін., (1993)).
Праймери РСК можуть бути сконструйовані так, щоб сайти ферментів рестрикції розташовувались з боків послідовності оболонкового гена у плазміді коров'ячої віспи, так щоб вони були включені до ампліфікованих препаратів ДНК. Використовуючи добре відомі методики замісного клонування, можна одержати похідні плазміди коров'ячої віспи, які експресіють послідовності варіантів оболонкового білка від 1-10000 пацієнтів, шляхом заміщення ділянки кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка пацієнта на відповідну ділянку оболонкової послідовності у плазміді коров'ячої віспи, наприклад, використовуючи для заміщенні рестрикційні фрагменти. Наприклад, плазміда рМепма4 і препарати РСК обробляють Крпі і Взті для одержання послідовності, що кодує амінокислоти 1-639 скороченої др1б60, у якій відсутні як трансмембранний домен, так і домен цитоплазменного хвоста ор41 Ідивись, наприклад, Наїепбего та ін., (1993)).
Після лігування препарату РОК та продуктів рМепу бактеріальні клітини-хазяїни піддають перетворенню з лігувальною сумішшю за будь-яким з численних методів, добре відомих фахівцям у цій галузі, включаючи, наприклад, електропорацію, і рекомбінантні колонії збирають та аналізують секвенуванням.
Фрагменти рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що кодують оболонкові білки ВІЛ. Після цього віруси сч ов Коров'ячої віспи, що кодують варіанти оболонкового білка ВІЛ, рекомбінують у клітині-хазяїні з вірусом дикого типу, і збирають та зберігають матеріал вірусних бляшок, що експресують варіант оболонкового білка. Потім і) вірусний матеріал у вигляді оболонок вірусів коров'ячої віспи (МУмепу), кожна з яких містить окрему послідовність, що кодує варіант оболонкового білка, змішують з використанням від щонайменше 4-40, і до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів для одержання поліоболонкової вакцини за даним винаходом. с зо Плазміди рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що містять послідовності варіантів оболонкового білка, після цього необов'язково піддають секвенуванню чи відбірному аналізу з використанням антитіл, специфічних -- до оболонкового білка ВІЛ, для ідентифікації різних варіантів оболонкового білка. Бажано використовується М дідезокси-метод секвенування з обривом ланцюга за Сенгером. Бажано використовується раніше описана процедура здійснення методу |ЗатрьгсоокК та ін., (1989), нижче; Опіей Зіа(гез Віоспетісаї, Зедоепсе Мегзіоп 2.0 ме) зв ОМА бедицепсіпд Кії, Міпій Едйоп, Атегепат І йе Зсіепсе, Іпс., (1994)3), яка повинна зчитувати приблизно ї- 50-300 рр від позиції праймера.
Методи продукування векторів експресії вірусу коров'ячої віспи є добре відомими фахівцям у цій галузі дивись, наприклад, Маскей, М. та ін., Ргос. Май. Асад. сі. (ОБА), 79:7415-7419 (1982); Рапісаїї, О., апа
Раосіеці, Е., Ргос. Май. Асад. Зсі. (О5А), 79:4927-4931 (1982); патент США Мо4169763; Маглага, О.Р. та ін., «
Меїпоав іп Епг2., 217:557-581 (1993), Агйзиреї! та ін., нижче, у 5516.15-16.19). Бажано, раніше описаний вектор шву) с разсС11 |Спакгарапйі, З. та ін., Мої. СеїІ. Віо!, 5:3403-3409 (1985) може бути використаний для створення . плазміди, що кодує ооблонку, такої як рМепм4. и?» Вірус коров'ячої віспи, що використовується як вірусний вектор, має ряд корисних характеристик, включаючи здатність, яка дозволяє клонування великих фрагментів чужорідних ДНК (більше 20ОКБ), збереження інфекційності після вставки чужорідної ДНК, широкий діапазон хазяїв, відносно високий рівень синтезу білків і -І придатні транспортні, секреційні, процесингові та посттрансляційні модифікації, які визначаються первинною структурою білка, що експресується, і типом використаних клітин-хазяїв. Наприклад, безпомилково відбуваються о М-О-глікозилювання, фосфорилювання, міристилювання та розщеплення, а також збірка експресованих білків. -І Було розроблено кілька варіантів вектора коров'ячої віспи, які є придатними для використання за даним 5р Винаходом (наприклад, дивись А!Їзибреї! та ін., нижче, 5516.15-16.19). Найбільш звичайно, після одержання - вірусного матеріалу (А!зибреї, нижче, 516.16) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіант оболонкового
Ге білка, ставиться під контроль промотора вірусу коров'ячої віспи і інтегрується до геному коров'ячої віспи таким чином, щоб зберегти інфекційність (Аизире! та ін., нижче, у 516.17). За іншим варіантом, експресію можна здійснити шляхом трансфекції плазміди, що містить контрольований промотором коров'ячої віспи ген, кодуючий варіант оболонкового білка, до клітини, яку було інфіковано коров'ячою віспою дикого типу.
Бажано, клітина-хазяїн і вектор коров'ячої віспи є придатними та схваленими до використання у вакцинації
Ф) ссавців та людей. Ці рекомбінантні віруси досліджуються потім з використанням різних відомих методів (А!,зибеї ка та ін., нижче, у 516.18). За ще іншим варіантом, ланцюг полімерази РНК бактеріофага 17 може бути інтегрований до геному коров'ячої віспи так, щоб послідовності, що кодує варіант оболонкового білка, експресувались під бо Контролем промотора 17, будь то у плазмі, яку було піддано трансфекції, плазміді чи рекомбінантному вірусі коров'ячої віспи.
Використанню промоторів вірусів віспи надається перевага тому, що клітинні та інші вірусні промотори звичайно не розпізнаються транскрипційним апаратом коров'ячої віспи. Для поліоболонкових вакцин у рекомбінантній коров'ячій віспі бажано використовується складний ранній/пізній промотор, оскільки бажано, щоб 65 варіант оболонкового білка експресувався як антиген, який представлений в клітині-хазяїні, інфікованій рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи, асоційованим з класом І! чи ІЇ головної системи тканинної сумісності
(МНС). Такий МНеС-асоційований оболонковий білок ВІЛ утворить потім мішені цитотоксичних Т-клітин і забезпечить первинну вакцинацію ссавців реакцією цитотоксичних Т-клітин та/або гуморальною реакцією проти експресованих варіантів оболонкового білка ВІЛ. Це пояснюється тим, що здатність вірусних векторів коров'ячої віспи індукувати представлення МНС у клітинах-хазяїнах для цього типу антигенів зменшується на пізніх стадіях інфекції. Транскрипти з раннім початком реплікації термінуються після послідовності ТТТТТМТ і призводять до неадекватної МНО-презентації.
За іншим варіантом, будь-які такі термінуючі фрагменти у кодуючій послідовності гена можуть бути змінені шляхом мутагенезу, якщо використовується ранній промотор вірусу віспи для підсилення МНеО-презентації /о антигенів оболонкового білка у клітинах-хазяїнах (Еагі та ін., нижче, 1990). Для імітації мРНК вірусу коров'ячої віспи нетрансльовані лідерну та 3'-термінальну послідовності звичайно залишають короткими, якщо вони використовуються у плазмідах коров'ячої віспи, які включають послідовності, що кодують варіанти оболонкових білків ВІЛ.
Бажано, плазміда, використана для виготовлення фрагментів вірусу коров'ячої віспи за даним винаходом, /5 була сконструйована з сайтами рестрикції ендонуклеази для вставки оболонкового гена після промотора коров'ячої віспи (А!йзибреї! та ін., нижче, 516.17). Більш бажано, плазміда вже містить кодуючу послідовність оболонкового білка, у якій сайти рестрикції знаходяться лише біля кожного з початку та кінців кодуючої послідовності оболонкового білка. Такий само рестрикційний фрагмент кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка може тоді замістити відповідну послідовність у плазміді. У таких випадках, більша частина Кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка може бути вставлена після вилучення із плазміди більшості чи усіх кодуючих послідовностей оболонкового білка.
Бажано, одержаний фрагмент вірусу коров'ячої віспи (який містить кодуючу послідовність варіанта оболонкового білка і промотор коров'ячої віспи) має з боків ДНК коров'ячої віспи, що дозволяє здійснити гомологічну рекомбінацію при трансфекції плазміди до клітин, які раніше були інфіковані вірусом коров'ячої сч ов Віспи дикого типу. Бокові ділянки ДНК вірусу коров'ячої віспи обирають таким чином, щоб рекомбінація не о розірвала основний вірусний ген.
Без проведення селекції співвідношення між рекомбінантним та батьківським вірусом коров'ячої віспи становить звичайно приблизно 1:1000. Хоч така частота є досить високою, щоб дозволити використання гібридизації у бляшках (дивись А!йзире! та ін., нижче, у 556.3 та 6.4) чи імунологічного пошукового аналізу с зо (Мизибеї! та ін., нижче, у 56.7) для відбору рекомбінантних вірусів, для сприяння ідентифікації рекомбінантних вірусів застосовувались різноманітні методи. Необмежуючі приклади таких методик селекції чи пошукового (87 аналізу відомі фахівцям у цій галузі (А!зибеї! та ін., нижче, у 516.17). Звичайно, касета експресії обмежена з М боків сегментами генів тимідинкінази (ТК) коров'ячої віспи, внаслідок чого рекомбінація призводить до інактивації ТК. Після цього вірус з фенотипом ТК- можна відрізнити від вірусів з ТК -фенотипом шляхом о інфікування лінії клітин ТК- у присутності 5-бромо-дезоксіуридину (5-Вга)), який повинен бути фосфорильованим (Ура
ТК для летального включення до вірусного геному. Альтернативно або додатково рекомбінантні віруси можуть бути обрані шляхом спів-експресії бактеріального антибіотик-стійкого гена, такого як ампіцилін- (атр) чи гуанінфосфорибозилтрансферазою (ор). Як додатковий приклад можна вказати, що спів-експресія гена Іас 7 «
Езіегіспіа соїї дозволяє провести спів-пошуковий аналіз бляшок рекомбінантного вірусу з Хадааї! (А!йзибеї! та ін., нижче, у 516.17). - с Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи, що експресують варіант оболонкового білка за даним винаходом, й можуть бути необов'язково атенуйовані чи інактивовані згідно з відомими методами, такими як теплова обробка, "» обробка параформальдегідом, ультрафіолетове випромінювання, обробка пропіолактеном, утворення гібриду чи хімери або іншими відомими методами |дивись, наприклад, 7адигу та ін., Майиге, 332:728-731 (1988); Мо та ін. Сапсег Кев., 50:6915-6918 (1990); УМейв та ін., У. Іттипої., 99:1134-9 (1967); С'Нопспї, Массіпе 10 -І (бБиррі.):548-52 (1992); ЗеіепКа та ін., Агсп. Нуд. Васіеної., 153:244-253 (1969); ОСгипамжаїд-Веагсй та ін;, 9.
Сапсег Кев. Сііп. Опсої., 117:561-567 (1991)). Наприклад, теплова інактивація при 609 значно знижує титр о вірусу. Такі методики атенуації проходять тестування на безпеку, оскільки неповна інактивація може призвести - І до смерті пацієнта |(ОогогупеКу апа Апаеггоп, Зсіепсе, 252:501-502 (1991)). шу 20 Такі атенуйовані чи інактивовані рекомбінантні віруси коров'ячої віспи повинні використовуватись у тих випадках, коли пацієнт може мати компромісну імунну систему, оскільки введення живої коров'ячої віспи може що) призвести до ускладнень чи смерті.
Фармацевтичні композиції
Фармацевтичні препарати за даним винаходом, придатні для інокуляції або для парентерального чи перорального введення, включають поліоболонкову рекомбінантну вірусну вакцину, яка включає від щонайменше 4 до приблизно 10000, бажано від 4 до приблизно 1000, і більш бажано від приблизно 10 до
ІФ) приблизно 100 різних різних рекомбінантних вірусів у формі лізату клітин, мембранно-зв'язаної Фракції, ко частково очищеній чи очищеній формі. Бажано, поліоболонкова вакцина включає лізат клітин (або його мембранно-зв'язану фракцію), що містить рекомбінантний вірус, який у свою Чергу включає варіанти бо оболонкового білка, вже експресовані рекомбінантними вірусами. Як було знайдено, включення експресованих варіантів оболонкового білка підсилює первинну реакцію антитіл.
Композиція поліоболонкової вакцини може мати форму стерильних водних чи неводних розчинів, суспензій або емульсій, і може також містить допоміжні агенти чи наповнювачі, що є відомими фахівцям у цій галузі.
Кожен із щонайменше від приблизно 4-40 до 10000 різних вірусів кодує та експресує окремий варіант 65 оболонкового білка, як описано у даній заявці. ДНК, що кодує варіант оболонкового білка, може бути обрана таким чином, щоб представляти варіанти оболонкового білка, існуючі у конкретній ізольованій спільності пацієнтів, хворих на ВІЛ. Наприклад, вакцина може представляти послідовності із Мемфісу (штат Теннессі), і бути призначеною для застосування у Мемфісі (штат Теннессі). Вакцини, сконструйовані таким чином, щоб представляти географічно обмежені райони, можуть також бути придатними для використання у спільнотах, що
Знаходяться за межами цільової спільноти.
За іншим варіантом, ДНК, що кодують варіанти оболонкового білка, можуть бути обрані таким чином, щоб представляти географічно віддалені спільності, міста чи країни, такі як клади (відособлені групи) (сіадев).
Наприклад, в одній поліоболонковій вакцині можуть бути представлені множинні клони. Композиція поліоболонкової вакцини може додатково включати імуномодулятори, такі як цитокіни, що посилюють 70 вибірковість імунної реакції на вірусну інфекцію. |Дивись, наприклад, Вегком/ та ін., Едв., Те МегскК МапиаїЇ,
Ейеепій Еаййоп, МегсК апа Со. Капулау, МО (1987); Соодтап та ін., ед5., Соодтап апіа Сітапе Те
Рпагтасоїіодіса! Вавзів ої Тпегареціїсв, Еідпї Еадйіоп, Регдатоп Ргевзв, Іпс., ЕІтвїога, ММ (1990); Амегуз ЮОгид
Тгеаійтепі: Ргіпсіріевг апа Ругасіїсе ої Сіїпіса! РІПагптасоіоду апа ТПегарешіісв, Тпіга Еайіоп, АБІ5З Ргезв,
ІЇТО., УММіШате апа МУйкіпв, Вайітоге, МО (1987); і Каїгипо, ейд., Вавзіс апа Сіїпісаї! РІаптасооду, РА 7/5 ЕдШоп, Арріеюп апа Гапде, Могмаїк, СТ (1992)), які, разом з наведеними у них посиланнями, відображують сучасний стан знань у цій галузі.
Як зрозуміло рядовому фахівцю у цій галузі, при введенні поліоболонкової вакцини за даним винаходом людині вона може бути у формі композиції, яка додатково може включати принаймні одну домішку із солей, буферів, ад'ювантів чи інших речовин, які є бажаними для поліпшення ефективності композиції. Ад'юванти є 2о речовинами, які можуть бути використані для специфічного посилення принаймні однієї імунної реакції. Звичайно ад'ювант і композиція змішуються перед введенням до контакту з імунною системою, або вводяться до контакту окремо, але до одного й того самого місця особи, яку імунізують. Ад'юванти можуть бути вільно розділені на кілька груп на базі їх складу. Ці групи включають масляні ад'юванти, мінеральні солі (наприклад, АЇК(ЗО /)»,
АІМа(5О4)2, АІМНІ(ЗО)), оксид кремнію, каолін та хімічно чисте вугілля), полінуклеотиди (наприклад, полі-ІС сч ов та полі-АО-нуклеїнові кислоти) і деякі природні речовини (наприклад, віск О із Мусобрасіегішт (ирегсціовів, речовини, знайдені у Согуперасіегт рагуит або ВогаейеМа репиззіз та членах роду ВгисеМа). Серед цих і) речовин особливо корисними як ад'юванти є сапоніни (наприклад, Оці А., Зуиреповз А/5, ЮОептагк). Приклади матеріалів, придатних для використання у композиціях вакцини, описані, наприклад, у Оз8ої, А., ей.,
Кетіпдіоп'є Рпаптасеціїса! Зсіепсез, Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп, РА (1980), рр. 1324-1341. с зо Фармацевтична композиція поліоболонкової вакцини за даним винаходом може далі додатково включати принаймні одну антивірусну хіміотерапевтичну сполуку. Необмежуючі приклади можуть бути обрані із принаймні (7 однієї сполуки із групи, що складається з гаммаглобуліну, амантадину, гуанідину, гідроксибензімідазолу, М інтерферону-о, інтерферону-др, інтерферону-у, інтерлейкіну-1б6 (11-16; Кипй, Мате, 8 грудня 1995); тіосемикарбазонів, метизазону, рифампіну (гітатріп), рибвірину (гібмігіп), аналога піримідину (наприклад, А2Т і. з5 тагйабо ЗТ), аналога пурину, фоскарнету (Тозсагпе), фосфонооцтової кислоти, ацикловіру (асусіомі), зче дідезоксинуклеозидів, інгібітору протеази (наприклад, саквінавіру (задціпамії; (фірми Нойтапп-іа КоснНе); індинавіру (іпаіпамігї; (фірми Мегск); ритонавіру (піопамії; (фірми Аррой Іарв); АС1343 (фірми Адошйгоп
РНагтасеціїсаів); УХ-2/78 (фірми Сіахо МУеПсоте)); хемокінів, таких як КАМТЕ5, МІРІ о чи МІРІД (Зсіепсе, « 270:1560-1561 (1995) або ганцикловіру (дапсісіоміг" Дивись, наприклад, Кісптап: Аз Кев. Нит. Вейомігизев, 8:1065-1071 (1992); Аппи. Кему. РВагтасої. Тохісоі., 33:149-164 (1993); Апійтістор. Адепів -д с Спетоїпег., 37:1207-1213 (1993); АІОз Кев. Нит. Кеїгомігизез, 10:901 (1994); Каїгипд (1992), нижче, та ц наведені у них посилання на сторінках 798-800 та 680-681, відповідно. "» Фармацевтичне застосування
Введення поліоболонкової вакцини (або антисироватки, яку вироблення якої вона спричинює) може здійснюватись з "профілактичною" чи "терапевтичною" метою, бажано з профілактичною метою. При -І профілактичному введенні композиція живої поліоболонкової вакцини вводиться заздалегідь, до виявлення будь-яких симптомів інфекції ВІЛ чи захворювання на СНІД. Профілактичне введення сполуки (сполук) має на
Мн меті попередження чи послаблення будь-якої наступної інфекції ВІЛ. -І При терапевтичному застосуванні поліоболонкова вакцина вводиться при виявленні симптому дійсної шу 20 інфекції. Введення живої поліоболонкової вакцини після інфекції ВІЛ здійснюється лише у тих випадках, коли буде визначено, що імунна система пацієнта здатна відреагувати на введення живої поліоболонкової вакцини з без суттєвого ризику неналежних ускладнень чи смерті, а введення живого вірусу здійснюється при дозуванні, яке потрібне для атенуації будь-якої дійсної інфекції ВІЛ.
За іншим варіантом, якщо пацієнт має компромісну імунну реакцію, терапевтичне застосування бажано
Включає використання композиції атенуйованої чи інактивованої поліоболонкової вакцини, у якій рекомбінантні віруси є атенуйованими чи інактивованими, як було описано вище. Дивись, наприклад, Вегкожм (1987), нижче, о Сбоодтап (1990), нижче, Амегу (1987), нижче, Каїгипуд (1992), нижче, ЮОогогіпеКу апа Ападегзоп, Зсіепсе, іме) 252:501-502 (1991).
Про композицію говориться, що вона є "фармацевтично прийнятною", якщо її введення може бути бо перенесено пацієнтом, який її одержує. Про такий агент говориться, що він вводиться у "терапевтично чи профілактично ефективної кількості", якщо введена кількість є фізіологічно значимою. Вакцина чи композиція за даним винаходом є фізіологічно значимою, якщо її присутність призводить до помітної зміни фізіології пацієнта, який її одержує, бажано шляхом посилення гуморальної чи клітинної імунної реакції на ВІЛ. "Захист", що забезпечується, не повинен бути абсолютним, тобто інфекція ВІЛ чи захворювання на СНІД не 65 повинні бути повністью попереджені чи знищені, за умови, що спостерігається статистично значиме поліпшення відносно контрольної популяції. Захист може бути обмеженим зм'якшенням гостроти чи швидкості з'явлення симптомів хвороби.
Фармацевтичне введення
Вакцина за даним винаходом може надавати стійкість до одного чи кількох штамів ВІЛ. Таким чином, даний винахід стосується та пропонує засоби для попередження чи послаблення інфекції принаймні одним штамом
ВІЛ. У даному описові про вакцину говориться, що вона попереджує чи послаблює хворобу, якщо її введення особі призводить чи до повного або часткового послаблення (тобто пригнічення) симптому чи хворобливого стану, чи до повного або часткового імунітету особи до хвороби.
Для досягнення бажаної мети може бути введена принаймні одна поліоболонкова вакцина за даним 7/0 Винаходом за допомогою будь-яких засобів і з використанням фармацевтичної композиції, яка описана у цій заявці.
Наприклад, введення такої композиції може бути здійснено різними парентеральними маршрутами, такими як підшкірно, внутрішньовенно, інтрадермально, ввнутрішньом'язово, інтраперитонеально, інтраназально, трансдермально чи трансбуккально. Парентеральне введення може бути здійснено шляхом ін'єкції болюса чи 7/5 шляхом поступової перфузії протягом певного часу. Дивись, наприклад, Вегком/ (1987), нижче, боодтап (1990), нижче, Амегу (1987), нижче, і Каїгипа (1992), нижче.
Типова схема попередження, пригнічення чи лікування хвороби чи стану, які можуть бути послаблені завдяки створенню клітинної імунної реакції шляхом активної специфічної клітинної імуннотерапії, включає введення ефективної кількості композиції вакцини, як описано вище, при її введенні за один прийом або повторюваними 2о дозами для посилення реакції чи вторинної імунізації на протязі періоду від одного тижня до приблизно 24 місяців включно.
Згідно з даним винаходом, "ефективною кількістю" композиції вакцини є кількість, достатня для досягнення бажаного біологічного ефекту, у цьому випадку - викликання принаймні однієї із клітинної і гуморальної імунної реакції на ВІЛ. Зрозуміло, що ефективна доза буде залежати від віку, статі, стану здоров'я та ваги сч пацієнта, вида лікування, що проводиться одночасно, якщо воно є, частоти проведення лікування и характеру бажаного ефекту. Наведені нижче інтервали ефективних доз не повинні обмежувати винахід і репрезентують і) бажаний інтервал дозування. Однак, найбільш бажані схеми дозування будуть визначатись для кожної окремої особи фахівцем у цій галузі, який розуміється на цьому, без непотрібних експериментів. Дивись, наприклад,
Ветгком (1987), нижче, Соодтап (1990), нижче, Амегу (1987), нижче, Ераді, Рпаптасоїіоду, І іШе, Вгом/п апа Со., с зо Возіоп, МА (1985), і Каїгипо (1992), нижче.
Загалом кажучі, схема дозування для дорослої людини буде складати приблизно 105-109 бляшкоутворюючих - одиниць (рішукг чи колонієутворюючих одиниць (СЕШукг на дозу, бажано 109-109, Будь-яка доза, що - застосовується, повинна бути безпечною і ефективною кількістю, що визначається відомими методами, як описано у цій заявці. о
Суб'єкти -
Реціпієнтами вакцин за даним винаходом можуть бути будь-які ссавці, що можуть набути специфічного імунітету за допомогою клітинної чи гуморальної імунної реакції на ВІЛ, у яких клітинна реакція медіюється булком МНС класу | чи класу ІІ. Із ссавців бажаними реціпієнтами є ссавці ряду приматів (Огдегв Ргітаїйа) « (включаючи людей, шимпанзе, людиноподібних мавп та мавп). Найбільш бажаними реціпієнтами є люди.
Суб'єкти бажано інфіковані ВІЛ або створюють модель інфекції ВІЛ Інаприклад, Ни та ін., Маїиге, 328:721-723 - с (1987). а Після наведеного загального опису винаходу його буде легше зрозуміти з посиланнями на наступні приклади, ,» які наведено як ілюстрацію, без наміру обмежити даний винахід.
Приклади
Приклад 1: Одержання векторів вірусу коров'ячої віспи для експресії оболонкового білка ВІЛ -і Номенклатура. При посиланнях у цій заявці комплекс рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи позначається с також як Ууєлу-комплєкс, причому специфічні комплекси вірусу коров'ячої віспи позначаються відповідно до пацієнта або до депозиторію (наприклад, АТСС або СепВапк як джерел оболонкової ДНК у комплексі). -і Наприклад, ММепу-Юое буде позначати комплекс вектора вірусу коров'ячої віспи, який має оболонкові ши 20 послідовності, одержані від пацієнта на ім'я Юоєе, а ММепу-028305 буде позначати вектор вірусу коров'ячої віспи, який має оболонкові послідовності, що знаходяться у СепВапк за МеО28305. що) Поліоболонкова вакцина складається із 4-100 різних рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, кожен з яких експресує окремий оболонковий білок ВІЛ-1. Задля визначеності кожен індивідуальний вірус позначається як
ММепу, а готова вірусна суміш називається поліоболонковою.
Для одержання кожного ММепм використовується плазміда, яку позначено рМепма4, і вірус коров'ячої віспи дикого типу, який позначено МУСОН, як описано нижче. Додаткові деталі наведено у Куап та ін., "Ргерагайоп о апа Ове ої Массіпіа Мігив Тог НІМ Ргоївіп Ехргезвіоп апа Ітптипігайоп", у Іттипоіоду Меїйодз МапцпиаїЇ, іме) Ї екоміі7, ед., Асадетіс Ргезз (1996).
Вектори і клітини-хазяїни. Описаний раніше вектор рЗС11 (|СНакКгабрагії, 5. та ін., Мої. Се. Віо)/., 60 5:3403-3409 (1985)| може бути використаний длярекомбінації численних генів ВІЛ до геному коров'ячої віспи.
Елементи плазміди реС11 включають ген Іас7 (ген-рипортер, по якому трансформовані бактерії і рекомбінанти вірусу коров'ячої віспи можуть бути легко ідентифіковані як такі що мають Др-галактозидазну активність), частину гена, що кодує тимідинкіназу (ТК) і ген стійкості до ампіциліну (атр). Клоновані у рО5С11 гени вставляються до геному вірусу коров'ячої віспи шляхом гомологічної рекомбінації між геном ТК вірусу дикого 65 типу і ділянками гена ТК, що входять до росС11. Вставка ДНК плазміди до локусу вірусного ТК інактивує вірусний ген, так що рекомбінантні віруси можуть бути легко відібрани від фонових ТК" -вірусів за допомогою вирощування у бромодезоксиуридині (ВОаК). Для того, щоб рекомбінантний ТІС-вірус пережив цей відбір, його треба вирощувати у клітинах, що не постачають активний фермент ТК, таких як лінія клітин ТК-143, яка є
ТК-позбавленим похідним лінії клітин людини КУ70-5 - лінії клітин остеосаркоми |КНАіт, 9.5. та ін., ІМ. 5.
Сапсег, 15:23-29 (19753), що підтримує ріст вірусу коров'ячої віспи (МУеїг та ін., нижче (1982)). Експресія сегмента гена ВІЛ може бути здійснена шляхом вставки повного гена в сайт Зта! вектора реС11. Гени, що мають повну довжину, можуть бути експресовані під контролем промотора Р7.5К.
Як альтернатива до клонування цілих генів ВІЛ, може здійснюватись заміщення частини генних послідовностей для генів ВІЛ, які вже були клоновані до ресС11. Наприклад, комплекс, позначений як рМепмі, був 70 одержаний із реС11 і експресує ген оболонкового білка (епу) ВІЛ ВНІО (НаПепбрегоег та ін., (1993); Кіїраїтіск та ін., У. Віої. Спет., 262:116-1211 (1987). Комплекс може бути використаний як батьківський вектор для заміщення і експресії варіабельних ділянок оболонкового білка із польових ізолятів ВІЛ. Аналогічно, вектор, позначений рУепм4, був сконструйований із рес11 для експресії оболонкового білка ВНІ0О, скороченого з метою вилучення послідовностей др41, що кодують трансмембранний домен та домен цитоплазменного хвоста, але /5 при збереженом домені олігомеризації (НаПепрегдег та ін., (1993), нижче). Кваліфікованому фахівцю у цій галузі зрозуміло, що термін "домен олігомеризації" використовується функціонально, для позначення ділянки орії1, яка забезпечує олігомеризацію оболонкових білків, тобто залишається достатня структура для олігомеризації. Вектор рМепм4 кодує скорочений др160 (також: др160ї, др140), який, як було знайдено, утворює третинну структуру, аналогічну до структури олігомера др41/др120 (димер, тример чи тетрамер), яка присутня на клітинній поверхні інфікованих ВІЛ клітин. Ця третинна структура зберігається як у секретованій, так і у мембранно-асоційованій формі (НаПепрегодег та ін., (1993), нижче|. Цей вектор бажано виколристовується як батьківській вектор для заміщення альтернативних ізольованих оболонкових послідовностей.
У цьому Прикладі одержання кожного комплексу ММепм включає використання рМепм4 і вірусу коров'ячої віспи дикого типу МУСОН, а також відповідних клітин-хазяїнів, як детально описано нижче. сч рМУепм4: Вектор рМепм4 був одержаний раніше шляхом вставки послідовності, що кодує оболонку ВІЛ-1, до рекомбінаційного вектора вірусу коров'ячої віспи рЗС11 (|НаЇепрегдег та ін., Мігоїюсду, 193:510-514 (1993); і)
Спакгарагі, З. та ін., Мої. СеїЇ. ВіоІ., 5:3403-3409 (1985). Послідовність ВІЛ-1ї одержували (із лабораторного матеріалу живого вірусу. Послідовність було названо "ВНІ" |Каїпег та ін., Майшге, 313:277-284 (1985). За допомогою методу РСК можна піддати ампліфікації унікальні оболонкові послідовності від с зо інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів і провести їх заміщення в оболонкову послідовність ВНІТО для створення нових векторів. Наприклад, для РОК можуть бути використані такі праймери: -- (А) Смисловий, положення 5785 (ЗЕО ІЮ МО:1) (Ідентифікатор послідовності Мо1): ч-
АССАСААСАСАСТООССААТОАСАСТОА. (В) Антисмисловий, положення 7694 (5ЕО ІЮ МО:2): ме)
ССАСТСОСАТССАСОСТСАТОТТАТТССАААТ. ча (С) Крпі-смисловий, положення 5903 (ЗЕО ІЮО МО:3):
СТОООСТОАСАСТСТАТТАТОСО СОСТАССТОТОТ. (Ю) Взті-антисмисловий, положення 7659 (5ЕО ІЮ МО 4):
ССАСАСАТТТАТТАСТСОСААСТ АССАТТС СААДОО. « (Е) (необов'язковий) ОгаП-смисловий, положення 6153 (ЗЕО ІЮО МО:5): в с ССАТОТОТААААТТААССС САСТСТОТО.
Й (Р) (необов'язковий) ВзиЗбІ-антисмисловий, положення 6917 (ЗЕО ІЮ МО:6): и? ТАСААТТТСТОООТССССТ ССТОдОО.
Ці праймери записані 5 до 3. Сайти рестрикції підкреслені (пронумеровані позиції вказано на основі послідовності ВНІО (Каїпег та ін., Майиге, 313:277-284 (1985)). -І Стратегія РСК: Для одержання нових комплексів оболонкових білків ВІЛ-1, ланцюгова полімеразна реакція (РСК) використовується для ампліфікації 1800 комплементарних пар основ (Бр) оболонкового гена із сорока о різних зразків ВІЛ-1 від пацієнтів. Праймери РОК представляють добре збережені ВІЛ-1-послідовності і, таким -І чином, успішно ампліфіковані оболонкові гени із багатьох різних пацієнтів, хворих на ВІЛ-1. Ампліфікована ДНК 5р Охоплює весь білок др120, за винятком приблизно 10 добре збережених амінокислот з аміно-кінця білка. - Продукти РСК включають всі варіабельні оболонкові ділянки (М1-М5). Крім того, ампліфіковані послідовності
Ге кодують приблизно 100 амінокислот за межою сайта розщеплення для др120/др141.
Праймери РСК, що містять сайти рестрикції ферменту для Крпі та Веті, розміщені з боків послідовності оболонкового гена ВН1І0 у рМепм4, включаються до ампліфікованих ДНК-продуктів.
Перша стадія РОК: У пробірці мікроцентрифугі ємністю 50Омкл змішують: - 1мкл Праймера А (ЗЕО ІЮ МО 1), ЗООнг/мкл;
Ф) - 1мкл Праймера В (ЗЕО ІЮ МО:2), ЗООнг/мкл; ка - 2,5мкл 10мММ кожного з 4 2МТР - Лмкг ДНК; 60 - ЛОмкл 1О0Х РСК-буфера; і - хроматографічно чисту воду до 9Омкл.
Змішують маточний розчин у вихровій мішалці і дозують мкл до реакції РСК. Ретельно змішують. Зверху заливають мінеральним маслом.
Обробляють у програмованому термостаті у такому режимі: 65 - Інкубують при 959 - Виконують 40 циклів: 952С, 1 хвилина; 452С, 2 хвилини; 722С, 3,5 хвилини.
Друга стадія РСК: Готують реакцію РСК як описано вище, але з праймерами С та ОО (5ЕО ІЮ МОЗ та 4, відповідно) і без ДНК. Доводять готовий розчин до 95мкл. Зверху заливають мінеральним маслом. Закупореним наконечником вилучають бмкл першої РСК-реакції (з-під мінерального масла). Змішують зразок з другою реакцією під шаром масла і розпочинають цикли, як і раніше. Звичайно достатньо тридцяти циклів. Може бути бажаним контролювати продукт шляхом вилучення 2мкл для аналізу на гелі після кожних 10 циклів доти, доки не буде ідентифікована чітка смуга, що відповідає приблизно 1800Бр.
Шляхом використання добре відомих методик заміщувального клонування було одержано похідні рМепм4, що експресують оболонкову послідовність від одного із 40 пацієнтів замість оболонкової послідовності ВН10. 7/0 Коротко, плазміда рМепм4 і продукти РСК потім розрізають Крпі та Взті, розрізану рУепм4 розділюють на агарозному гелі і ізолюють великий фрагмент. Маленький фрагмент ВНІТО (фрагмент розміром 1800Бр) вилучають. Вирізаний продукт РСК також ізолюють і лігують з великим фрагментом рМепу4 для створення хімерної оболонкової послідовності, що містить тепер 1800Бр варіантного оболонкового білка із ДНК пацієнта.
Після лігування продукту РОК і продуктів рМепу, бактеріальні клітини-хазяїни трансформують з сумішшю для лігування за допомогою будь-якого із добре відомих фахівцям методу, включаючи, наприклад, електропорацію, і рекомбінантні колонії збирають і аналізують секвенуванням.
Плазміда рМепм4 чи рекомбінанти, виготовлені з використанням рМепм4, сприяють інсерції генів до геному вірусу коров'ячої віспи шляхом гомологічної рекомбінації між геном тимідинкінази (ТК) вірусу дикого типу і
ТК-послідовностями в плазміді. Вставка ДНК рМепмаі до вірусного локусу ТК дозволяє одержати вірус коров'ячої
Віспи з оболонковим геном ВІЛ-1, експресуємим під контролем раннього/пізнього промотора Р7.5К. Активність вірусу до росту послаблюється завдяки розриву локусу ТК. Додатковим елементом рМепма є ген Іас7, який кодує р-галактозидазну активність. Активність Іас7 може бути використана для відбору рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи (дивись нижче).
Оболонковий ген, що експресується рМепум4, є скороченим для того, щоб виключити с
Ттрансмембранну/С-термінальну послідовність др41. Вектор експресується як олігомерна структура, яка знаходиться усередині клітин у секретованій формі. о
Вірус коров'ячої віспи-МУСОН. Кожна нова заміщена плазміда окремо рекомбінується з вірусом коров'ячої віспи дикого типу МУСОН. Цей вірус було одержано від А.Т.С.С. (Ассезвіоп Мо.МК-325) і піддано очищенню у бляшках перед використанням |ВисК, С, апа Рашіїпо, М.5., едз., Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп Сайаіодце ої Га Апіта! Мігиовев апв Апіїзега, Спіатуадіае апа КісКейвіае, віп Ед. Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп, КоскКміМе,
МО(1990), р.138). -
Бактеріальні клітини-хазяїни. Плазміда може бути вирощена на будь-якому придатному хазяїні, як це відомо їч- фахівцям у цій галузі |дивись, наприклад, А!йзивбеї, нижче, (1995 гем.), 5516.15-16.19). Необмежуючим прикладом є клітини ОН5о.. о
ТК-недостатні клітини. Трансформування та заміщення вірусу коров'ячої віспи здійснюється на лінії клітин - людини ТК 143В, яка є ТК-недостатнім похідним лінії клітин людини К9У70-5 - лінії клітин остеосаркоми |Кпіт та ін., (1975), нижче), яка підтримує ріст вірусу коров'ячої віспи (МУеїг та ін., (1982), нижче). Кожен рекомбінант вірусу коров'ячої віспи, що містить унікальну послідовність оболонкового гена ВІЛ, вибирається на « основі експресіє гена Іас7 (на вірусні бляшки накладають шар Війо-да! і вибирають по Д-галактозидазній активності, яку визначають по появі синього кольору). Здійснюють дві стадії РСК. - с Приклад 2 Одержання поліоболонкової вакцини м Останньою стадією приготування є вирощування п комплексів ММепм на клітинах Мего, щойно придбаних у я А.Т.С.С. (Ассезвіоп Мо. ССІ 81 чи ХЗ8) і клонованих та розмножених для вирощування вірусу. Лінія клітин Мего була схвалена Всесвітньою Організацією Охорони Здоров'я для одержання вакцин |Нау, К., та ін., едв., Атегісап
Туре Сийшге СоПесіоп Саїваіодце СеїЇ Ііпез апа Нубгідотав, 7 Ба, Атегісап Туре Сийшге СопПесіоп,
Ш- КоскміПе, МО (1992), р.481. оо Клітини Мего вирощують з використанням середовища Ігла, модифікованому за Дульбеко (Віо-УУпіЧакег), глутамінової добавки (Віо-МУпіКакег) та термоінактивованої сироватки плоду корови (Нусіопе, Іпс.). За іншим
Ш- варіантом, може використовуватись середовище, що не містить сироватки. Кожен комплекс ММепи інокулюють -щ 20 на окремий злитий шар клітин Мего, і збирають вирощені клітини, коли вони демонструють цитопатичні ефекти внаслідок вірусної інфекції. Екстракти клітин тривалий час промивають фосфатно-сольовим буфером г» (Віо-М/півакег) після збору і перед заморожуванням. Клітини потім розрушають циклічним заморожуванням-відтаюванням, озвученням чи центрифугуванням у центрифузі на малій швидкості (необов'язково). Аліквоти надосадної рідини зберігають потім при -702С. Оболонковий білок є присутнім у лізаті 22 в концентраціях, достатніх для одержання антитіла, специфічного до оболонкового білка ВІЛ (при визначенні
Ф! методом імуноферментного твердофазного аналізу), у моделях ссавців, навіть якщо вірус коров'ячої віспи був послабленим, наприклад, шляхом нагріву препарату до 602С протягом 1 години. о Готова вакцина. Матеріал кожного вірусу (комплекс ММепу) із клітин Мего індивідуально заморожують і потім титрують і піддають випробуванням на безпеку. Після завершення тестів аліквоти кожного вірусу змішують для 60 одержання маточної вакцини з загальним титром 10 Зріш/мл ("рїи" позначає бляшкоутворюючі одиниці). Якщо було використано 40 комплексів ММепу, то кожен ММепми бажано є представленим у рівному ступеню, і кожен
ММепу використовується з титром 2,5х109ріш/мл у готовій вакцині. Це повинно дати загалом 1х1ОЗргш/мл.
Оцінка поліоболонкової вакцини 65 Миші. Миші можуть бути інфіковані за допомогою інтраперитонеальної ін'єкції їх10'"ріми вірусу коров'ячої віспи, експресуючого оболонковий білок. Антитіло може бути ідентифіковано методом імуносорбентного твердофазного аналізу на ВІЛ, або методами аналізів нейтралізації, як описано вище, через три тижні після ін'єкцій вірусу коров'ячої віспи.
Перед виготовленням вакцини, призначеної для застосування на людях, була одержана аналогічная Група,вірусів з метою випробування вакцини на мишах. Ці віруси вводились мишам інтраперитонеальним чи підшкірним шляхом. Потім ми здійснювали тестування активності ВІЛ-1-специфічних антитіл сироватки методом імуносорбентного твердофазного аналізу (ЕІЗБА). Аналіз включає висіювання цілих розрушених ВІЛ-1 на планшетах для (НТІМ |в) і блокування планшетів альбуміном бичачої сироватки. Потім додавали зразки сироватки при розведенні 1:100, 1:1000 ї 1:10000 у фосфатно-сольовому буфері. Проби проявляли кон'югованим /0 З лужною фосфатазою антитілом козлиного-анти-мишачого імуноглобуліну і п-нітрофенілфосфатом. Кольорову реакцію припиняли розчином гідроксидом натрію, і оптичну густину вимірювали за допомогою пристрою для вимірювання оптичної густини планшетів ЕГІЗА при 405нм.
Як зображено на Фігурі 2, однократна інокуляція препаратом лізату клітин з 10 6-10"ріш вірусу коров'ячої віспи (який містить одну кодуючу послідовність оболонкового білка ВІЛ-1 і мембранно-зв'язаний експресований 75 оболонковий білок) викликає сильну реакцію антитіл проти ВІЛ-1, яка зберігалась на протязі шести місяців проведення експерименту. Така реакція антитіл була значно вищою за описані раніше для інших методів імунізації Ця сильна реакція антитіл може бути приписана до присутності у препараті вакцини мембранно-зв'язаного оболонкового білка. Як зображено на Фігурі 3, ці реакції залежали від дози. У ссавців, які одержали дозу 102ріц, спостерігались слабші реакції, ніж у ссавців, які одержали 10 "рі.
Були також одержані суміші вірусів коров'ячої віспи, що експресують різні оболонкові білки ВІЛ-1. Коли миші одержували 10'ртш суміші п'яти вірусів, їх реакції були по суті ідентичними по силі до реакцій, що генеруються проти 10 "ри одного рекомбінанта вірусу коров'ячої віспи (Фігура 4). Змішування великої кількості вірусів коров'ячої віспи, експресуючих оболонкові білки, описано не було, але очікується, що воно створить широкий спектр нейтралізуючих антитіл. с
Люди. Перед клінічними випробуваннями проводились тести змішаного вірусного матеріалу, метою першого г) з ниж була ескалація доз і тестування на безпеку.
Клінічні випробуваня будуть дослідженнями ескалації дози, які включають набір чотирьох груп добровольців.
Кожна група одержує одну із таких доз вакцини: (1) 2х102рги с 3о (2) 2х105рги - (3) 2х105ріи м (4) 2х10 "ри
Кожен доброволець одержує змішану вірусну вакцину у О0,бмл сольвого розчину, яка вводиться шляхом о підшкірної ін'єкції. ї-
Приклад 3: Індукування первинного ізолят-нейтралізуючого імунітету за допомогою поліоболонкової вакцини
ВІЛ-1 на основі вірусу коров'ячої віспи у шимпанзе
Популяція ізолятів ВІЛ-1Ї озброєна складним набором оболонкових білків. Оболонкові білкі є єдинимі вірусно-кодуємими зовнішнімі білками і цілями для активності нейтралізуючих антитіл, але антитіла, що «
Виробляються проти одного ізоляту, не будуть обов'язково нейтралізувати інший. Внаслідок цього ми одержали в с вакцину-коктейль ВІЛ-1 - поліоболонкову вакцину, яка експресує численні оболонкові білкі. Виготовлення . вакцини почалось з одержання тридцяти різних рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи, кожен з яких експресував и?» окремий оболонковий білок. Після цього були проведені випробування ММепу, як окремих, так і у сполученні (РоїуЕпу), на моделі шимпанзе. Чотирьох шимпанзе імунізували підшкірно трьома ін'єкціями окремого оболонкового білка (ММепу) (Шимпанзе 71 та 2) або РоїумЕпу (Шимпанзе З та 4), після чого робили одну -І внутрішньом'язову ін'єкцію рекомбінантного білка др120/др141 у суспензії оксиду алюмінію. Для усіх чотирьох тварин було продемонстровано безпеку, лише у однієї спостерігались ознаки ульцерації у місці ін'єкції. Зразки о сироватки контролювали за допомогою численних тестів на зв'язування та нейтралізацію ВІЛ. Найвищу якість -І активності антитіл продемонстрували антитіла шимпанзе З та 4. Нейтралізуюча функція була продемонстрована бр як до лабораторного ізоляту, так і до первинного ізоляту ВІЛ-1, жоден з яких не був специфічно представлений - у вакцині. Таким чином, праймування лімфоцитів з використанням змішаних оболонкових білків є перспективним
Ге методом, за яким можна виробити високоякісні антитіла проти різних ВІЛ-1.
Матеріали та методи рМУепм4, вектор рекомбінації вірусу коров'ячої віспи. рМепм4 був одержаний раніше шляхом введення в бтопового кодону до оболонкової послідовності ВНІТО і вставки модифікованого оболонкового гена ВН1І0 (епу) до рзсС11. рМепу4 експресував продукт оболонкового білка, який був обірваний на амінокислоті 640 і був здатний як
Ф) до секреції, так і до олігомеризації. Продукування рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, ММепм4, що ка експресує цей скорочений оболонковий білок ВНІТО, було описано раніше (|НаПепрегдег та ін., Мігоіоду, 193:510-514(1993)). во РСК для ампліфікації оболонкових послідовностей від інфікованих ВІЛ-1 осіб. Для ампліфікації оболонкових послідовностей ВІЛ було використано ланцюгову полімеразну реакцію (РСК). Загалом, це були зразки, одержані із крові осіб, інфікованих на ВІЛ-1, узяті при першому встановленні діагнозу ВІЛ. Інші зразки були одержані від осіб з клінчними симптомами СНІД, або із продуктів, наданих АІЮ5 Кезеагсп апа Кеїегепсе Кеадепі
Керозіюгу (Сховищем еталонів та реагентів для досліджень СНІД). Для зразків крові ДНК спочатку одержували 65 шляхом додавання по краплям крові чи інфікованих клітин до лізисного буферу на основі ДСН і інкубування при 652 протягом 30 хвилин. Додавали проназу у концентрації 0О,5мг/мл і лізат продовжували інкубувати при 4590 протягом ночі. Після двох екстракцій фенолом продукт висаджували етанолом і ресуспендували ДНК у воді.
Здійснювали два раунди РСК для усіх зразків ДНК стандартними методами. Праймерні послідовності обирали на основі опублікованої послідовності ВНІО (|Каїпег та ін., Майшге, 313:277-284 (1985)). Для одержання фрагментів, які включають послідовності зі всіх варіабельних ділянок і частину др41, використовували праймери
РСК, як описано у Прикладі 1. Продукти РСК потім піддавали клонуванню шляхом заміщення до вектору рМепм4 за стандартними методами. Секвенування нових плазмід здійснювали з використанням методу Сенгера і праймера ссаїдідіаааанаассссасісідід (ЗЕО ІЮ МО:5).
Одержання ММепу. Нові рекомбінанти вірусу коров'ячої віспи (ММепу) було одержано шляхом трансфекції 7/0 клітин, інфікованих вірусом коров'ячої віспи (МУСОН, АТСС), новими заміщеними рекомбінантними плазмідами (дивись вище). Для сприяння трансфекції використовували препарати Тгапеіесіат (Рготеда) та І ірогесіатіпе (Сірсо, ВК/І) згідно з рекомендаціями виробника. Віруси коров'ячої віспи піддавали очищенню у бляшках.
Імунізації. Лізати ММепу-інфікованих клітин вводили шимпанзе шляхом підшкірних ін'єкцій ММепми використовувались окремо або у комбінаціях. Загальна кількість вірусу коров'ячої віспи у перерахунку на ріи 75 (бляшкоутворюючі одиниці) були близькими для кожної ін'єкції (приблизно 10 "рг), що робилась тваринам. Для внутрішньом'язових ін'єкцій використовувались суміші приблизно 40 мікрограм др120 (номер за каталогом 12101,
ІпігасеІ, Сатбгідде, МА), 20 мікрограм ор4і41 (номер за каталогом 036001, ІпігасеІ) і 500 мікрограм гелю гідроксиду алюмінію (Кепзогріаг АіІштіпит Ппуагохіде Адзогріїме Се, Іпіегдеп Со., Ригспазе, М.Х.) на інокулят.
Імуноферментні твердофазні аналізи (ЕІ ІЗА). П'ять аналізів ЕІ ІЗА було зроьлено таким чином: ЕГІЗА Мо1 - набір для клінічного аналізу ЕГІЗА фірми Арроїї було придбано у Арброїй І арогайюгієев і використано згідно з рекомендаціями виробників (НІМАВ НІМ-1/НІМ-2 (ТОМА) ЕЇїІА, Аррок І арогайгіев, Аброїї Рагк, І.Ї.). ЕПІЗА Мо2:
Аналізи методом ЕГІЗА здійснювали шляхом висівання рекомбінантного Мп-др1бО (Оцаїйу Віоіодісаї, Іпс.,
Сайпегериго, МО) у концентрації імкг/мл. Планшети блокували і аналізи проводили при трикратному послідовному розведенні сироваткою. Планшети потім промивали і підрахунки проводили з використанням с ор; анти-людського дос, кон'югованого з лужною фосфатазою. ЕІ ІЗА Мо3: Планшети для аналізів ЕГІЗА покривали
ГА /ор120 (вуглеводневий дериват білка, СНО-дегімей ргоїеіп, Іпігасе) з концентрацією один мікрограм/мл. і9)
Зразки сироватки висівали після розведення 1:100 і підраховували з використанням анти-людського Ідо1, кон'югованого з лужною фосфатазою (мишачий анти-людський ІдсС1-АР, номер за каталогом 9050-04, ЗошНегп
БіоіодісаІ Авзосіа(езв, Іпс., Віппіпойат, А.Г), і п-нітрофенілфосфатази. Оптичну густину вимірювали при є 40О5нм. ЕГІЗА Мо4: Аналіз ЕГІЗА здійснювали як за методикою МоЗ3, за винятком того, що планшети покривали
ПІВ-др120 (дериват білка бациловірусу, Іпігасеї, номер за каталогом 12001, Сатбгідде, МА) у концентрації -- один мікрограм/мл. ЕГІЗА Моб: Аналіз ЕГІЗА здійснювали як за методикою МоЗ3, за винятком того, що планшети ч- покривали лізатом вірусу 1МВ (Огдапоп Текпіка Со., Юигпат, М.У.) у концентрації один мікрограм/мл.
Аналізи нейтралізації. Аналізи нейтралізації проводили з лабораторними чи первинними ізолятами о |Мопіейогу та ін. У. Сіїп. Місгоріої. 26:231-237 (1988); Мопіейогі та ін. доцгпа! ої Іптесіив -
Оізеазез, 173:60-67 (1996)). Лабораторні ізоляти: Вірус змішували при розведенні 1:20 з кодним зразком сироватки і висівали на планшети на клітини МТ-2 чи СЕМ-Х174. Для оцінки життєздатності клітин використовували фарбування нейтральним червоним. Позитивне відхилення було визначено як зменшення « смертності клітин на 35-4095 порівняно з контрольними культурами. Первинні ізоляти: Вірус змішували при 70 розведенні 1:4 з кожним зразком сироватки і висівали на периферійних моноядерних клітинах крові (РВМО), - с стимульованих фітогемаглютиніном (РНА). Підраховували р24. Позитивним результатом вважалось зменшення ц інфіційності щонайменше на 7595 порівняно з контрольними культурами. "» Результати
Одержання нових рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи ММепу. З метою одержання нових рекомбінантів
Вірусу коров'ячої віспи (ММепу), кожен з яких окремий оболонковий білок ВІЛ-1, спочатку ізолювали ДНК із -І зразків ВІЛ-1. Більшість ДНК було одержано із крові осіб, які не виявляли зовнішніх ознак хвороби, і яким, вірогідно, вперше було поставлено діагноз інфекції ВІЛ-1. Додаткові ДНК було одержано від пацієнтів, хворих о на СНІД, або із вірусів, наданих АІОЗ Кезеагсп апа Кеїегепсе Кеадепі Керозіюгу (Сховищем еталонів та -І реагентів для досліджень СНІД). Здійснювали РСК з використанням пар праймерів, які охоплюють сайти цу рестрикції Крпі і Взті. Після цього проводили заміщення фрагментів у векторі рМепм4, зображеном на Фігурі 5 (рМепм4 спочатку експресував скорочений білок ВІЛ-1, ВНІ0), по сайтам рестрикції Крпі і Веті. У такий спосіб
Кз послідовності др120 (М1-М5) і др41 із ВНІ1О заміщували на відповідні послідовності у продуктах РОК. З кожною із заміщених плазмід готували новий рекомбінантний вірус коров'ячої віспи (ММепу).
Цей метод забезпечує простий засіб, з використанням якого можна впровадити широкий спектр оболонкових послідовностей до унікальних рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи (ММепм). Цікаво, що більшість послідовностей була продуктивною, дозволяючи припустити, що оболонкові послідовності у провірусних геномах
Ф, (із яких було одежано більшість продуктів РСК) рідко були дефектними. Існує величезна різноманітність у ко ММепу, використаних у змішаній вакцині.
Імунізація шимпанзе окремим чи змішаним ММепу. Чотири шимпанзе було використано для тестування бо окремих і змішаних рекомбінантних вакцин вірусу коров'ячої віспи. Схема імунізацій наведена у Таблиці 2.
Перші три ін'єкції містили вірус коров'ячої віспи, а остання ін'єкція містила комбінацію др120, ор41 і гелю гідроксиду алюмінію, при внутрішньом'язовом введенні. Шимпанзе 1 і 2 одержували лише один вірус коров'ячої віспи і відповідний оболонковий білок, які вводили у кожній із перших трьох ін'єкцій. Шимпанзе З і 4 одержували суміш 10 рекомбінантних вірусів віспи (і відповідні оболонкові білки у першій ін'єкції), десять 65 додаткових оболонкових білків у другій ін'єкції, Її 10 додаткових, унікальних оболонкових білків, у останній імунізації що загалом склало 30 окремих векторів перед повторною білковою імунізацією. Всі шимпанзе одержали близькі кількості загального вірусу коров'ячої віспи у перерахунку на бляшкоутворюючі одиниці і близькі кількості загальних рекомбінантних білків. й вне о 6
Рекомбінантні ММепу можуть бути введені без виникнення уражень. Усіх чотирьох шимпанзе контролювали на виявлення ознак системної хвороби і утворення уражень у місці інфекції.
Тварин щоденно аналізували для виявлення проносу, ринореї, кашлю, чихання, прискореного дихання, 20 летаргії, обмеженої рухової здатності і втрати апетиту. Жодна з цих ознак не спостерігалась у жодної із тварин у будь-який час. Фотографії місць ін'єкції, зроблені Через регулярні проміжки часу після першої імунізації вірусом коров'ячої віспи показують помітне напухання для усіх чотирьох тварин. Слабкі вогнища ураження з'являлись у місці ін'єкції для шимпанзе 1 і З, типові для вакцинації віспи, тоді як у шимпанзе 2 і 4 помітних вогнищ ураження не спостерігалось. Ніяких ознак хвороби, напухань чи вогнищ ураження не сч 25 спостерігалось після другої, третьої чи четвертої ін'єкцій у жодної тварини, що свідчить про створення специфічного до вірусу коров'ячої віспи імунітету першим щепленням. о)
Ін'єкції ММепу з послідуючою білковою бустерною імунізацією призводили до вироблення ЕЇ ІЗА-позитивного антитіла. ВІЛ-специфічні антитіла контролювали під час проведення схеми імунізації за допомогою п'яти різних методів імуносорбентного твердофазного аналізу (ЕГІЗА). Аналізи ЕГІЗА використовували для вимірювання с зо відносної, а не абсолютної, кількості антитіл у кожної тварини. У більшості випадків, для тестів використовували вірусні фрагменти, яким бракувало тривимірної і олігомерної структури, типової для нативних -- оболонкових білків. У цих випадках очікується, що ЕП ІЗА буде зв'язувати лише підгрупу ВІЛ-специфічних білків. їм
Результати, одержані для АрБрой ЕГІЗА, зображено на Фігурі 6. Шимпанзе З перевищив порогове значення на позитивність після першої імунізації вірусом коров'ячої віспи, тоді як шимпанзе 4 перевищив порогове значення о 35 після другої імунізації ММепу. Реакції шимпанзе З і 4 наприкінці схеми імунізації значно перевищували їм показники шимпанзе 1 і 2. Для ЕГІБА Мо2 з використанням ММ ор160 сильна реакція спостерігалась лише для шимпанзе 3. Цю реакцію було одержано до проведення повторної білкової імунізації, і бустерна ін'єкція не вплинула на неї. Реакція на СНО-| АЇ, зв'язаний на ЕГІЗА планшетах (ЕІ ІЗА Мо3) з використанням того ж самого антигена, який було використано для повторної імунізації очищеним білком, показала, що лише шимпанзе З мав « 0 сильну реакцію. Для ЕГІБА Мо4 зі зв'язаним на планшеті ПІВ-др120 у шимпанзе 2 спостерігався високий фон і, 2 с можливо, завдяки високому фонові, найвищий показник реакції з усіх тварин. Реакції на п'ятий аналіз ЕГІЗА - вірусний лізат Огдапоп Текпіка ІВ - були позитивними для сироватки від усіх чотирьох тванин. :з» Реакції нейтралізації щодо первинних і лабораторних ізолятів. Аналізи нейтралізації здійснювали з сироваткою, одержаною від кожної тварини, по відношенню до лабораторних і первинних ізолятів. Першій аналіз 45 проводили на лінії Т-клітин, а останній - на сироватка-негативних РНА-стимульованих РВМС. В усіх випадках, -1 ізоляти не співпадали з матеріалами, представленими у вакцинах ВІЛ-1.
Як показано у Таблиці З, зразки від шимпанзе 2, шимпанзе З і шимпанзе 4 мали позитивне відхилення і (35-4095 інгібування росту вірусів) порівняно з ММ лабораторним ізолятом у Т-клітинах. Аналізи з двома іншими -1 лабораторними вірусами (один із ПІВ (осКеу та ін., Аід5 Кев. Нит. Кеїгомігизев, 12:1297-1299 (1996), і 20 другий із 5Е2 матеріалу) не дали позитивних результатів для будь-якого із зразків. Наведено результати - аналізів нейтралізації (Мопіейогі та ін., 1988, вище; Мопіеїйогі та ін., 1996, вище| з чотирма первинними кз ізолятами, проведених з РНА-стимульованими РВМСО. У цих аналізах вірус вважається таким, що важко нейтралізується, оскільки сироватка пацієнтів часто дає негативні результати, навіть при використанні розведення 1:2 |Репуо та ін., АІО5, 10:597-5106 (1996); Мооге апа Но, АІО5, 9:5117-5136 (1995); Мопіейогі та 55 ін., 1996, вище). Цікаво, що сироватка шимпанзе 4 у розведенні 1:44 була здатна нейтралізувати один із тестових первинних ізолятів. Ця ситуація відрізняється від результатів інших досліджень оболонкових вакцин, (Ф) оскільки у більшості попередніх випадків сироватка від імунізованих оболонковими вакцинами осіб давала ко негативні результати при проведенні аналізів нейтралізації первинних ізолятів |Зіееієе, доцгпа! ої МІН
Кезеагсі, 6:40-42 (1994); Мооге, Майшге, 376:115(1995)). бо нини
Лабораторний штем ММ! 000 (Позитивне відхилення |Позитивне відхилення (Позитивне відхилення.
Певжния то 11 07-031-150000100500
Первинний ма 11031011
Первинний ма 01001011 Помити
Первинний мяХ/ 11101101
Змішані ММепм викликає більш високу якість ВІЛ-1-специфічних антитіл, ніж окремий ММепу. Результати
ЕПЗА ії аналізів нейтралізації зведено у Таблиці 4, де вказані шимпанзе, сироватка яких давала найсильнішу реакцію у семи описаних вище тестах. Як можна побачити із таблиці, шимпанзе З і 4 мали позитивні результати /о Загалом у п'яти із семи тестів, тоді як шимпанзе 1 і 2 мали позитивні результати лише у трьох із семи тестів.
Цей результат може відібражати більш високу якість антитіл, викликаних поліоболонковою вакциною порівняно з вакцинами, що містять один оболонковий білок. ' введено один вірус коров'ячої віспи введено змішані віруси коров'ячої віспи дюн йварюу вв 00000000 Шимпанезішимяюєя
МкорієювасвивАМІ 00100010 Шинанея 00010 піверіювАСтИВАХ 000Шимане? 000 тдзрмюсновив мі 00000000 Шитеюея 10000000 (відхилення) (Первинний золят шейтралізація | ДШимпянеяйд сч о
Обговорення
Експерименти, описані у цьому Прикладі, були призначені для тестування безпеки вакцини ВІЛ-1 на основі вірусу коров'ячої віспи та порівняння ефективності праймування оболонковими коктейлями і окремими оболонковими вакцинами. Результати продемонстрували, по-перше, що вірус коров'ячої віспи може бути с використаний як імуноген, не утворюючи при цьому відкритого ушкодження, і по-друге, що оболонковий коктейль «- може викликати дуже широкий спектр ВІЛ-1-специфічної активності.
Модель шимпанзе дозволила нам дослідити безпеку поліоболонкових вакцин на приматах. Зокрема, нам /їч- цікаво було визначити ступінь утворення відкритих ушкоджень, оскільки щеплення вірусу коров'ячої віспи могло с становити загрозу передачи живого вірусу неімунізованим особам. У випадку ВІЛ існує серйозне занепокоєння щодо того, що хворий на СНІД пацієнт може не мати змоги заблокувати інфекцію вірусом коров'ячої віспи. Для - вирішення цієї проблеми ми протестували використання підшкірної вакцинації на шимпанзе з метою вияснити, чи можна уникнути утворення відкритого ушкодження. Дійсно, відкриті ушкодження спостерігались лише у двох з чотирьох шимпанзе. Аналогічні результати спостерігались при використанні матеріалу вірусу коров'ячої віспи «
МУСОН у клінічних випробуваннях підшкірних ін'єкцій вакцини віспи І(Соппог та ін., Уоцгпа! ої Іпгесіоцв5
Рівеазев, 135:167-175 (1977); Вепепзоп та ін., дошгпаї ої ІпТесіоиз Оізеазев, 135:135-144(1977)). - с Імовірно, що при додатковій увазі до процедури ін'єкції та післяпроцедурному спостереженні за місцем ч ін'єкції відкритих ушкоджень можна уникнути в усіх випадках. Ці результати демонструють, що проблеми безпеки -» не повинні перешкоджати використанню вірусу коров'ячої віспи як вектора вакцини ВІЛ-1.
Було проведено тестування оболонкових коктейлей в експериментах на мишах (Приклад 2) та кролях. В експериментах на мишах контролювали анти-ВІЛ антитіла після однієї ін'єкції ММепу, тоді як у кролей ММепу -і було використано для підсилення реакції, створеної вакциною на основі ДНК. Експерименти засвідчили, що сю ВІЛ-1-специфічні антитіла можуть бути створені чи посилені за допомогою УМепу, і що первинні ізоляти можуть бути нейтралізовані реакцією антитіл. Для вивчення потенціалу змішаних ММепму (РоїуЕпу), шимпанзе були -| розділені на дві групи. Перші два шимпанзе одержали лише одну ММепу, тоді як шимпанзе З і 4 одержали -л 20 коктейль, який складався загалом із тридцяти різних ММепу.
Після проведення імунізації вірусом коров'ячої віспи усім чотирьом шимпанзе робили бустерну імунізацію
Ко) сумішшю одного др120/др141 білка з гелем гідроксиду алюмінію. Сироватку від кожного з чотирьох шимпанзе тестували п'ятьма різними аналізами ЕГІЗА, у кожному з яких використовувався інший фрагмент та/або конфігурація оболонкового білка. Цікаво, що обидва шимпанзе 1 і 2 дали сильну реакцію лише в одному з цих аналізів ЕГІЗА, тоді як сироватка від обох шимпанзе З і 4 дала сильну реакцію у 4 таких аналізах. Оскільки о кожен аналіз вимірював лише частину ВІЛ-1 - специфічних антитіл у кожної тварини, ці результати імовірно відібражають значно ширший спектр зв'язуючої активності антитіл, утворених змішаною вакциною. ко Були також зроблені аналізи нейтралізації для лабораторних та первинних ізолятів. Цікаво, що позитивна реакція проти первинного ізоляту спостерігалась у шимпанзе 4, незважаючи на те, що первинний ізолят не був 60 специфічно представлений у вакцинній суміші. Ці результати знов продемонстрували ширший спектр антитіл, створюваних вакциною-коктейлем РоїуЕпу. Можна очікувати, що підвищення антигенної складності вакцини призведе до підвищеної різноманітності лімфоцитів і відповідних реакцій антитіл.
Той факт, що можуть бути утворені нейтралізуючі антитіла проти первинного ізоляту, який не був представлений у вакцині, свідчить, що білкі, які розрізняються за лінійною структурою, мають спільну 65 конформаційну структуру. Це спостереження підтверджується також імунними реакціями пацієнтів, інфікованих
ВІЛ-1, коли будь-які дві особи, що зазнають дії безлічі вірусів, які взаємно виключають один одного, є загалом захищеними від суперінфекції при перехресній експозиції. Використання поліоболонкової вакцини є першою спробою імітувати стан пацієнтів, інфікованих ВІЛ-17, у системі шимпанзе. Тобто, створюються нейтралізуючі антитіла з широким спектром оболонкових білків, а не з одним білком.
Підсумовуючи, ми протестували на моделі шимпанзе вакцину-коктейль ВІЛ-1 на основі вірусу коров'ячої віспи, яку було названо поліоболонковою (РоїуЕпу). Цей приклад продемонстрував: 1) Вірус коров'ячої віспи може бути використаний без утворення відкритих ушкоджень шкіри. 2) ця вакцина дозволяє одержати широкий спектр активності ВІЛ-1-специфічних антитіл; і
З) коктейль комплексів оболонкових білків (РоїуЕпу) забезпечив вищу якість ВІЛ-специфічних антитіл 7/0 Порівняно з окремим комплексом оболонкового білка.
Вірус коров'ячої віспи вже давно відомий як сильна вакцина, як у формі вірусу дикого типу, так і в рекомбінантній формі. Сила вірусу коров'ячої віспи полягає у його здатності активізувати складові імунної реакції, пов'язані як з В-, так і з цитотоксичними Т-лімфоцитами. Вірус коров'ячої віспи є єдиною вакциною, яка була здатна винищити хворобу (віспу) у населення. Дані в цьому Прикладі показують, що рекомбінантні /5 Вектори вірусу коров'ячої віспи зроблять свій внесок до наступної боротьби з ВІЛ-1.
Приклад 4: Одержання біфункціональної плазміди
Було показано, що вакцини ДНК створюють сильні реакції антитіл та СТІ у кількох різних системах (грип,
ВІЛ-1 ї т.Ін.). Вакцини грипу та ВІЛ-1 на основі ДНК вже проходять клінічні випробування на здорових дорослих добровольцях. Вірус коров'ячої віспи також є важливою основою програм вакцинації. До речі, вірус коров'ячої 2о Віспи був єдиною вакциною, яка виявилась здатною викоренити хворобу (віспу) у населення. Численні рекомбінантні віруси коров'ячої віспи викликали захисні імунні реакції, як було продемонстровано на тваринних моделях. Наведені вище дані демонструють ефективність поліоболонкової вакцини і стратегій об'єднання вірусів, наприклад, вакцин ДНК і вірусних вакцин.
Було сконструйовано біфункціональну плазміду, яка може діяти як вакцина ДНК і як рекомбінантний вектор сч ов Вірусної віспи. Фігура 7 зображує карту цієї плазміди, яка включає промотор цитомегаловірусу для експресії у клітинах ссавця, і ранній та пізній промотори коров'ячої віспи для приготування рекомбінантної коров'ячої і) віспи. Пряма ін'єкція очищеної ДНК плазміди може бути використана для створення імунних реакцій проти оболонкового білка ВІЛ у піддослідних суб'єктів. Плазміда може також бути використана для одержання і тестування живих рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи як носіїв імунізації оболонковим білком ВІЛ. с зо Суб'єкти потенційно можуть бути вакциновані за багатоярусною схемою, що включає вакцинацію (вакцинації)
ДНК та імунізацію (імунізації) рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи у будь-якому порядку, одиничними чи -- багатократними ін'єкціями та/або у сполученні з додатковими носіями вакцини. М
Даний винахід не обмежений за обсягом конкретними варіантами втілення, описаними у даній заявці. Дійсно, різні модифікації винаходу на додаток до описаних у цій заявці будуть очевидними кваліфікованим фахівцям у ме) цій галузі із наведеного опису і супровідних фігур. Такі модифікації повинні вважатись такими, що попадають ї- до обсягу прикладеної формули винаходу. Слід розуміти, що всі розміри, вказані в кількості пар основ чи амінокислотних залишків, і всі значення молекулярної ваги чи молекулярної маси, вказані для нуклеїнових кислот чи поліпептидів, є приблизними, і наведені з метою опису.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ « (1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: в с () ЗАЯВНИК: 5 0цде Спііагеп'є Кезеагсії Нозріга! 332 Могій І айдегаае ;» РО Вох 318
Метрпіз, ТМ 38101-0318
Опйеа З(ас(ез ої Атегіса -І ЗАЯВНИКИ/ВИНАХІДНИКИ: Нигмйа, Ушіа ї.
СоіІесіоцдй, Спгізіорпег і Омепз, Капааї! У. -І Біорсод, Кагеп (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: ОДЕРЖАННЯ ТА ВИКОРИСТАННЯ ВІРУСНИХ ВЕКТОРІВ ДЛЯ ВАКЦИН ЗМІШАНИХ - ОБОЛОНКОВИХ БІЛКІВ ПРОТИ ВІРУСУ ІМУНОДЕФІЦИТУ ЛЮДИНИ
Із (її) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 7 (м) АДРЕСА ДЛЯ ЛИСТУВАННЯ: (А) АДРЕСАТ: КГАОВЕК 5 дХАСКБОМ 5Б (В) ВУЛИЦЯ: 411 НАСКЕМЗАСК АМЕМОЕ (С) МІСТО: НАСКЕМЗАСК
Ф) (0) ШТАТ: Му ка (Е) КРАЇНА: О5А (Р) 2Р: 07601 60 (у) ФОРМА, ПРИДАТНА ДЛЯ КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ: (А) ТИП СЕРЕДОВИЩА: Дискета (В) КОМП'ЮТЕР: ІВМ РО-сумісний (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-0О5/М5-БО5 (0) ПРИКЛАДНА ПРОГРАМА: Раїепіп Кеїеазе 241.0, Мегвіоп 21.30 65 (мі) ДАНІ ПРО ЗАЯВКУ НА ТЕПЕРІШНІЙ ЧАС: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: Надання очікується
(В) ДАТА РЕЄСТРАЦІЇ: При цьому (С) КЛАСИФІКАЦІЯ: (мі) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОВІРЕНОГО/АГЕНТА: (А) ІМ'Я: Раші Р. РейпіІпег (В) РЕЄСТРАЦІЙНИЙ НОМЕР: 35135 (С) НОМЕР ДІЛА: 13401011/РСТ (мії) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ЗАСОБИ ЗВ'ЯЗКУ: (А) ТЕЛЕФОН: 201-487-5800 70 (В) ТЕЛЕФАКС: 201-343-1684 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мої (5ЕО ІЮ Я1): () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 27 пар основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (ії) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО я
АССАСААСАС АСТООСААТО АСАСТОА
(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо2 (5ЕО ІЮ я2): () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 30 пар основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна с (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК і) (ії ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО 52
ССАСТСОСАТС САСОСТСАТОТТАТТССАААТ
(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо3 (ЗЕО ІО 23): с зо () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 32 пари основ -- (В) ТИП: нуклеїнова кислота М (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна о (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК ча (ії ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО ЯЗ
СТОООСТСАСА СТСТАТТАТО СОСТАССТОТ ОТ
(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо4 (ЗЕ ІЮ 84): () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: « (А) ДОВЖИНА: 34 пари основ з с (В) ТИП: нуклеїнова кислота
Й (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна а (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (ії ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО я4 -І ССАСАСАТТТ АТТАСТСОСАА СТАССАТТСС ААСО (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо5 (5ЕО ІЮ 25): о () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: -І (А) ДОВЖИНА: 28 пар основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота - (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна
Із (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (ії ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО 855 5Б ССАТОТОТАА ААТТААСССС АСТСТОТО (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Моб (ЗЕО ІО я): (Ф, () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: ка (А) ДОВЖИНА: 26 пар основ (В) ТИП: нуклеїнова кислота 60 (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ії) ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (ії) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО я6:
ТАСААТТТСТ СОСОТОССССТО СТОАСО
(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо7 (ЗЕО ІЮ Я7): 65 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 880 амінокислот
(В) ТИП: амінокислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: обидві (6) ТОПОЛОГІЯ: обидві (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: білок іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО 10 Я: цув біц сіп цуз Тех Маї Аза Меб Аг Маї Був біш бек біп Меї цу 1 5 - 10 15 то уз сіп Нів цеш 7Ір Аху Ттросіу Тер Ага Тур сіу Тіг Меєс цем Гей 70 25 зо сіу бпеч Мес І1є Су5 Бех Аіа ТБж бо15 цу Пец Ттр Маї Тк Уві Тук - 35 40 45
Тук біу Чаї Ртхо Уаї Ттр цуз Січ, Аїа Твх Тк ТВ цей Ре Суз Хі 52 55 ' во т бЗет Авр Аїа цуз Аїа Тух Авр ТІ бі уаї Ніа Ази уаї ТІр Аїа ТІ 55 79 ій 75 во ніз Аїя Суз Чаї Рко ТпПІ Азр Рко Ап оВго біп бі Чаї Маї бей Заї й в5 зо 35
Авпочаї ТЬг сій Ап о Ре Азп о Мес Тхр оБПуз Ав Азр о Мес Уаї біц біп 100 05 110
Мек нів сів Азр Ге І12 Бех Меп Тхр Ар а1іп бех Пец цуз Рхко Суз 115 120 125 чуг1ї цуз Те тех рто Ппезч Суз Уаї бех пе Пув Сув ТПжх Азр Ге Ку се | 130 135 . 140
Азп Авр ТБІ АзпотТву Бех Авп о Азп о Уаї ТБх Зеу Беї бБетг Ттр біу АгЧ о 145 155 155 160
Азп І1е Мет: бі бін сіу біч І16 Пуз Авп о Суз бБеї Ре Аяп І1є бег . 165 170 ї175 с
ТІ бБеї І1є Ах бІ1у Пцуз Уаї бів Муз бів Тут Аза Бе Ре Тук Був 180 195 180 ч-
Тем АБО о Іїв Ії рхго Іч1126 Азр Ццуз б1у Ап Ар бек Ап Абв Тих ТЕ рч- 195 200 205
Бех тТук Був Рпе ТБІ Пес Трх Бекг Суз Дяп Твт Зехд Маї І1є Тих біп і, 210 215 220 че
Аіа Сув РІо цуз Уаї бБеї рРре піц Ффко Ії Рко Іїв Ні Тук Суз А1а 225 230 235 240
Рго А1а біу Рпе Аза І1є Пеп Цуз Сув Азп о АзпоБуз ТвВт о Рпе Аєп б1у: 245 250 255 «
Тит с1іу РрРхко Су ТБІ Азп оУаї бег Твх Маї біп Суз Тву Ніз сіу І1в з 260 265 270 с Ага Рпо Маї Маї Бех Тпх сіп Без цец пемз Азп сбіу Бех цеч А1а б5іч п 275 280 2835 и? - (95) - -й 20
Ко) іме) 60 б5 січ сій Уаї уза) тїіє Ахку бек Аїа Азп Ре ТП Ар оАяп Аза Пує ТЕ 290 295 100 Й
Іїе Ії уаї біп Пейп двп бій бек Уаї 01 Ії Аза Суз ТІ Ага ро т 3а5 З10 315 320
АзпоАвпоАап о ТВт Аха Був Бех ї1є Аху Ії11е йіп Ага біу Ре б1у Аху 325 330 335
Аїа Ріє Уаї Тк І1є іу цПуз Іїє Пец сіу Азп Меїс Агу бій Ала Ніз 340 3245 350
Суз дяп ЇІїє Бех Аг Аін Цузв Тр Азп Ап Тату Пец був біп Ї1ї6 Азр 355 - 360 .385
Бег пу без Аку січ біп Рбе СТУ АБп о Азп о цу твг Іїе Ії Ре цЦуз 370 375 зво біп 5ех бек сіу с1у Ар Рго Сіп І1є Уаї ТБк Ні 5ех Ре Азп о сув за5 390 395 Я 400 сіу б1у сії Рве рве Тук Сув Азв.Зех ТВх Сіп Пец Ре Ахп бек ТцЕ а05 " 410 415 .
Ттр Ре АзпобЗег Твтг Ткр бБег Тітг Цув 01у бек Ап Азп тах бі біу 420 і 425 430
Бег Авзр ТНК І1е Трг рем Рго Суз Агу Ії Пуз біп І16 І1« А5п Мес 415 440 445
Тур сіп сі Уаї зіу цуз А1а Мек Тух діа Рто Рго Ї16 б5ег с01у сів «50 455 4бо
І1ї6 Ах Су: Бек Бет Лев І16 ТБх зЗ1у Пем Грей пе) ТБх Ах Азо біу с 465 ато 75 4во о сіу Аїа Азл Сі АзпоАзп бій бех сі І1е Ре АкФ Рхо п1у біу біу 485 а4зо 435
Ар Мет Ач дз АвзпотТгр о АгЯ бак січ рес Тут Був Тук цув Уаї Ууаї 500 5а5 510 Га цув І16є 010 Рго цец біу Маї Аїа рто Тнх Муз Аіа цуз Ахч Атгу Маї 515 520 й 525 ! «-
Уаї іп Ах Січ цу Акту Аїа Маї сбіу сій ІЗе б1у А1а їні Ре СПец че 539 . 515 «аб сСЬу Ре Ппеч Сіу Аза Ала біу Зеї ТІ Меб біу Аїа А1а Бетг Мес Ти: о з45 БО 555 5вО в.
Пец Тих Маї біп А1іаз АхаЯ Сіп печ пе б5Зекг с1іу І1-е Уаї бій біп сій ев 576 5175
Ап Азп ойей Газ Аха Аза її біч А1іа бій Сіп Ніз Мей пев біз Беч 580 585 590 «
Тих Маї ТЕр с1іу Іїє пцуз бід бе біп Аза АгЯч Ії йцеч Аїа Уаї сії в 595 во 605 ' с Ах Тут цем Су Азр бій біп Пе без біу Ї1є Ттр 21у Суз Бех біу "з 619 615 520 п цув реч Іїє Суб ТБх ТНК Аід Маї Рхо Тер Азп о Аїа 5ех ТгтР Бек Ап 525 Ії 630 635 640
І
- (95) - шк 20
Ко) іме) 60 б5 цуз бег печ бі Сіп Іїе Тптр Аз, АзпоМеє Тве Ткр Меє січ Тгр Аер в4і5 65 655
Ату січ ІЗТе Абп Аяд Тут Тптг Бек їец І1е Ніч Бег Пец І1є біч січ 6во 665 вто
Бех сів Аза бій піп бій Ббуз Ап о біц бій бій рез Пем бій Гео Азр 615 во . ва5 пуз Ттр Аїа бек Пеш Ттр Азп о Ттр Ре АзпоІ1е Тк Аа Тер бен Тер 6290 695 таб 70 Тух Іїє Пуз беч гле І1є Мес І1іе уаї біу біу цен уаї сіу вч Ага 7а5 710 -. 715 : 720
Іїе чаї тре діа Уаї Пеш Бех Маї Чаї Авп Агч Маї Ахд сіп біу Тут 725 730 735
Бек ро Пцеч бех Рке біп Тег Нів Пец рРко Із рго Аху біу Рко Алр
ІЙ 740 745 - 780
Ак рта біз біу Її 911 сь бів. сіу б1іу біз Ат Азр АкчЧ Ар Аху 755 760 765 -
Бек т1е АкчЧ Пам Маї Ап осіу Бек пед А14 цей Ії ТІр Азр Авзр Гей тто ЕН т78о
Ат Зет пе Суз Пан Ре Бех Тух Ніз Аку Пец АкЯ дяв Печ Печ пей таб й 790 795 во
І1е Маї тп АтУу Ії У2ї біц цеч пцеч з1у АкФ АкЯд біу Тіз Зі Аза 805 810 815
Без Ппуз Тут ттр Ттр Азп Пец пемх біп Тук ТІр бек біп 011 Пе Був 829 в25 8зза Ге!
Ап обЗах Аїа чаї Бех пес Бей Азп Аза ТВ Аза ї16 Аїа Маі Аїа сій Ге) 835 . 840 845 сбіу тт Авзо Ага Маї Ії піч УМаї Уаї сіп сіу А1їа тут Агу Аіа І16 850 а55 во
Вгз Ніз І1їв Рто АкФЧ Ах 16 Ах бід біу це) 41 Агу Іїее Без їеч с 865 т ато 7 875 80 - ча
В опису процитовані різні публікації, які цілюом включено сюди за посиланням.
Список літератури ме) 1. А!йвиреї еї аї., еаз, Сипепі Ргоїосоіїв іп Моіесціаг Віоіоду, Сгеепе Рибіїзпіпд Аввос., Мем Могк, МУ ї- (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995). 2. Амегуз Югид Тгеайтепі: Ргіпсіріев апа Ругасіїсе ої Сіїпісаї РІПагптасоіоду апа ТНегарецпсв, ТНіга
Едіп, АСІЗ Ргезз, І ТО., ММШіатвг апа У/їкіпз, Вакітоге, МО (1987).
З. Веївпе. К.В. еї аї., У. Ат. Мед. Авзос. 272:431-431 (1994). «
З. Вегкому еї аі., едз., Тпе Мегск Мапиаї, Гійеепій Едіоп, МегскК апа Со., Капмжау. М (1987). з с 4. Вігпроїт, Н.С. апа Бо/у, 9., Мисівїіс Асіаз Кев. 7:1513-1523 (1979). . 5. ВискК, С, апа Рашіпо. М.5., ейвз., Атегісап Туре Сийиге СоМеаіоп Са(аіодце ої Апіта! Мігивев апа и?» Апіізега. Спіатуаїйає апа КісКеазіаеє, бій Еа., Атегісап Туре Сийиге СоїПесіоп, КоскміПе. МО (1990). 6. Вигпв, О.Р.МУ. апа Оезговіегв, К.С., Сиг. Торісв Місгобіо!. Іттипої. 188:115-219 (1994). 7. Спакгавапі. 5. еї а!., Мої. СеїІ. Віої. 5:3403-3409 (1985). -І 8. Соопеу еї аї., Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА 90:1882-1886 (1993). 9. Стеідпіоп. Т.Е., Ргоїеіпев: Бігисіцге апа Моіесціаг Ргорегііез, МУ.Н. Егеетап 5. Со., Зап Егапсізсо, СА (1983). і 10. ОеМйа г, М.Т. еї аїЇ, АБ, ЕКоіоду, Оіадповіз, Тгеайтепі ап Ркгемепіп, Зга еайіоп, 4.8. -І Прріпсок Со., Рпйадеїрніа, РА (1992). 11. б'Нопсені, Массіпе 10 Зиррі.:548-52 (1992). - 12. БогогупекКі апа Апдегзоп, Зсіепсе 252:501-502 (1991).
Ге 12. Евбаді, Рпаптасоїоду, ГГ іШе, Вгожм/п апа Со., Вовіоп. МА (1985). 13. Еіспрего, Іпі. Сопі. АІЮ5 7:88 (1991). 14. Етрбгеївоп, У.аед., Майшге 362:359-362 (1993). 15. Епаті еї аї., У. Мігої. 65:2711-2713 (1991). 16. Епаті ейа!., Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 57:3802-3805 (1990).
Ф) 17. Еашсі, Зсіепсе 264:1072-1073 (1994). ка 18. Сосдтап еї аї., едв., боодтап апа Сіїтапз Те РІаптасоїіодіса! Вавзіз ої Тпегареціїсв, Еідпій Еадйоп,
Регдатоп Ргезв, Іпс., ЕІтвіога, МУ (1990) Согзе, АІЮБ5 Кев. Нит. Кеїгоміг. 10 (Зиррі. 2): 141-143 (1994). во 19. сгірвком апа Вигдезз, Мід. Асідз Кев. 14:6745 (1986). 20. Сгтапат еї аї., 9. Іптесі. Оів. 166:244-252 (1992); 9. Іптесі. Рів. 167:533-537 (1993). 21. Сгипамард-Веагсі еї аї., У. Сапсег Кез. Сііп. Опсої. 117:561-567 (1991)/ 22. НаПепбегодег еї а!., Мігоїоду 795:510-514 (1993). 23. Нау, К., еї аї., еавз., Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп Сафаірдце ої СеїЇ Гіпез апа Нубгідотав, 7 65 Е4Я., Атегісап Туре Сийшге СоПесійоп, КоскміПе. МО (1992). 24. Нігвсп. М.5., апа Ситап. У. "Нитап іттиподеїйсіепсу умігивез, Біоїоду апа тедіса! азресів" іп
МігоІоду, Ріеідз апа Кпіре, едз., Камеп Ргезв, Ца., Мем Могк, МУ (1990), рр.1545-1570. 25. Ни еї аї., Машге 328:721-723 (1987). 26. Ізп-Ногомиісг, О. апа Вигке, 9.Р., Мисівіс Асіаз Кез. 9:2989-2998 (1981). 27. о еї аї., У). Міго!. 65:5491-5498 (1991). 28. Мо еї аі., Сапсег Кев. 50:6915-6918 (1990). 29. даманегіап. К. ейа!., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. (ОА) 56:6768-6772 (1989). 29. Каї2ипа, ед., Вавіс апа Сіїпіса! Рпагтасоїіоду, БІК Едікоп, Арріеюп апа І апде, Могмаїк, СТ (1992).
ЗО. Кеегег еї аіІ., АІО5 Кез. Нит. Кеїгоміг.10 (Зи,ррі. 2):5139-143 (1994). 70 31. Кіепу еї аї., Іпі. Сопі. АІО5 5:5Л1 (1989). 32. КіїраїгіскК еї а/!., У. Віої. Спет. 262:116-121(1987). 33. І пуЦез еї а!., Сеї! 59:1107-1113 (1989). 34. Маскей, М. еї а!., Ргос. Май). Асад. 5сі. (ОБА) 79:7415-7419 (1982). 35. Маг7ага, О.Р. еї аі., Меййодз іп Епг. 277:557-581 (1993). 36. МеЕЇїгайй еї аї., 9. Іптесі. Оів.. 169:41-47 (1994). 37. Меедіетап апа Уу/шпзсй, 9. Мої. Вісі. 48:443 (1970). 38. Озої, А., ед., Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса!| Зсіепсез, Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп, РА (1980), рр.1324-1341. 39. Рапісаїї, О., апа Расіеці, Е., Ргос. Маї). Асад. 5сі. (ОА) 79:4927-4931 (1982). 40. Рапіаео, 0. еї аі., Майте 362:355-358 (1993). 41. Квіт, .5. еї аї., Іпі. У. Сапсег 15:23-29 (1975). 42. Кісптап, АІОз Кев. Нит. Кеїгомігизез 8: 1065-1071 (1992). 43. Кісптап , Аппи Кем РІіагтасої! Топсо 33: 149-164 (1993). 44. Кісптап, Апіітісгтор Адепів Спетоїпег 37: 1207-1213 (1993). 45. Кісптап , АІОз Кев. Нит. Кеїгомігизез 10: 901 (1994). с 46. Кісптопа апа МекКіппеу. ейдв. Віозаїегу іп тісгоріоіодісаї апа бБіотедіса! Іарогайогіев. Зга Еайоп.
О.58. Оері. ої Неацй «5 Нитап 5егмісевз. Мазпіпдіоп ОС (1993). о 47. затргооК, .). ей аЇ., МоїІесшіаг Сопіпд. А Іарогаюгу Мапиаі), Зесопа Еайоп, Сої4 Зргіпд Нагрог
І арогаюгу Ргезв, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ (1989). 48. Зспці2. О.Е. еї а!., Ргіпсіріевз ої Ргоїеіп Бігисішге, Зргіпдег-Мегіад, Мем Могк, МУ (1978). Га 49. Зспмжмапл апа Баупоїйї, еаз., АЙШаз ої Ргоївіп Зедцепсе апа бігисіцге, Майопа! Віотеадіса! Кезеагсп
Еошмпааїйоп, (Муазпіпдіоп. ОС 7?-м/р)| (1979). рр.353-358. - 50. Зеіепка еї аї., Агсй. Нуд. ВакКегіої. 153:244-253 (1969). ї- 51. тій апа УУагегтап, Аду. Аррі. Май. 2:482 (1981). 52. егагсісн еї а!., СеїІ 45:631 (1986). о 53. Том/ріп, Н. еїг аі!., Ргос. Май). Асад. Ба. (О5А) 76:4350 (1979). че 54. Опіей 5(агез Віоспетісаі, Зедцепазе Мегвіоп 2.0 - ОМА Зедцепсіпд Кії, Міпій Едйоп, Атегейат І їе
Зсіепсе, Іпс., Воїзе, Ідано (1994). 55. Меїг еїг аі., Ргос. Маї). Асад. за. 0.5.А. 79:1210-1214 (1982)/ 56. УУеїЇїз еї аї., У. Іттипої. 99:1134-9 (1967). « 57. Муопд-Зіаваі. Б. "Нитап іттиподеїййсієпсу мігизев ап (Пеїг геріїсайоп", іп Мігооду, Бієїд5 апа Щщйщеу с Кпіре. едв., Камеп Ргезв. Ца., Мем Могк, ММ (1990), рр.1529-1543. й 58. М/гіп еї аї., У. Асадціг. Іттипе Оеїїс. Зупаг. 7:211-219 (1994). «» 59. Ми еї а!., Ргод. Мисі. Ада. Кев. Моїес. Віої. 27:101-141 (1978). 60. 7адигу еї аІ., Майге552:728-731 (1988).

Claims (17)

  1. Формула винаходу (95) -І 1. Поліоболонкова вірусна вакцина, що містить, як мінімум, від 4 до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів, кожний з яких експресує певний варіант білка оболонки (епу) вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), - причому варіант містить як варіабельні, так і константні ділянки білка оболонки ВІЛ, і дана вакцина здатна Із викликати у ссавця принаймні одну клітинну або гуморальну імунну реакцію на штам ВІЛ.
  2. 2. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що містить принаймні від приблизно 10 до приблизно 100 різних рекомбінантних вірусів, що експресують певний варіант оболонки ВІЛ. 5Б З.
  3. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що рекомбінантні віруси вибираються з групи, що складається із вірусу коров'ячої віспи, аденовірусу та аденоасоційованого вірусу (ААВ). (Ф)
  4. 4. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що певний варіант білка оболонки ВІЛ ка включає др120 та частину др41, достатню для забезпечення олігомеризації оболонкових білків.
  5. 5. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.4, яка відрізняється тим, що нуклеотидний певний варіант оболонки 60 ВІЛ кодується полінуклеотидом, що включає рестрикційний Крпі-Взті фрагмент.
  6. 6. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що певний варіант білка оболонки ВІЛ належить вірусу, одержаному від хворих, інфікованих вірусом імунного дефіциту людини (ВІЛ) із географічно обмеженої ділянки або варіантами ВІЛ.
  7. 7. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що вакцина додатково містить варіанти 65 білків оболонки ВІЛ, експресованих рекомбінантними вірусами.
  8. 8. Поліоболонкова вірусна вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що поліоболонкова вакцина додатково містить принаймні один фармацевтично прийнятний носій, ад'ювант та противірусну хіміотерапевтичну сполуку.
  9. 9. Спосіб викликання гуморальної або клітинної імунної реакції або обох на вірус імунодефіциту людини (ВІЛ) у ссавця, який включає введення ссавцю вакцини в ефективній кількості, який відрізняється тим, що як вакцину використовують поліоболонкову вірусну вакцину за одним з пп. 1 - 8.
  10. 10. Спосіб за п.9, який відрізняється тим, що, якщо рекомбінантним вірусом є вірус коров'ячої віспи, поліоболонкова вірусна вакцина вводиться підшкірно.
  11. 11. Спосіб за п.9, який відрізняється тим , що використовують дві поліоболонкові вірусні вакцини за будь-яким з пп. 1 - 8, у яких рекомбінантні віруси є вірусами різних типів. 70
  12. 12. Спосіб за п.9, який відрізняється тим, що додатково включає праймування або посилення гуморальної або клітинної імунної реакції чи обох шляхом (і) введення ефективної кількості принаймні одного рекомбінантного білка оболонки ВІЛ або (ії) ефективної кількості принаймні одного вектора ДНК, що забезпечує експресію рекомбінантного білка оболонки ВІЛ (ії) або обох, причому вектор ДНК може бути введений перед, після або одночасно з рекомбінантним білком оболонки ВІЛ.
  13. 13. Спосіб за п.12, який відрізняється тим, що рекомбінантний білок оболонки ВІЛ перед введенням змішують з ад'ювантом.
  14. 14. Спосіб за п.12, який відрізняється тим , що рекомбінантний білок оболонки ВІЛ вводять внутрішньом'язово.
  15. 15. Спосіб за п.12, який відрізняється тим, що рекомбінантний білок оболонки ВІЛ змішують з ад'ювантом або Вводять внутрішньом'язово.
  16. 16. Спосіб за п.12, який відрізняється тим, що вектор ДНК вводять за допомогою методики "вистрілювання генів".
  17. 17. Біфункціональна плазміда, що використовується для одержання рекомбінантних вірусів, які входять до складу вакцини за п.1ї7, що включає ксеногенний ген, який кодує варіант білка оболонки ВІЛ, що містить як сч варіабельні, так і константні ділянки вказаного білка, причому даний ген знаходиться під контролем регулюючих експресію послідовностей двох типів, а саме, послідовності передраннього промотора цитомегаловірусу, і) послідовності раннього промотора вірусу коров'ячої віспи та/або пізнього промотора вірусу коров'ячої віспи. с «- у (зе) і -
    - . и? -і (95) -і - 70 Ко) іме) 60 б5
UA98084523A 1996-01-23 1997-01-23 Multi-envelope vaccines against hiv, method for generating cellular and/or humoral immune response against hiv in mammals, bifunctional plasmid used for producing recombinant viruses comprising anti-hiv vaccine UA73712C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/590,288 US5741492A (en) 1996-01-23 1996-01-23 Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
PCT/US1997/000669 WO1997027311A1 (en) 1996-01-23 1997-01-23 Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA73712C2 true UA73712C2 (en) 2005-09-15

Family

ID=24361647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA98084523A UA73712C2 (en) 1996-01-23 1997-01-23 Multi-envelope vaccines against hiv, method for generating cellular and/or humoral immune response against hiv in mammals, bifunctional plasmid used for producing recombinant viruses comprising anti-hiv vaccine

Country Status (29)

Country Link
US (3) US5741492A (uk)
EP (2) EP0876498B1 (uk)
JP (2) JP2000504326A (uk)
KR (1) KR100571479B1 (uk)
CN (1) CN1229501C (uk)
AP (1) AP1200A (uk)
AT (1) ATE278790T1 (uk)
AU (1) AU709174B2 (uk)
BG (1) BG64711B1 (uk)
BR (1) BR9707611A (uk)
CA (1) CA2243570C (uk)
CZ (1) CZ296575B6 (uk)
DE (1) DE69731075T2 (uk)
DK (1) DK0876498T3 (uk)
EA (1) EA002390B1 (uk)
ES (1) ES2230596T3 (uk)
GE (1) GEP20032902B (uk)
HK (1) HK1016218A1 (uk)
HU (2) HU0402182D0 (uk)
IL (2) IL156919A0 (uk)
NO (1) NO322261B1 (uk)
NZ (1) NZ331024A (uk)
OA (1) OA10814A (uk)
PL (1) PL188641B1 (uk)
PT (1) PT876498E (uk)
RO (1) RO120268B1 (uk)
TR (1) TR199801418T2 (uk)
UA (1) UA73712C2 (uk)
WO (1) WO1997027311A1 (uk)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
US6919318B1 (en) * 1998-04-22 2005-07-19 Chiron Corporation Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine
WO1999061049A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University Of Massachusetts Medical Center Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids
US6562800B1 (en) * 1998-10-30 2003-05-13 University Of Southern California Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
JP2002538770A (ja) * 1998-11-10 2002-11-19 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ウイルスベクターとその製造及び投与の方法
WO2000039303A2 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Modified hiv env polypeptides
AU2487300A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1141313A2 (en) * 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
WO2000044410A2 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Stichting Biomedical Primate Research Centre Composition and method for obtaining specific immunisation against one or more antigens using different recombinant vectors
DE19907485B4 (de) * 1999-02-12 2008-01-17 Strathmann Ag & Co. Virus-Vakzine
US6420545B1 (en) * 1999-05-24 2002-07-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics
AU3793701A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Orchid Biosciences, Inc. Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
WO2001092470A2 (en) 2000-03-02 2001-12-06 Emory University Dna expression vectors and methods of use
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
EP1311278A4 (en) * 2000-08-07 2005-01-05 Sloan Kettering Institutefor C METHOD AND IMMUNIZATION COMPOSITION USING MIXED POOLS OF NUCLEIC ACIDS OR MUTED PEPTIDES
DE60239317D1 (de) * 2001-01-12 2011-04-14 Novartis Vaccines & Diagnostic Nukleinsäure mukosale immunisierung
AU2002252199B2 (en) * 2001-03-08 2008-01-03 Emory University MVA expressing modified HIV envelope, GAG, and POL genes
AU2002320314A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2292772A1 (en) * 2001-07-05 2011-03-09 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. HIV vaccination with a DNA encoding a HIV polypeptide and a HIV polypeptide
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003020876A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
US20070269456A1 (en) * 2001-11-05 2007-11-22 Lasher Alfred W DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
EP1450854A2 (en) 2001-11-30 2004-09-01 Isis Innovation Limited Vaccine
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
US20040106566A1 (en) * 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
EP2316479B8 (en) * 2002-07-18 2015-03-18 University of Washington Pharmaceutical compositions comprising immunologically active herpes simplex virus (HSV) protein fragments
CA2505583C (en) * 2002-12-03 2014-07-15 University Of Massachusetts Polyvalent, primary hiv-1 glycoprotein dna vaccines and vaccination methods
JP2006528244A (ja) 2003-05-12 2006-12-14 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド Ｆｉｖ感染予防接種のための材料と方法
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
US8076060B2 (en) * 2003-08-04 2011-12-13 Emil William Chynn Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma
EP2055316A1 (en) * 2003-09-09 2009-05-06 VIRxSYS Corporation Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV in humans
EP1675613B1 (en) 2003-09-15 2012-05-23 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Hiv vaccines based on env of multiple clades of hiv
US20070166784A1 (en) * 2003-09-15 2007-07-19 Barnett Susan W Combination approaches for generating immune responses
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
US7342107B2 (en) * 2004-05-27 2008-03-11 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
AU2005274948B2 (en) * 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
US20080085261A1 (en) * 2004-10-19 2008-04-10 Haynes Barton F Vaccine Adjuvant
EP2266602A3 (en) 2004-11-01 2011-08-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination approaches for generating immune responses
AU2005316476A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
US20100098721A1 (en) * 2006-10-18 2010-04-22 St. Jude Children's Reseach Hospital Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2012070974A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения
CA2826286C (en) * 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
AP2013007166A0 (en) 2011-04-06 2013-10-31 Univ Paris Descartes Inst De Rech Pour Le Dev Ird Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an HIV disease in humans
JP2014533290A (ja) 2011-11-14 2014-12-11 ノバルティス アーゲー ポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとの免疫原性複合体ならびにその製造法および使用法
WO2013126622A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for displaying polypeptides and uses thereof
LT3390430T (lt) * 2015-12-15 2019-11-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Žmogaus imunodeficito antigenai, vektoriai, kompozicijos ir jų panaudojimo būdai
CN113874078A (zh) 2019-04-05 2021-12-31 Tauc3生物制品有限公司 抗tauc3抗体及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198214A (en) * 1983-08-31 1993-03-30 Stolle Research & Development Corporation Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof
GR862412B (en) * 1985-09-25 1987-01-23 Oncogen Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome
EP0243029A1 (en) * 1986-04-08 1987-10-28 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US5081226A (en) * 1986-12-30 1992-01-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
EP0469089B1 (en) * 1989-04-18 1997-11-19 Applied Biotechnology, Inc. Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination
EP1156102A1 (en) * 1991-06-14 2001-11-21 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
DE69536091D1 (de) * 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro

Also Published As

Publication number Publication date
KR100571479B1 (ko) 2007-06-07
PL188641B1 (pl) 2005-03-31
IL125497A (en) 2007-07-04
CA2243570A1 (en) 1997-07-31
EA002390B1 (ru) 2002-04-25
GEP20032902B (en) 2003-02-25
HUP9900389A2 (hu) 1999-06-28
BG102712A (en) 1999-04-30
WO1997027311A1 (en) 1997-07-31
CZ229398A3 (cs) 1998-12-16
NO983377L (no) 1998-09-23
AU709174B2 (en) 1999-08-26
RO120268B1 (ro) 2005-11-30
OA10814A (en) 2003-01-28
EP1378516A1 (en) 2004-01-07
HK1016218A1 (en) 1999-10-29
DE69731075D1 (de) 2004-11-11
EP0876498A1 (en) 1998-11-11
US6086891A (en) 2000-07-11
NO322261B1 (no) 2006-09-04
ES2230596T3 (es) 2005-05-01
AP9801325A0 (en) 1998-09-30
KR19990081931A (ko) 1999-11-15
EA199800638A1 (ru) 1999-02-25
HU224344B1 (hu) 2005-08-29
NO983377D0 (no) 1998-07-22
US5741492A (en) 1998-04-21
HU0402182D0 (en) 2004-12-28
BR9707611A (pt) 1999-07-27
CA2243570C (en) 2001-08-14
ATE278790T1 (de) 2004-10-15
CN1229501C (zh) 2005-11-30
PT876498E (pt) 2005-02-28
IL156919A0 (en) 2004-02-08
CN1214083A (zh) 1999-04-14
CZ296575B6 (cs) 2006-04-12
US5846546A (en) 1998-12-08
AP1200A (en) 2003-08-29
JP2007259870A (ja) 2007-10-11
JP2000504326A (ja) 2000-04-11
DE69731075T2 (de) 2006-03-09
PL328193A1 (en) 1999-01-18
DK0876498T3 (da) 2005-02-07
TR199801418T2 (xx) 1998-10-21
NZ331024A (en) 2000-02-28
AU1829997A (en) 1997-08-20
BG64711B1 (bg) 2005-12-30
EP0876498B1 (en) 2004-10-06
IL125497A0 (en) 1999-03-12
HUP9900389A3 (en) 2001-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA73712C2 (en) Multi-envelope vaccines against hiv, method for generating cellular and/or humoral immune response against hiv in mammals, bifunctional plasmid used for producing recombinant viruses comprising anti-hiv vaccine
Barouch et al. Reduction of simian-human immunodeficiency virus 89.6 P viremia in rhesus monkeys by recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccination
Ramírez et al. Attenuated modified vaccinia virus Ankara can be used as an immunizing agent under conditions of preexisting immunity to the vector
EP0758396B1 (en) Feline immunodeficiency virus vaccine
Willems et al. The YXXL signalling motifs of the bovine leukemia virus transmembrane protein are required for in vivo infection and maintenance of high viral loads
WO1997027311A9 (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv
Lévy et al. Lentiviral vectors displaying modified measles virus gp overcome pre-existing immunity in in vivo-like transduction of human T and B cells
EP2631290A1 (en) Virus vector for prime/boost vaccines, which comprises vaccinia virus vector and sendai virus vector
CA2110489A1 (en) Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
Hu et al. Protection of macaques against simian AIDS by immunization with a recombinant vaccinia virus expressing the envelope glycoproteins of simian type D retrovirus.
JP2022539417A (ja) Ｈｉｖ抗原及びｍｈｃ複合体
Hasenkrug et al. Immunoprotective determinants in friend murine leukemia virus envelope protein
Isshiki et al. Effects of different promoters on the virulence and immunogenicity of a HIV-1 Env-expressing recombinant vaccinia vaccine
EP1073461B1 (en) Viral chimeras comprised of caev and hiv-1 genetic elements
EP0997529B1 (en) Feline immunodeficiency virus strain FIV-141 and uses thereof
JP2002501369A (ja) Ｆｉｖワクチン
Neumann et al. Retroviral vectors for vaccine development: induction of HIV-1-specific humoral and cellular immune responses in rhesus macaques using a novel MLV (HIV-1) pseudotype vector
Izumi et al. Intravenous Inoculation of Replication-DeficientRecombinant Vaccinia Virus DIs Expressing Simian ImmunodeficiencyVirus Gag Controls Highly Pathogenic Simian-HumanImmunodeficiency Virus inMonkeys
US6723558B1 (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
WO2013126469A1 (en) Chimeric dna vaccine compositions and methods of use
Chunming et al. Combined immunity of DNA vector and recombinant vaccinia virus expressing Gag proteins of equine infectious anemia virus
Yuen et al. Changes in the N-and C-terminal sequences of the murine R7 Gag-tMos protein affect brain lesion induction
MXPA00010701A (es) Quimeras virales comprendidas por elementos geneticos de hiv-1 y caev