PL188641B1 - Szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv,zastosowanie szczepionki polienv,zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, plazmid bifunkcjonalny. - Google Patents

Szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv,zastosowanie szczepionki polienv,zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, plazmid bifunkcjonalny.

Info

Publication number
PL188641B1
PL188641B1 PL97328193A PL32819397A PL188641B1 PL 188641 B1 PL188641 B1 PL 188641B1 PL 97328193 A PL97328193 A PL 97328193A PL 32819397 A PL32819397 A PL 32819397A PL 188641 B1 PL188641 B1 PL 188641B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hiv
virus
vaccine
recombinant
env
Prior art date
Application number
PL97328193A
Other languages
English (en)
Other versions
PL328193A1 (en
Inventor
Julia Hurwitz
Christopher Coleclough
Randall Owens
Karen Slobod
Original Assignee
St Jude Childrens Res Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Jude Childrens Res Hospital filed Critical St Jude Childrens Res Hospital
Publication of PL328193A1 publication Critical patent/PL328193A1/xx
Publication of PL188641B1 publication Critical patent/PL188641B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Szczepionka polienv przeciwko HIV, znamienna tym, ze obejmuje od przynajmniej 4 do okolo zastosowanie szczepionki polienv, zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego bialka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresje rekombinowanego bialka env HIV, plazmid bifunkcjonalny PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv, zastosowanie szczepionki polienv, zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HlV, plazmid bifunkcjonalny.
Szczepionki są przydatne do szczepienia zwierząt, a także ludzi, w celu zapewnienia zwiększonej komórkowej i/lub humoralnej reakcji na zakażenie HIV.
Wirus AIDS do roku 2000 prawdopodobnie pochłonie dziesiątki milionów istnień, stanowiąc światowy problem zdrowotny o najwyższym priorytecie (patrz, DeVita i in., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, wyd. 3, JB Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, Virology, str. 1529-1543; Hirsch i in., Virology, str. 1545-1570). Opracowanie skutecznej szczepionki przeciwko HIV stawia przed immunologami konkretne wyzwanie, ponieważ enzym, odwrotna transkryptaza, związany z replikacja HIV wykazuje wysoki odsetek błędów. Powoduje to, że wiele zmutowanych szczepów HIV posiada białka pokrycia zewnętrznego albo otoczki o odmiennych sekwencjach białkowych. Te odmienne białka otoczki są często rozpoznawane przez układ odpornościowy ssaka jako różne białka, co po4
188 641 woduje ponad 10 nowych limfocytów dziennie, tylko w celu zliczenia obcych antygenów. Limfocyty B i T stanowią, odpowiednio, składnik humoralny i komórkowy reakcji odpornościowej.
Dobry przykład ilościowej siły takiej reakcji odpornościowej wykazano na pacjentach zakażonych HTV i makakach zakażonych SIV. W każdym wypadku występowały kolejne rundy zakażenia, odporności i ustalenia się odmian HIV albo SIV (Wrin i in., J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 7:211-219 (1994); Burns i Desrosiers, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1818:185-219 (1994)). W każdym cyklu zwiększa się różnorodność determinant antygenowych HIV (i towarzyszących reakcji odpornościowych), w taki sposób, że reakcje odpornościowe neutralizują szeroki zakres odmian SIV albo HIV i nadkażenie jest hamowane w znacznym stopniu.
Jednakże, pacjenci z AIDS rozwijają osłabioną reakcję odpornościową, która staje się niedostateczna by zapobiec przed przezwyciężeniem układu odpornościowego zakażeniem HIV. Może to być po części spowodowane pojawieniem się odmian HIV, których odmienne białka otoczki nie są rozpoznawane przez układ odpornościowy pacjenta i w ten sposób unikają zniszczenia (Sci. Amer. Sierpień 1995). W takim przypadku, nawet jeżeli reakcja odpornościowa jest zdolna do zapobieżenia zakażeniu de novo (np. przetrwała mutacja wirusa w uprzywilejowanych, wydzielonych miejscach) zakażenie HiV może w końcu przełamać reakcję odpornościową pacjenta (Pantaleo i in., Nature 362:355-358 (1993); Embretson i in., Nature 362:359-362 (1993)).
Identyfikacja determinant antygenowych dla limfocytów B i T wśród białek HIV pozostaje niekompletna. Białko otoczki HIV zostało scharakteryzowane jako obejmujące regiony zmienne (V1-V5) i stałe (C1-C5). Peptyd stanowiący region V3 określono jako główną determinantę neutralizującą (PND) (Javaherian i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6768-6772 (1989)), jednakże inne regiony białka otoczki mogą być również związane z wywoływaniem reakcji odpornościowej. Białko otoczki pełnej długości HIV zawiera od około 850 do 900 aminokwasów, przy czym różnice w długości są spowodowane hipermutacją (Starcich i in., Cell 45:639(1986)).
Pierwsze szczepionki przeciwko HIV badane klinicznie zostały zaprojektowane w sposób prezentujący układowi odpornościowemu pojedyncze białko otoczki albo jego część. Jednakże, reakcje neutralizujące przeciwko pojedynczym albo nielicznym białkom otoczki nie rozpoznawały innych izolatów HIV, zaś osobnicy nie byli chronieni przed zakażeniem (Belshe i in., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994); patent USA nr 5,169,763; publikacja pCt WO 87/06262; Zaguiy i in., Nature 332:728-731 (1988); Kieny i in., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989); Eichberg, Int. Conf. aIDs 7:88 (1991); Cooney i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993); Graham i in., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993); Keefer i in., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (supl. 2):S139-143 (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (supl. 2): 141-143 (1994); McElrath i in., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994); Fauci, Science 264; 1072-1073 (1994)).
Podsumowując, istnieje silna potrzeba opracowania szczepionek i sposobów, które wywołają reakcję odpornościową odpowiednią do leczenia i zapobiegania zakażeniom HIV.
Streszczenie wynalazku
Celem wynalazku jest opracowanie szczepionki, która zapewnia zwiększoną reakcję odpornościową wobec szerokiego zakresu szczepów HIV, które to reakcje są przydatne do leczenia albo zapobiegania zakażeniu (albo trwającemu zakażeniu z powodu mutacji) przez różne szczepy wirusa.
Wynalazek ma na celu przezwyciężenie jednej albo wielu wad pokrewnego stanu techniki. W szczególności, szczepionka polienv według wynalazku korzystnie zapewnia intensywniejszą reakcję odpornościową. Siła wynalazku polega na jego zdolności do rekrutacji przedziałów limfocytów B, limfocytów T pomocniczych i limfocytów T cytotoksycznych reakcji odpornościowej do skutecznej odporności komórkowej i humoralnej. Przykładowo, wynalazek wywołuje szeroki zakres aktywności przeciwciał swoistych wobec HIV. Test neutralizacji HIV wykazuje, że wywołane przeciwciała są najwyższej jakości. Nieoczekiwanie, wynalazek może wywołać reakcję odpornościową wobec „naiwnych” szczepów HIV, tj. szczepów HIV, których białka otoczki nie wchodzą, w skład koktajlu polienv.
188 641
W celu zapewnienia skuteczniejszych szczepionek HTV, wynalazek dostarcza szczepionek polienv, obejmujących mieszaniny przynajmniej 4 do około 10000, korzystnie od 4 do około 1000 różnych wirusów rekombinowanych, z których każdy zawiera sekwencję nukleotydową (EV), która jest wariantem env kodującą inny wariant białka otoczki ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HTV), przy czym:
a) sekwencja nukleotydowa EV koduje zarówno regiony zmienne i stałe wariantu białka otoczki; i
b) szczepionka polienv jest zdolna do wywoływania u ssaka przynajmniej jednej reakcji odpornościowej komórkowej i humoralnej przeciwko szczepowi HV.
Korzystnie szczepionka polienv według wynalazku zawiera od 10 do 100 rekombinowanych wirusów obejmujących różne odmiany env HTV.
Korzystnie wariant białka otoczki w szczepionce polienv według wynalazku obejmuje gpl20 i część gp41 zdolne do oligomeryzacji białek env.
Korzystnie sekwencja nukleotydową EV w szczepionce polienv według wynalazku obejmuje fragment restrykcyjny KpnI-BsmI sekwencji nukleotydowej kodującej białko otoczki HTV.
Korzystnie, każda z wyrażanych odmian białka otoczki HTV posiada strukturę i/lub immunogenność podobną do natywnego białka otoczki HIV, występującego w komórce zakażonej albo błonie lipidowej HTV, jak np. w postaci oligomeru.
W najkorzystniejszym wykonaniu szczepionki, rekombinowane wirusy wybrane są z grupy obejmującej wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, adenowirus i wirus towarzyszący adenowirusowi (AAV). W konkretnym przykładzie, przedstawionym poniżej do wytworzenia szczepionki polienv stosuje się wirusy krowianki. Najkorzystniej, rekombinowany wirus krowianki podaje się podskórnie. Zaleta wynalazku polega na tym, że podskórne podawanie wirusa krowianki nie powoduje wytworzenia owrzodzenia, uniemożliwiając w ten sposób uwolnienia zakaźnego wirusa krowianki, który stanowi potencjalne zagrożenie dla populacji o osłabionej odporności.
Korzystnie, szczepionka rekombinowanego wirusa polienv według wynalazku obejmuje lizat komórek zakażonych wirusem, np. komórek Vero, które zawierają wyrażane odmiany białka otoczki oraz zakaźny wirus. Dołączenie lizatu odmian białka otoczki, które pobudzają układ odpornościowy, stanowi istotną cechę wynalazku, ponieważ zwykle wirus jest oczyszczany z lizatu komórek hodowlanych.
W szczepionkach według wynalazku, sekwencja nukleotydową nukleotyd EV jest wyizolowana od pacjenta zakażonego wirusem HTV z regionu ograniczonego geograficznie albo od pacjentów zakażonych wirusem HTV z różnych szczepów albo z laboratoryjnych izolatów HTV.
Szczepionka polienv, według wynalazku obejmuje warianty białka otoczki wyrażane przez rekombinowanego wirusa.
Wynalazcy stwierdzili, że szczepionki polienv według wynalazku wywołują nieoczekiwanie zwiększone reakcje odpornościowe, przez ekspresję i/lub prezentację licznych odmian białka otoczki, z których każde zawiera regiony stałe i zmienne, korzystnie posiadające budowę zasadniczo podobną do natywnego białka otoczki HTV. Zwiększona reakcja odpornościowa rozpoznaje szczepy HTV oraz te, które wyrażają białka otoczki dostarczone w szczepionce polienv. Opis wynalazku ujawnia również odmiany env (EV) kwasu nukleinowego, kodującego (albo komplementarnego) przynajmniej jedną determinantę antygenową odmiany białka otoczki (EPV). EPV jest korzystnie kodowane przez rekombinowany wirus, taki jak dalej dostarczony w szczepionce polienv według wynalazku. Odmiana kwasu nukleinowego obejmuje przynajmniej jedną mutację, która zapewnia różnicujące właściwości antygenowe, albo strukturę trójwymiarową kodowanemu EPV. Wynalazek dostarcza również szczepionki, obejmującej szczepionkę polienv według wynalazku oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo rozcieńczalnik. Szczepionka może dalej obejmować adiuwant i/lub cytokinę, która zwiększa reakcję odpornościową szczepionki polienv na przynajmniej jeden szczep HTV u ssaka, któremu podano szczepionki. Szczepionka polienv według wynalazku jest zdolna do wywołania reakcji odpornościowej obejmującej przynajmniej jedną reakcję humoralną (np. przeciwciała) i komórkową reakcję odpornościową (np. aktywację limfocytów B, limfocytów T pomocniczych i limfocytów T cytotoksycznych (CTL)).
188 641
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania szczepionki polienv obejmującego zmieszanie od przynajmniej 4 do około 10000 różnych rekombinowanych wirusów w celu uzyskania szczepionki polienv, w której:
i) każdy z rekombinowanych wirusów obejmuje sekwencję nukleotydową EV, która jest wariantem env kodującą inny wariant białka otoczki HIV;
ii) sekwencja nukleotydową EV koduje zarówno regiony zmienne jak i regiony stałe wariantu białka otoczki; i iii) szczepionka polienv jest zdolna do wywoływania u ssaka przynajmniej jednej reakcji odpornościowej komórkowej i humoralnej przeciwko szczepowi HTV.
W korzystnym sposobie według wynalazku łączy się od około 10 do około 100 rekombinowanych wirusów obejmujących różne warianty env HIV. Korzystnie rekombinowane wirusy wybrane są z grupy obejmującej wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, adenowirus i wirus towarzyszący adenowirusowi (AAV).
W korzystnym sposobie według wynalazku wariant białka otoczki obejmuje gpl20 i część gp41 zdolne do oligomeryzacji białek env.
W korzystnym sposobie według wynalazku sekwencja nukleotydową EV obejmuje fragment restrykcyjny KpnI-BsmI sekwencji nukleotydowej kodującej białko otoczki HTV.
W korzystnym sposobie według wynalazku sekwencja nukleotydową EV jest wyizolowana od pacjentów zarażonych HIV z regionów ograniczonych geograficznie albo od pacjentów zarażonych HTV z różnych szczepów.
W korzystnym sposobie według wynalazku warianty białka otoczki są wyrażane przez rekombinowanego wirusa. Dostarczone są również sposoby wytwarzania i zastosowania takich rekombinowanych wirusów i szczepionek polienv. W ich zastosowaniu jako szczepionki, każde z białek otoczki korzystnie wywołuje inny podtyp limfocytów B i/lub T, z których każdy reaguje na inne białka otoczki i stąd, na wiele odmian HTV. Mieszanina takiej liczby, rodzaju i/lub budowy białek otoczki jest obecnie wynalezioną metodą wywoływania silnej, trwałej reakcji odpornościowej przeciwko HIV o szerokim zakresie aktywności neutralizującej.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania szczepionki polienv do wytwarzania leku do zapobiegania lub opóźniania początku infekcji wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HTV) u ssaków.
Wynalazek dotyczy również zastosowania szczepionki polienv, w której rekombinowany wirus jest wirusem krowianki a lek jest wytwarzany do podawania podskórnego.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania szczepionki polienv do wytwarzania leku obejmującego dwie szczepionki, które zawierają różne szczepy rekombinowanych wirusów do zapobiegania lub opóźniania początku infekcji wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HTV) u ssaków.
Wynalazek dotyczy również zastosowania przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, albo obu do wytworzenia leku podstawowego lub przypominającego do zapobiegania lub opóźniania początku infekcji wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HTV) u ssaków.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku rekombinowane białko env HIV jest w mieszaninie z adiuwantem albo jest wytwarzane do podawania domięśniowego, bądź jest podawane domięśniowo w mieszaninie z adiuwantem; albo wektor DNA jest wytwarzany do podawania urządzeniem „strzelba genowa”.
Wynallazek dotyczy również plazmidu bifimkcjonalnego, który może służyć jako szczepionka DNA i wektor rekombinowanego wirusa obejmujący gen heterologiczny i/lub miejsce insercji genu heterologicznego pod kontrolą zwierzęcej sekwencji kontrolującej ekspresję i wirusowej sekwencji kontrolującej.
W korzystnym wykonaniu według wynalazku genem heterologicznym jest sekwencja nukleotydową (EV), która jest wariantem env kodująca zarówno regiony zmienne i stałe wariantu otoczki HIV Korzystnie, zwierzęcą sekwencją kontrolującą ekspresję jest bezpośredni wczesny promotor wirusa cytomegalii (CMV), zaś wirusową sekwencją kontrolującą ekspresję jest wczesny promotor wirusa krowianki, późny promotor wirusa krowianki albo oba.
188 641
Stosując szczepionkę według wynalazku można wywołać reakcję odpornościową na zakażenie HIV u ssaka, która jest reakcją profilaktyczną wobec zakażenia HTV, przez podawanie ssakowi szczepionki obejmującej szczepionkę polienv według wynalazku. Szczepionka ta chroni ssaki przed patologią kliniczną związaną z HIV, wywołaną przynajmniej jednym szczepem HIV.
Sposób wywołania reakcji odpornościowej na zakażenie HIV do leczenia zakażenia HIV obejmuje podawanie osobnikowi kompozycji zawierającej inaktywowaną albo atenuowaną szczepionkę według wynalazku, która wywołuje zwiększoną reakcję odpornościową, w porównaniu z kontrolą, u ssaka wobec patologii klinicznej wirusa spowodowanej zakażeniem przynajmniej jednym szczepem HTV.
Profilaktyczny albo terapeutyczny sposób wywoływania reakcji odpornościowej wobec HIV, obejmujący podawanie skutecznej ilości innej, (np. drugiej) kompozycji szczepionki polienv, obejmującej przynajmniej od 4 do około 10000 różnych wirusów rekombinowanych, w której rekombinowane wirusy są innego gatunku niż rekombinowane wirusy poprzedniej szczepionki, i każdy z rekombinowanych wirusów w polienv obejmuje odmienny nukleotyd env, kodujący inną odmianę białka otoczki HIV.
Reakcja odpornościowa swoista wobec HIV, wytworzona rekombinowaną szczepionką wirusową polienv według wynalazku może być dalej wzmagana przez uczulanie albo przypominanie reakcji odpornościowej humoralnej albo komórkowej, albo obu, przez podawanie skutecznej ilości przynajmniej jednego rekombinowanego białka HIV, albo szczepionki DNA albo obu. Korzystnie, szczepionka rekombinowanego biała albo DNA jest również szczepionką polienv. Dowolna z przedstawionych tu strategii szczepienia może być stosowana w dowolnej kolejności. Przykładowo, osobnik może być uczulany rekombinowaną szczepionką wirusową polienv, a następnie można podać dawkę przypominającą szczepionki DNA, z końcową dawką przypominającą szczepionki rekombinowanego białka. Korzystnie, rekombinowane białko env HIV podaje się w mieszaninie z adiuwantem. W konkretnym wykonaniu, podanym niżej, rekombinowane białko env HIV podaje się domięśniowo. Korzystnie, szczepionkę DNA podaje się urządzeniem typu „gene gun”.
Powyższe ujawnienia dostarczają wytycznych do genetycznego konstruowania nowego wektora plazmidowego.
Inne cele, cechy, zalety, przydatność i wykonania wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty w oparciu o poniższy opis i przykłady.
Krótki opis figur
Figura 1. Schemat położenia genu HIV-1 w genomie wirusa krowianki. Gen otoczki HTV-1 położony jest pomiędzy prawym i lewym segmentem locus kinazy tymidynowej. Na końcu C genu otoczki HIV-1 występuje miejsce HindIII. Prawidłowe wstawienie powoduje powstanie fragmentu HindIII wielkości około 7 kb. Badanie metodą Southern o tym wzorcu potwierdza położenie i prawidłową orientację genu otoczki HTV-1.
Figura 2. Graficzny schemat danych pokazujących, że w ssaczym modelu reakcja przeciwciał swoistych wobec HIV jest długotrwała. Pokazano wyniki reprezentatywnych surowic mysich badano w ELISA na przeciwciała przeciwko HIV. Każdą próbkę rozcieńczano 1:100 (wypełnione słupki), 1:1000 (kratkowane słupki) i 1:10000 (puste słupki) przed badaniem na płytkach ELISA pokrytych hIV-1. Próbki pobierano od badanych myszy w różnych odstępach czasu (1 miesiąc, 4 miesiące i 6 miesięcy) po wstrzyknięciu 107 pfu konstruktu wirusa krowianki, wyrażającego białko otoczki HIV-1. Myszy kontrolne immunizowano wirusem krowianki nie zawierającym sekwencji otoczki. Pokazano słupki odchylenia standardowego.
Figura 3. Graficzny schemat danych pokazujących, jak dawka wirusa krowianki wpływa na wywołanie przynajmniej jednej reakcji odpornościowej, w tym wytwarzanie przeciwciał przeciwko HIV. Reprezentatywne próbki surowic mysich badano testem ELISA na płytkach pokrytych HIV-1. Próbki surowic pobrano od myszy, którym wstrzyknięto 10,10 i 10 pfu jednego z wirusów krowianki wyrażającego białko otoczki HV-1. Próbki surowic badano około trzy tygodnie po wstrzyknięciu. Każdą próbkę rozcieńczono 1:100 (wypełnione słupki), 1:1000 (kratkowane słu^^i) i 1:10000 (puste słupki) przed badaniem na płytkach ELISA pokrytych HIV-1, pokazano również słupki odchyleń standardowych.
188 641
Figura 4. Graficzny schemat pokazujący, że mieszanie konstruktów wirusa krowianki nie wpływa na wywołanie przeciwciała swoistego wobec HIV u ssaków. Reprezentatywne próbki surowic mysich badano testem ELISA około 2 miesięcy po wstrzyknięciu 1(0 pfu wirusa krowianki wyrażającego białko (białka) otoczki HIV-1. „Pojedyncza” oznacza próbkę od myszy, która otrzymała pojedynczy wirus krowianki. „Mieszanina” oznacza próbkę od myszy, która otrzymała mieszaninę wirusów krowianki wyrażających pięć różnych białek otoczki. Każdą próbkę rozcieńczono 1:100 (wypełnione słupki), 1:1000 (kratkowane słupki) i 1:10000 (puste słupki) przed badaniem na płytkach ELISA pokrytych HIV-1. Pokazano słupki odchyleń standardowych.
Figura 5. Wytwarzanie nowej rekombinacji wirusa krowianki przez zastępowanie produktami PCR sekwencji pEvent4 BH10. Pokazano sposób zastępowania. Produktami PCR zastępowano odpowiednie sekwencje BH10 w unikalnych miejscach restrykcyjnych enzymów KpnI i BsmI. Po przecięciu plazmidu i ligacji z produktem PCR, nowe plazmidy rekombinowano typem dzikim VV tworząc wektory ekspresyjne W.
Figura 6. Odpowiedzi w teście ELISA Abbott po immunizacji. Surowice od wszystkich czterech szympansów badano klinicznym testem Abbott (patrz, materiały i metody, niżej). Wyniki dla każdej próbki surowicy (oś Y) rejestrowano dla każdej daty badania (oś X). U szympansa immunizowanego mieszaną szczepionką VVenv obserwowano silną odpowiedź.
Figura 7. Mapa bifunkcjonalnego plazmidu, który może działać jako szczepionka DNA oraz jako rekombinowany wektor VV. Obecność bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalii (CMV) oraz promotorów, wczesnego i późnego, wirusa krowianki (VV) umożliwiła ekspresję obcego genu zarówno w komórkach ssaków, jak i komórkach zakażonych VV.
Szczegółowy opis ujawnienia
Ujawnienie nieoczekiwanie zwiększonej reakcji odpornościowej na mieszane szczepionki polienv HIV. Poprzednie wysiłki zapewnienia szczepionek przeciwko różnym szczepom HTV skupiały się na jednym lub wielu regionach zmiennych gp120 albo gp160. Oczekiwano, że takie regiony zmienne dostarczone w szczepionce powinny zapewnić szeroką ochronę przed zakażeniem HIV. Jednakże, szczepionki takie nie zapewniły powodzenia, ponieważ reakcja odpornościowa wywołana szczepionką nie rozpoznawała wielu różnych szczepów HIV. Stąd, istnieje krytyczna potrzeba dostarczenia szczepionek, które wywołują reakcje odpornościowe na liczne szczepy HIV, takich jak szczepionki przydatne do leczenia i/lub zapobiegania HIV.
Wynalazcy stwierdzili, że nieoczekiwanie silną pierwotną i wtórną (przypominającą) reakcję odpornościową można wywołać przeciwko kilku albo wielu różnym szczepom HIV przez zastosowanie szczepionek polienv, które zawierają mieszaninę od przynajmniej 4, do 1000, zaś prawdopodobnie do 10000 rekombinowanych wirusów, z których każdy koduje inną odmianę białka otoczki (EPV). Szczepionka może również zawierać EPV wyrażaną przez wirusy, np. wytworzoną przez komórki gospodarza zastosowane do wytwarzania wirusa.
Określenia „uczulanie” albo „pierwotna” i „przypominanie” albo „przypominająca” w znaczeniu tu zastosowanym dotyczą, odpowiednio, immunizacji początkowej i kolejnych, tj. zgodnie z definicjami, którym te określenia normalnie odpowiadają w immunologii.
Kwas nukleinowy kodujący EPV (kwas nukleinowy odmiany otoczki (EV)) można wyizolować z tej samej albo innej populacji (np. geograficznej) ludzi zakażonych HTV. Alternatywnie, różne kwasy nukleinowe EV można uzyskać z dowolnych źródeł i selekcjonować w oparciu o przesiewanie sekwencji w kierunku różnych sekwencji kodujących albo przez badanie różnic w wywoływaniu reakcji odpornościowych humoralnych i/lub komórkowych wobec licznych szczepów HIV in vitro i in vivo, według znanych metod.
Początkowe prace dotyczyły szczepionek rekombinowanego wirusa krowianki. Jednakże, jak łatwo zauważą specjaliści, w szczepionce według wynalazku można zastosować dowolny rekombinowany wirus w celu wyrażania antygenów polienv. Ponadto, zastosowanie licznych szczepionek wirusowych może wywołać przeciwwirusową reakcję odpornościową, która może spowodować mniej skuteczną reakcję przypominającą (prawdopodobnie z powodu nasilenia reakcji przeciwwirusowej).
Jak łatwo zauważą specjaliści, wynalazcy stwierdzili dalej, że immunizowanie przypominające rekombinowanym białkiem albo białkami env, korzystnie białkami, dalej nasila spo188 641 sób immunizacji ujawniony w opisie wynalazku. Białko albo białka env HIV mogą odpowiadać białkom env HIV wyrażanym w szczepionce polienv, albo mogą być inne niż białka env HIV
Podobnie, jak zauważą specjaliści, sposoby immunizacji ujawnione w opisie wynalazku są nasilane przez zastosowanie szczepionki DNA. Szczepionkę DNA można zastosować jako przypomnienie, np. jak to opisano wyżej w odniesieniu do rekombinowanych białek HIV Alternatywnie, szczepionkę DNA można zastosować do immunizacji pierwotnej, zaś rekombinowaną szczepionkę wirusową albo szczepionki można zastosować do przypomnienia reakcji odpornościowej przeciwko HIV. Podobnie jak w przypadku przypominającej szczepionki rekombinowanych białek env, szczepionka DNA może obejmować jeden albo wiele wektorów do ekspresji jednego albo wielu genów env HIV. Oprócz tego, geny env HIV mogą odpowiadać genom wyrażanym przez rekombinowane wirusy szczepionki albo mogą być inne. W najkorzystniejszym wykonaniu, wektory wytwarza się w celu wyrażenia w szczepionce wirusów rekombinowanych oraz w transfekowanych komórkach ssaczych, jako części szczepionki DNA.
Stwierdzono, że ta reakcja odpornościowa (humoralna i/lub komórkowa) jest skuteczna wobec szerokiego zakresu szczepów zakaźnego wirusa, takiego jak HIV i nie jest ograniczona do szczepów wirusa wyrażających konkretne odmiany białek otoczki (EPV) dostarczonych przez szczepionkę polienv. Wynalazek dostarcza więc licznych EPV, kodowanych przez szczepionkę rekombinowanych wirusów, która daje nieoczekiwanie zwiększoną reakcję odpornościową na liczne szczepy HIV.
Szczepionki polienv i szczepienie
Wynalazek dostarcza więc, w jednym aspekcie, szczepionek polienv stanowiących mieszaniny przynajmniej 4, i do 10000 różnych rekombinowanych wirusów krowianki, z których każdy wyraża inną odmianę białka otoczki albo jego immunogenną część. Jak łatwo zauważy specjalista, można zastosować 4 do około 1000, albo korzystnie od około 10 do około 100 różnych rekombinowanych wirusów. Specjalista może dalej łatwo zauważyć, że do szczepionek można zastosować inne wirusy. Przykłady przydatnych wirusów, które mogą służyć jako rekombinowane wirusy nosicielskie do szczepionek, oprócz wirusa krowianki obejmują, wirus ospy ptasiej, adenowirus i wirus towarzyszący adenowirusowi. Dostarczono również sposobów wytwarzania i zastosowania takich szczepionek polienv.
Szczepionka polienv według wynalazku wywołuje przynajmniej jedną reakcję odpornościową humorałną albo komórkową u ssaka, któremu podano szczepionkę polienv, zaś reakcja na szczepionkę jest subkliniczna albo skuteczna do wywołania przynajmniej jednej reakcji odpornościowej na przynajmniej jeden szczep HIV, w taki sposób, że podanie szczepionki jest przydatne do celów szczepienia.
Szczepionki wii^^^^ye. Do wytworzenia wirusowej szczepionki polienv do podawania antygenów polienv HIV można zastosować różne zmienione genetycznie wirusy nosicielskie („wirusy rekombinowane”). Szczepionki wirusowe są szczególnie przydatne, ponieważ składnik zakażenia wirusowego ułatwia gwałtowną reakcję odpornościową, ukierunkowaną na limfocyty B, limfocyty T pomocnicze i limfocyty T cytotoksyczne. Jako rekombinowane wirusy nosicielskie do szczepionek według wynalazku można zastosować liczne gatunki wirusów. Korzystnym wirusem rekombinowanym do szczepionki wirusowej jest wirus krowianki (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 87/06262, 22 października, 1987 Moss i in.; Cooney i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-6 (1993); Graham i in., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992); McElrath i in., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)). W innym wykonaniu, można zastosować rekombinowane wirusy ospy ptasiej (Pialoux i in., AIDS Res. Hum. Retrovir. 11:373-81 (1995), errata w AIDS Res. Hum. Retrovir. 11:875 (1995); Andersson i in., J. Infect. Dis. 174:977-85 (1996); Fries i in., Vaccine 14:428-34 (1996); Gonczol i in., Vaccine 13:1080-5 (1995)). Inną alternatywą jest defektywny adenowirus albo adenowirus (Gilardi-Hebenstreit i in., J. Gen. Virol. 71:2425-31 (1990); Prevec i in., J. Infect. Dis. 161:27-30 (1990); Lubeck i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6763-7 (1989); Xiang i in., Virology 219:220-7 (1996)). Inne odpowiednie wektory wirusowe obejmują retrowirusy pakowane do komórek przy pomocy amfotropicznych gospodarzy (patrz, Miller, Hum. Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology $9) i atenuowane albo defektywne wirusy DNA, takie jak, choć nie ograniczone do wirusa opryszczki pospolitej (HSV) (patrz, np. Kaplitt i in., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991); wirusa brodawczaków, wirusa Epsteina-Barr (EBV),
188 641 wirusa towarzyszącego adenowirusowi (AAV) (patrz, np. Samulski i in., J. Virol. 61:30963101 (1987); Samulski i in., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)) itp.
Szczepionki DNA. Alternatywa dla tradycyjnej szczepionki obejmującej antygen oraz adiuwant obejmuje bezpośrednią indukcję DNA kodującego antygen w tkankach osobnika, w celu ekspresji antygenu przez komórki tkanek osobnika. Takie szczepionki określane są tu jako „szczepionki DNA” albo „szczepionki oparte na kwasie nukleinowym”. Szczepionki DNA opisano w międzynarodowej publikacji patentowej WO 95/20660 oraz WO 93/19183. Zdolność bezpośrednio wstrzykniętego DNA, który koduje białko wirusowe do wywołania ochronnej reakcji odpornościowej wykazano w licznych układach doświadczalnych (Conory i in., Cancer Res. 54:1164-1168 (1994); Cox i in., Virol. 67:5664-5667 (1993); Davis i in., Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851 (1993); Sedegah i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9866-9870 (1994); Montgomery i in., DNA Cell Bio. 12:777-783 (1993); Ulmer i in., Science 259:1745-1749 (1993); Wang i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4153-4160 (1993); Xiang i in., Virology 199:132-140 (1994)). Badania mające na celu ocenę tej strategii neutralizacji wirusa grypy wykorzystywały zarówno białka otoczki jak i wewnętrzne w celu wywołania wytwarzania przeciwciał, ale skupiły się szczególnie na wirusowym białku hemaglutyniny (HA) (Fynan i in. , DNA Cell. Biol. 12:785-789 (1993A); Fynan i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482 (1993B); Robinson i in., Vaccine 11:957 (1993); Webster i in., Vaccine 12:1495-1498 (1994)).
Szczepienie przez bezpośrednie wprowadzanie DNA, który koduje białko env HIV w celu wywołania ochronnej reakcji odpornościowej powoduje reakcję zarówno komórkową, jak i humoralną. Jest to analogiczne do wyników uzyskanych z żywym wirusem (Raz i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, wyżej; Wang, 1993, wyżej; Xiang, 1994, wyżej). Badania na norkach wskazują, że szczepionki dNa przeciwko zakonserwowanym wirusowym białkom wewnętrznym grypy, wraz z glikoproteinami powierzchniowymi, są bardziej skuteczne wobec odmian genetycznych wirusa grypy niż uzyskane ze szczepionkami inaktywowanymi albo podjednostkowymi (Donnely i in., Nat. Medicine 6:583-587 (1995)). W rzeczywistości, opisano u myszy powtarzalną reakcję odpornościową na DNA kodujący nukleoproteinę, która trwała zasadniczo przez całe życie zwierzęcia (Yankauckas i in., DNA Cell. Biol. 12:771-776 (1993)).
Jak wiadomo, na skuteczność ekspresji genów antygenów i/lub immunogenność szczepionek DNA może wpływać wielka liczba czynników. Przykłady takich czynników obejmują powtarzalność szczepienia, konstrukcję wektora plazmidowego, wybór promotora zastosowanego do napędzania ekspresji genu i stabilność genu wprowadzonego do plazmidu. Zależnie od ich pochodzenia, promotory różnią się pod względem swoistości tkankowej i skuteczności zapoczątkowania syntezy mRNA (Xiang i in., Virology 209:564-579 (1994); Chapman i in., Nuci. Acids Res. 19:3979-3986 (1991)). Do tej pory, większość szczepionek DNA w układach ssaczych polegała na promotorach wirusowych pochodzących z wirusa cytomegalii (CMV). Mają one dobrą skuteczność przy szczepieniu domięśniowym i skórnym u wielu gatunków ssaków. Innym czynnikiem, o którym wiadomo, że wpływa na reakcję odpornościową wywołaną szczepieniem DNA, jest sposób dostarczenia DNA; drogi pozajelitowe mogą dać niski stopień transferu genu i powodować istotną zmienność ekspresji genu (Montgomery, 1993, wyżej). Szczepienie plazmidem z dużą prędkością, przy użyciu urządzenia typu „strzelba genowa”, zwiększa reakcję odpornościową myszy (Fynan, 1993B, wyżej; Eisenbraun i in., DNA Cell. Biol. 12:791-797 (1993)), prawdopodobnie z powodu wyższej skuteczności transfekcji DNA i skuteczniejszej prezentacji antygenu komórkom dendrytycznym. Szczepionki według wynalazku oparte na wektorach zawierających kwas nukleinowy można również wprowadzać pożądanemu nosicielowi innymi sposobami znanymi w stanie techniki, np. przez transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, transdukcję, fuzję komórek, dekstran-DEAE, precypitację fosforanem wapnia, lipofekcję (fiizję z lizosomami) albo przez przenośnik wektorowy DNA (patrz, np. Wu i in., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu i Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut i in., kanadyjskie zgłoszenie patentowe nr 2,012,311, zgłoszone 15 marca, 1990).
Bifunkcjonalne plazmidy do szczepionek wirusowych i DNA. Jednym z aspektów wynalazku jest plazmid bifunkcjonalny projektowany tak aby mogły służyć jako szczepionki DNA albo wektory rekombinowanego wirusa. Bezpośrednie wstrzyknięcie oczyszczonego plazmidowego DNA, tj. jako szczepionki DNA, powinno wywołać u badanego osobnika reakcję
188 641 oOpprpościową na antygen wyrażany przez plazmid. Plazmid powinien być również przydatny w żywych, rokombinowαpych wirusach jako nośnik immunizacji.
Bifunkcjonαlpj plazmid według wynalazku dostarcza genu hoterologiczpogo, albo miejsca wstawienia genu hotorologicznego, pod kontrolą dwóch różnych sekwencji kontrolujących ekspresję: zwierzęcoj sekwencji kontrolującej ekspresję i wirusowej sekwencji kontrolującej ekspresję. Określenie „pod kontrolą” zastosowane jest w potocznym sensie, tj. funkcjonalnie albo w podobny sposób związany z sekwencją kontrolującą ekspresję, taką jak promotor, zapewniając ekspresję genu heterologicznego. W najkorzystniejszym wykonaniu, zwierzęca sekwencja kontrolująca ekspresję jest promotorem ssaczym (promotory ptasie są również uwzględniane przez wynalazek); w konkretnym wykonaniu, promotorem jest bezpośredni wczesny promotor wirusa cjtomogαlii (CMV) (patrz, fig. 7). W dalszym konkretnym wykonaniu, promotorem wirusowym jest wczesny promotor wirusa krowianki albo promotor późny wirusa krowianki, albo korzystnie oba (fig. 7). Osobnicy mogą być szczepieni schematem wielodawkowym, bifUpkcjpnalpjm plazmidem podawanym jako szczepionka DNA i w różnym czasie, ale w dowolnej kolejności, jako szczepionka rokombippwαpogp wirusa. W opisie zgłoszenia uwzględniono również podanie pojedyncze albo wielokrotne plazmidu bifupkcjopαlpego jak szczepionki DNA albo jako szczepionki wirusa rekombipowapegp albo obu. Ten schemat szczepienia może być uzupełniony przez epdanio szczepionek rokombinowapego wirusa (poniżej) albo może być stosowany z dodatkowymi nośnikami szczepionki.
Jak łatwo zauważy specjalista, plazmidy hifunkcjonalne według wynalazku można zastosować jako wektory szczepionek polieny. Tak więc, przez wprowadzenie przynajmniej 0, do około 10000, korzystnie 0 do 1000, zaś najkorzystniej 10 do 100 różnych genów eny HIV do plazmidów ^funkcjonalnych, wytwarza się odppwio0pi zestaw plazmidów bifupkcjopalnych przydatny jako szczepionka polieny.
Szczepionki białka rokpmbinowapogo. Aktywna odporność wywołana przez szczepienie białkiem albo białkami eny HIV według wynalazku może zapoczątkować albo przypomnieć humoralną reakcję odpornościową. Białko albo białka eny HIV, albo ich fragmenty antygenowe można wytworzyć przez domieszanie adiuwantu w celu wytworzenia szczepionki.
Określenie „adiuwant” dotyczy substancji albo mieszaniny, która zwiększa reakcję odpornościową na antygen. A0iuwapt może służyć jako depot tkankowy, uwalniając powoli antygen, jak również jako aktywator układu limfatycznogo, który nieswoiście zwiększa reakcję o0eprnościową (Hppd i in., Immupology, wyd. 2, 1980, Bepjamip/Cummipgs; Menlo Park, Califorpia, str. 380). Pierwotna prowokacja samym antygenem, pod nieobecność adiuwantu, często nie wywołuje reakcji odpornościowej humora^ej albo komórkowej. A0iuwαpty obejmują, choć nie są ograniczone do kompletnego a0iuwaptu Freund'a, niekompletnego adiuwantu Freund'a, saponiny, żeli mineralnych takich jak wodorotlopek glinu, substancji powierzchniowo czynnych, takich jak lizolocjtypa, poliole pluTOnowe, ρpliapiopy, peptydy, oleje albo emulsje węglowodorów, homocjjαnipy skałoczepu, 01nitrofopolu i a0iuwaptów potencjalnie przydatnych u ludzi takich jak BCG (bacille Calmette-Guerip) i Corypobacterium parwum Wybór adiuwantu zależy od szczepionego osobnika. Przykładowo, szczepionka dla ludzi nie powinna zawierać adiuwantów emisji oleju albo węglowodoru, w tym kompletnego i niekompletnego adiu^^tu Freund'a. Jednym z przykładów adiuwantu przydatnego do stosowania u ludzi jest alum (żel glinu). W konkretnym wykonaniu (poniżej) rokombinowapo białko eny HIV jest podawane domięśniowo w alumie. Altomatjwpie, szczepionka rekombinowanego białka eny HTV może być podana podskórnie, śródskórnie, dootrzewnowo albo inną dopuszczalną drogą podawania szczepionek.
Podawanie szczepionki. Immunizację przeciwko HIV można uzyskać przy użyciu rekombinowanej szczepionki wirusowej według wynalazku samej albo w połączeniu ze szczepionką DNA albo rokombinowaną szczepionką białkową albo obu. W konkretnym wykonaniu, rekombinowape białko eny HIV w wodorotlenku glinu podaje się między innymi w celu przypomnienia reakcji odpornościowej.
Każda dawka wirusa może zawierać te same 0 do 10000, korzystnie 0 do 1000, zaś najkorzystniej 10 do 100, różnych wirusów rekombipowanjch, z których każdy wyraża inny gen eny HIV. Alternatywnie, wirusy w kolejnych szczepionkach mogą wyrażać różne geny eny HIV. W jeszcze innym wykonaniu, kolejne szczepionki wirusowe polieny mogą zawierać
188 641 część wirusów wspólnych, a część innych niż te w poprzedniej szczepionce. Przykładowo, szczepionka wstępna może zawierać wirusy krowianki wyrażające białka env HIV określone arbitralnie jako 1-10. Druga (przypominająca) szczepionka może zawierać wirus krowianki (albo korzystnie inny niż krowianka, taki jak wirus ospy ptasiej albo adenowirus) wyrażający białka env HIV 6-15 albo 11-20 itp.
Szczepionka DNA albo szczepionka rekombinowanego białka może zawierać pojedynczy antygen białka env HIV albo liczne geny. Korzystnie, szczepionka DNA albo rekombinowanego białka do zastosowania w wynalazku zawiera więcej niż jeden antygen białka env HIV. Podobnie jak w kolejnych szczepionkach wirusowych, białko albo białka env HIV szczepionki DNA albo szczepionki rekombinowanego białka odpowiadają białku env HIV wyrażanemu w szczepionce wirusowej polienv, albo mogą być inne od dowolnego białka env polienv.
Ogólnie, najkorzystniejsze jest dostarczenie największej możliwej różnorodności w każdym protokole szczepienia, w celu ekspozycji biorcy na największą liczbę białek env HIV, i w ten sposób zapewnienie największego prawdopodobieństwa neutralizującej aktywności krzyżowej z natywnymi izolatami HIV.
Odmiany białka otoczki
Jak zaznaczono powyżej, EPV do zastosowania w szczepionkach według wynalazku można otrzymać z lokalnych geograficznie izolatów albo szczepów, albo z geograficznie różnych izolatów, tj. różnych szczepów. Jak łatwo zauważą specjaliści, otrzymanie nukleotydów env (tj. genów) ze źródeł naturalnych ma liczne zalety: izolaty są łatwo dostępne, EVP odpowiadają białkom występującym naturalnie, wobec których pożądana jest odporność i z nowych izolatów można łatwo wychwycić mutacje HIV.
EPV obejmują również polipeptydy o aktywności immunogennej spowodowanej sekwencją aminokwasowa EPV, przynajmniej jeden epitop albo determinantę antygenową. Ta sekwencja aminokwasowa odpowiada zasadniczo przynajmniej jednemu fragmentowi 10-900 aminokwasów i/lub sekwencji zgodności znanych EPV HIV. Takie EPV mogą mieć całkowitą homologię albo identyczność wynoszącą przynajmniej 50% ze znaną sekwencją, aminokwasową białka otoczki, taką jak 50-99% homologii albo dowolny zakres albo wartość, o ile wywołują reakcję odpornościową przeciwko przynajmniej jednemu szczepowi HIV.
Procent homologii można stwierdzić, przykładowo, przez porównanie informacji sekwencji przy użyciu programu komputerowego GAP, wersja 6,0, dostępnego z University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWCGC). Program gAp wykorzystuje metodę przyrównania Needlemana i Wunscha (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), zweryfikowaną przez Smitha i Watermana (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)). Pokrótce, program GAP określa podobieństwo jako liczbę porównanych symboli (tj. nukleotydów albo aminokwasów), które są podobne, podzieloną przez całkowitą liczbę porównanych symboli w krótszej z dwóch sekwencji. Korzystne parametry domyślne programu GAP obejmują: (1) jednostkową matrycę porównania (zawierającą wartość 1 dla identycznego i 0 dla nie identycznego) oraz ważoną matrycę porównania Gribskova i Burgessa, Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986), jak opisana przez Schwartza i Dayhoffa, wyd., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC (1979), str. 353-358; (2) wartość kamą równą 3 za każdy odstęp i dodatkową wartość karną 0,1 za każdy symbol w odstępie; i (3) brak wartości karnej dla odstępów końcowych.
W najkorzystniejszym wykonaniu, EPV według wynalazku jest odmienną postacią przynajmniej jednego białka otoczki ENV. Korzystnie, EPV obejmuje gp120 i domenę oligomeryzacji gp41, takąjak gp140 (Hallenberger i in., Virology 193:510-514 (1993)).
Znane białka otoczki HIV obejmują od około 750 do 900 aminokwasów. Przykłady takich sekwencji są łatwo dostępne z komercyjnych i instytucjonalnych baz danych sekwencji HIV, takich jak GENBANK, albo opublikowanych kompilacji takich jak Myers i in., wyd., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, tom I i II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Zastąpienie albo wstawka EPV w celu otrzymania dodatkowego EPV, kodowanego przez kwas nukleinowy w celu uzyskania szczepionki rekombinowanego wirusa albo polienv według wynalazku, może obejmować zastąpienie albo wstawkę przynajmniej jednej reszty aminokwasowej (np. 1-25 reszt aminokwasowych). Alternatywnie, przynajmniej jeden aminokwas (np. 1-25
188 641 aminokwasów) może zostać usunięty z sekwencji EPV. Korzystnie, takie zastąpienia, wstawki albo usunięcia identyfikuje się na podstawie określenia sekwencji białek otoczki, uzyskanej przez sekwencjonowanie nukleotydów przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego EPV od osobnika zakażonego HTV.
Nie ograniczające przykłady takich zastąpień, wstawek albo usunięć korzystnie wykonuje się przez amplifikację sekwencji DNA albo RNA env od pacjentów zakażonych HIV, które można określić w rutynowych doświadczeniach w celu osiągnięcia zmodyfikowanych właściwości strukturalnych i funkcjonalnych białka otoczki albo EPV. Otrzymane w ten sposób EPV, korzystnie ma właściwości antygenowe inne niż oryginalne EPV. Takie różnice antygenowe można określić odpowiednimi testami, np. przez badanie panelem przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec białek otoczki HIV w teście ELISA.
Dowolne zastąpienie, wstawkę albo usunięcie można zastosować, jak długo powstałe białko EPV wywołuje przeciwciała, które wiążą się z białkami otoczki HIV, ale które mają inny wzorzec niż przeciwciała wywołane drugim EPV. Każde z powyższych zastąpień, wstawek i usunięć może również obejmować aminokwasy zmodyfikowane albo niezwykłe, jak np. opisane w 37 C.F.R. § 1.822(p)(2).
Poniższa Tabela 1 pokazuje nie ograniczające przykłady alternatywnych odmian białek HIV, które mogą być kodowane przez rekombinowany wirus.
188 641
Tablica 1: Odmiany białka otoczki HIV
O £- H Σ >>
a <9 > E-
® 3 (9 * —* W
r* U a X
A 3 f-
Ul (9
3 W X
<n O! a □ 1-4 co
> H CM 3 j X
K -H H a 3 a X co
A! N 0 o c< X 2 u et o
0 +J 0 a a n> 2 et 3
(ΰ Λ4 co u >« 3 O
rM Ή Γ* X 2 W W
Λ a X cd sd o E-i
C 1 <0 H Ul o oi ad o W
co H w X X
r-1 (0 υ -ri r—1 Λ (d Pl H o X
CM X Σ l·· cd
r-f > <
o n Oi ht C_, w
a ε
co <
> Σ
A e-
Ul X
M· Ot
n u X
CM
H ω
H
O a t- u > 2 *
A
A U Q
f* X M 2
u> 3
A > W
M· O.
% >
CM O
H !w n
o Ul X,
A >
03
r> > <
A X
A >4
Φ X a a 2
f*l U CO o a >
<M E-i > < w X
»-ł > o K iz
o
A to a
ao u 01 a
H s Oi o
US X K H a
A ►4 M X t·
Μ» a X H u <
Pl »4 Ł. *< X w
CM j W X £-
•H X 4 < H
»-ł m
O A A
A a 2 C9
o
t* Oi
V >
A O
Μ» 4
P> a X Ο»
CM E* V» X
H <
O 09 X u
A > M
09 2 X
Γ* X
UJ > X A σ X
A M
M* H et 4 X A
p> Q co X «
CM X X t-
H 4 H W u
O r* X cd 2
A <4 cd
A a u
C* CO
UJ
A o
M· tu
Pt •4
CM tn >
cH H A
r4 A
188 641
α cm Μ W
σι w >
00 a
f* «
φ a Ol
ιη χ
o
η bl Q z
Μ >
Η X H
Ο Η Π α 2 a> JM
οι 2
00 2 «
f* 2
Μ3 X W
ιη 2 α
’Τ b.
m 2 M 2 O wrt «0
Μ M σ α
r* (->
1 1001 >
σι 2 w
ο > o u Οι
Γ 4 X
φ > u >< α w
ιη > W j X [X
”? W
η σ a 6i
0* 04
Η 2 □ W
H 01
o Ul H Z u H W
Ol fri co X
«0 Q 4 O
c- 2 ►
ie 2 o fii 4
Ul <4 > 2 fc
o S 2 σ X
n fr< 2 W X σ
Ci o
r4 2 2 α « Η
O H 4 X
Ol (tl K 2 σ
00 >
r* O >
w >4 u
Ul Oł 4
rr (·»
rn 4 X
n 2 > Ol
rH > U
O O W υ
01 Ot
00 2
c* u
UJ CO
Ul OI 2
α W
m Tt
Cl 4
r-4 en 2
r4 Γ4 r
O 00 rH VI o 2 W u
Ol 2 Ot
00 W
c· 10 W 2 > Ot X f*
2 >« o
in fc >«
VI 0« t* u
f*l u •
n z 2
K 2 H X OI
O f* M X > OJ
<n u 2 o a 4
00 o H << en 2
c· u « Ol 0 2
10 u α α
Ul z W e< W >
n· H M 2
Cl 2 OS « >
n X 2 2 2 O
H O 2 en σ
O vo ri 2 2 w w 4
01 01 2 fr«
00 en e< > 0
Γ- en e* 2
UJ fł
ŁT > 2
_ · er 1 ** ω
n 2 en
CM en Cd
rM z M
r-i Ul
188 641
210 1 ο < w
Φ ζ α b M
α z
!* A
ΚΟ (β Z
κΠ α n
«Γ ζ ΰ
-η ο en
Μ ζ α Z o
Η ο z o H z
ο ο η Η > ►4
Α α σ z M z
Α W > «< X w
Γ* Η > »4
Φ 0
ΙΛ u w b A A
«· ζ z OS b >
ΡΙ >1 OS z Z
Ν Α ►4
Η Α J b X
1 19θ 1 < ω b
Α >» z ot en X
α U Q > o
Ρ* z & Ci b
κο 0« Z z u
tn > W X z σ
* z os Cf u
d o α z
Ν « o z 01 b
W j > Οί Z
TBT
O CK U o Q
A A
A en b
f* > H b
KO z
m A OT
«· U
Pl <
(M a
H n Z
1 230 H > <4
A > b < H
CD en b
r* b ti OT
Ό z OT O
tn u
’Φ OT X Z b
Pł b W
N •4 H
rł b ti w z X
220 | A z b
A X Z
CO Z b « α
r* >«
vo OT Z
ΙΛ b <
5j> Z W
Pl b z
CJ b OT
r-( b W OT
r-ł r4 Cl
270 1 Z
A b z Z OT z
A O
b A o OT b W
KO O M
ΚΛ b Z OT
* O
Pl Z OT d
n A
H b Z u U 0>
o KO C· Z A U b
A Z O OT
O z z PS
u
ko z
ΙΛ ►4 A
5j> K X J
Pl *< >
Cl A
H U
1 OSZ ... 1 *< b
A A O
A b
r* O
KO * A X
in »
M· K X
PI A A
N H
r*ł α
H Ί» n
188 641
Ο ο > X X Μ X
σι > Μ Q Ό
<8 η Ό X X ο
Γ* Η Ο X X
tt Η X X
ΙΛ X 0)
J
cn ο> f-
π Ο
Η ζ
ο Ol Μ j Μ Μ
01 ►4
α J
Γ* Ο X
Μ> £*
ιη tt Η
>
η > W Ε-
OJ α
Η οί X W
Ο 00 <Μ Μ
σι ο
Λ X
r Η
ν Ο
ιη α Η X
Μ* > OS
η Η V? >
Ν W Η
r4 > Μ
Η Γ· (Μ
ο η η z H X > σ
σι z 03 X tt X
β X tt
Γ* X
ια Η H X tt »
ιη U >»
Z > fr< z
m H « >
CM u «ί o > i*
Η > W »4
Γ 32°1 w X X
«Λ o M X O h>
C0 z X *
f* >4
u> O a
m > <
η* w >4 >
<η M Z
Μ H W Z >
»Η X X O
Ο Η < > H Ό a
σι Z tt O
00 Q z U
Γ* tt z X 4
ΙΟ X K ►4 X X
ΙΛ Z □
Μ* X Q tt tt X
rt tt O X >
CM QS Z
w w J > s
301
o 10 cn X
Ol Ol X u X >
o X σ
r» Z H >4 tt ί«
w z o Z W
tfl o w X X z
J W tt > X
cn w X tt o >
IM X X σ o X
rt σ X X o M
o ΙΛ M e« cc «4 s
σι f X > X z
00 > X >« X K
f* X M z >
10 X > tt z
in X O· X ε
Μ» o X tt z
cn X X tt 4
<M o X
K X W tt
L°»i................1 Ol a X >
σι w X z »4 ra
00 a X
r* X >< > a X
10 H
(Π 01 X z £-> a
M· X X o α
cn os z Oi X >
CM f- > X 0S W
rł z X >* E- ω
n cn
188 641
Ο φ ΓΗ Μ > Ε- Σ Ο <Ν σ σ X Ot X o ιΛ * os X
Φ X in φ X 01 4 X Φ o
09 Μ σ X α 0» X 4 00 Ch α <4 α
Γ* X Ρ* X Q t* »3 X H
φ X ο «ο Ο w X W > X
W Ό X Ο (Π X tn W 4 >
* h >» J ω b η» X X to >4 tn
<*ι Ο X » 0ί <Η to W m Q X d Η X
π Η X 4 > α <Ν W α Cł 01 X u X X
Η Μ X ο σ Μ Η ο H (9 M X 4 Μ
ο α η >4 X α Η ·* « « ► X H O * H· M X o σ
Φ Μ 0) ο » Μ σί υ > Φ X Z o X Ο
00 0) X X Μ αί 00 X Η * Q0 X o Q οι Η
Γ* Ο > 4 Ρ* to >4 t* X 01 σ X ο
χο Η > J X <0 01 X X Z X u> 01 X α ο >4
m οι σ X X u W as X U in o X X ο X
* χ Η ο tn ζ -9» X Ζ ►1 X X M W X
η >4 Η > <η > X co n X W to X 19
Cł X > 4 w Cł Η > n to C9 q X
Η X 4 X κ α r4 ω H » 4 α X Ζ
1 370 X X (Λ Μ fiu ο ο α> >4 Μ > O O X X α 01
φ X Φ α Φ oi X > α
00 X α α X 4 ® α Ο 00 X >4
r 4 u X « οι Γ* ο Ο P* o. PS X V) Ο
οι « σ X U 4 Vfl οι 4 u> X X o to
ιη 0) X X Φ (0 η 0t o X in X M
w j > X ’Τ σ X 01 X X ’Τ 0) X X Ο 4
γη X X X m X X X 4 01 ΓΗ X <0 α X
ΓΜ υ PJ Cu W 4 Oł to α
rł X > Η Η > X 4 X r-ł J z Μ
Η Μ) η Η Φ m rH (M H
188 641
Ο α» * Μ
σι X
Λ C9
Ρ* C9 Η Μ > (->
10 Ο b
ΙΛ Ot οι X ϊ-
«Τ Μ u
Π Ο· > U fr- a
Pi ο et
Η ta 0 σ X H
Γ Η b Η
01 Οι
09 b U
ρ* < Ο
φ >»
σι ε ί-1 α W
Μ* w
1*1 χ α α
η ο κ
Η > Ρ <
ο φ ω ο ot 14 >
01 α <4
β X
Γ* ε Μ κ tu J
φ X « 14
φ Μ >
Μ b
η α ω
«Μ χ
r-ł ι~ι
451
O Ul X H
01 a z
eo Ctf X
P* ε H
Φ o z H
Ul o
o
ni 0 • 6- < > W
Ci b
r-ł ot ta
O O ui b W U
<n H > e-
« > 5f a
P\ ta H H z W
Φ u a 0 « e-
Ul X ta Z X
X W X
ci M σ X h Q
Cł X a en 0 U
H «< E-i H a 0
o oi <3* a >
Ol 0 ta
00 a
P* « 03
Φ t* > ω
Ul u
σ u K
Cł >4 t- H4
Ci 0
r-4 e-
H <O
O u· «Π ot
01 Ο» M Z »
o > X K
P* > M
Φ z A X
Ul ot
TJ* 14 0& «0
n ai iL Z W
Cł 14 tt
H H ta
ocs 1 b
01
co > H
r* 0 eo
φ U M b
Ul a u h
* w 14
1*1 H >
« 14 0! E-« O u
H > W
o Cl Ul > a
Ol li
CO >·
P- X z
Φ > b
m U
u X
m ea X &
Cl OS w
r-4 X ai
H rł lA
188 641
Ο Γ* σι u > o o U3 σ 4 W Ot O n <0 o X
01 Ε- 4 o\ u 01 X 4
00 X 4 M > 03 4 X «0 H fa X X >4
ί* « 4 eu r* « O r» o M X a X
ίο 4 > OS o μ te σ >4 X
«η 4 w σ «η 4 X w
μ· α 4 4 Ό M* σ OŚ 4
η ε m ca 4 Q O <*1 o ~T
CM Η CM M CM o u X
Η 0) H 4 W 4 X O O
1 seo σ 0} 1 5901 OS X tt O CM 0 4 W
01 4 91 4 Λ >· b 4
C0 4 00 4 co X E-> ta
ί* Ο (Λ (** X c* «
10 u vo X ta a 10 > 4 H
ιη b > tn o· 91 4
V Ο <f a* M1 >4 0>
1*1 4 W 0» m a s m W > 4
CM b Ul ►a H CM > CM X
Η 4 X > b ►4 H W H 4 4 E->
( 550 4 > X o 00 w (3 a O H 10 O X
<λ σ 9* n 4 01 4
00 Η > 4 X 00 4 X CD CM
Γ* ω Η E- 4 4 Γ* >4 > r· 4 X
u> ο b > 10 a X 4 4 <n 10 H >
Ul > W 4 ω ot X 91 o
Μ» 4 Μ» 4 H b 4 M· X
«; m a X b m > W
(Μ 4 a CM > O CM E- V)
Η ca σ H E- 4 iH 4
Η μ· υι H r* m H O 10
188 641
Ο KO KO b X
A X b 4 Z
A Z Z a
«* z o o O z
KO z
W M fc
* σ o X OT z
cł u o z A z
Cl 4 X o > α
<a b z o
o 10 KO z « b
A z «
A ea O OT
t* z
KO OT b 4
KA 4 OT tu z
M* Z
ci Z
w ft. Z
H >
o ·* 4 b Z a, ω
0» b
A b 0< b
C* O
A W >
A •4 b a W 4
z &
Cl O
<N OT z
H os
H Pł KO
O A KO u o >
A z
A z w σ z
C* u O o
KO σ
in o
z H • b ta >
ci σ » 4
CM OT 4
rł a O O z
o A KO u b a »
Λ W 4
A u H $
A b z
KO a b b.
A H
M· »4 b M > «
rł OT Z o α z
d b OT
rł b b W
O i*» OT Z OT z
A Z α w OT
A W >
r* M >4 a o
KO a Z o·
A α U
5ł· z
Cl u σ z
C4 ε j w α
H z
H KO KO
O CM Γ* X M
A K >
A a 4
r* >4 W
OT z a
A W
* b CO
n a •
w u
rł z
O rl r· z o z
O) b to
A w
P* z OT σ Q
A tu OT b 4
A z
Μ» z OT
Cl •z
et 4
H OT Z O
o o 4 b Z
A Z
A z U 0) σ
r· Q Z
KO >4
A W o 4 z α
M* 4
Cl 4
CM U a 4 z
1“♦ O 4 ot z
w A KO
188 641
1 7501 Oh 4 1 7801 a σ o fc 4 O •n oo H £-i > o a
σι «1 σι W > <9 Z a oi 4 a O
00 4 α a 2 oo 4 4 M
r* Ol r* a H 0 a c* 4 fc o
to « O w Q O Oi a w Q 2 a
tn fc tn a a Ul a fc a
* <9 Q o 4
o α «c Cl a b C9 u r*i a 4 • a
N Λ a 2 Ct u α Cl X a o
H > fc W r-( o i-l fc
ο η» e> a a 2 | 770 | σ o o 00 a u 4 fc
ot X a a 01 M σ Ol fc a 2
00 > H 00 u o 1 CD 4 a K
P· > W 4 r* u α Γ* υ fc H o
φ a o 2 UJ W t· UJ 4 u W
Ul 4 fc Ul o a a Ul a fc 2 4
<r > H n* u a o Ό a 2 O
Cl 4 a i- W Cl Ol 4 o Cl 4 U
Cl fc Z Cł a Ο» F« Cl α
H > M T“t Q o « H α U > 19 t-
ο Cl r* W > O w r* Ol 4 Λ o σι r* 2 fc
σι a a oi o H Ol Η fc 4
CO 4 > 00 a M 0 o «9 4 σ
r· σ 0l Ol f* Oi a C- 4 fc Oi σ
to > W UJ H > t- 4 o U> 4 a
Ul 4 W Ul CU X Z W Ul en fc 4 υ
* 0 4 Μ» 4 < Oi fc o
Cl a 4 ci X tf 4 Oi m z α 32 fc en
fN > w Cl H (M > 4 Ot
H > < H σ rM 4 < m
H <-(
N Ul 03
p* r* Γ*
188 641
840 1 4
Α U
00 Ο 2 cd
Γ* W w o X 4
Α »
Α X
V a 4 H<
<*t 4 > £ X
04 4 >
w X Ol «* u
ο η ο X O
<η X 4 U σ
Ο X a K
Ρ* Μ X
Α Ci K u
Α 2 o w > x
Μ· « a X
η 3 4
Ν O 4 Ht
Η et O 4
ο <Μ 00 cd X 4
Α o X et
Ο >4
Γ* 4 w X X
Α M a <n X
Α > W 4
* H X < 4 >
Pt 2 2
CM £- < > Σ
Η > < W
811
O H- « X υ 4 a >
A rt! W X > b
a O as 2 X
r* a K
A > <«
A > M O <
μ» ω 4 2
p> w
CM > W 2
H X 0 2
a A 00 a .
A X
Λ o « f* 3
c* u β X
A < X
A >
M· 2 co
Pl H >
CM
c-4 X H > 4
1 0S8 | 2 X
A 2 a X
09 4 b >
C* 4 2 2
A 0) 2
A > H CO X
M* 2 > X
n W
ΓΜ 2 H A
r4 id et o
rM M« ® --
A A 4 σ >
O 4
r* HI 4 2 X ca
A X σ
A u 2
M1 4 b 2
Pl O
CM o
ri cd
880 HI >
A X
A X X
0» a> X
A H >
A 2 2
M· 2 4 H
Hł b >
ΓΜ X o HI
H 0& o X
~4 Γ- ΟΟ
188 641
Opierając się na powyższych przykładach konkretnych zastąpień, można wykonać alternatywne zastąpienia w rutynowych doświadczeniach, w celu dostarczenia alternatywnych EPV według wynalazku, np. przez wykonanie jednego albo wielu zastąpień, wstawek albo usunięć w białkach otoczki albo EPV, które wywołają różnicującą reakcję odpornościową.
Odmiany sekwencji aminokwasowej w EPV można wytworzyć, np. przez mutacje w DNA. Takie EPV obejmują, przykładowo, usunięcia, wstawki albo zastąpienia nukleotydów kodujących różne reszty aminokwasowe w sekwencji aminokwasowej. Oczywiście, mutacje, które wykonuje się w kwasie nukleinowym kodującym EPV nie mogą powodować przesunięcia ramki odczytu i korzystnie nie tworzą domen komplementarnych, które powodują wtórne struktury mRNA (patrz, np. Ausubel (1995 rev.), niżej; Sambrook: (1989) niżej).
Kwas nukleinowy kodujący EPV można również wytworzyć przez amplifikację albo ukierunkowaną mutagenezę nukleotydów w DNA albo RNA kodującym białko otoczki albo EPV, a następnie przez syntetyzowanie albo odwrotną transkrypcję kodującego DNA, w celu wytworzenia DNA albo RNA kodującego EPV (patrz, np. Ausubel (1995 rev.), niżej; Sambrook (1989) niżej) w oparciu o zawartą tu wiedzę i wskazówki.
Rekombinowane wirusy wyrażające EPV, rekombinowane EPV albo kodujące je wektory kwasu nukleinowego obejmują skończony zestaw sekwencji kodujących EPV, jak zastąpione nukleotydy, które specjalista może rutynowo otrzymać, bez niepotrzebnego eksperymentowania, w oparciu o zawartą tu wiedzę i wskazówki. Dla szczegółowego opisu chemii i struktury białek, patrz w Schulz i in., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nowy York, NY (1978) i Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman & Co., San Francisco, CA (1983) . Zastąpienia sekwencji nukleotydowej, takie jak preferencje kodonów, opisano w Ausubel i in., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., Nowy York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) (dalej, Ausubel (1995, rev.) w §§ A.l.l-A.1.24; Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) w dodatku C i D.
Tak więc specjalista, posiadając wiedzę i wskazówki tu zaprezentowane, powinien wiedzieć w jaki sposób zastąpić inne reszty aminokwasowe w innych pozycjach DNA albo RNA env w celu otrzymania odmiennych EPV, w tym odmian substytucyjnych, delecyjnych albo insercyjnych.
Testy przesiewowe na aktywność HIV
W celu przeszukiwania aktywności przeciw-HTV surowic od osobników szczepionych szczepionką według wynalazku, można zastosować dowolny znany i/lub przydatny test przesiewowy znany w stanie techniki. Przykładowo, znane testy HTV obejmują testy zakaźności wirusa (patrz, np. Chasebro i in., J. Virol. 62:3779-3788 (1988); Aldovini i in., wyd., Techniques in HIV Research, str. 71-76 (1990)); testy neutralizacji (patrz, np. Golding i in., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:633-643 (1994); Hanson, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:645-648 (1994); Laal i in., Res. Hum. Retrovir. 9:781-785 (1993); Hanson, J. Acguir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)); testy jednojądrzastych komórek obwodowych (PMN) (patrz, np. Arduino i in., Antimicrobial Agents Chemother. 37:1095-1101 (1990)); i testy limfocytów T cytotoksycznych (CTL) (patrz, np. Hammond i in., J. Exp. Med. 176:1531-1542 (1992); McElrath i in., J. Virol. 68:5074-5083 (1994); Walker i in., Cell. Immunol. 119:470-475 (1989); Weinhold i in., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:1373 (1992)). Inne odpowiednie aktywności, same albo w dowolnej kombinacji, obejmują, choć nie są ograniczone do ilościowego i/lub jakościowego pomiaru transkrypcji, replikacji, translacji, inkorporacji wirionów, zjadliwości, produkcji wirusa i/lub morfogenezy.
Konkretne wykonania: Rekombinowany wirus krowianki kodujący EPV, szczepionki polienv i materiały i metody ich wytwarzania i zastosowania
Przegląd. Rekombinowane wirusy krowianki (VV) wyrażające białka otoczki HIV (np. gp41; gpl20 i/lub gpl60 albo ich części) dostarczają materiałów przydatnych do wytwarzania i badania mieszanych szczepionek, które wywołują przynajmniej jedną humoralną albo komórkową reakcję odpornościową przeciwko wirusowi, jak również do analiz determinant limfocytów B i CTL.
188 641
Szczepionka polienv według wynalazku składa się z mieszaniny n różnych rekombinowanych wirusów krowianki, gdzie n jest liczbą całkowitą od około 4 do około 10000 (albo w dowolnym zakresie albo wartości w tym przedziale), w której każdy konstrukt wektora krowianki wyraża odmianę białka otoczki HIV (EPV) (np. gp41, gp120, gp160). Rekombinowany wirus krowianki koduje funkcjonalnie EPV i jest wytwarzany przez rekombinację VV typu dzikiego plazmidem. Liczne, osobne plazmidy kodujące EPV można wytworzyć przez zastąpienie jednej sekwencji kodującej EPV inną, np. przy użyciu fragmentów restrykcyjnych albo mutagenezy.
Wytwarzanie rekombinowanych wirusów krowianki. Sposoby wytwarzania poszczególnych plazmidów (z których każdy wyraża unikalną sekwencję białka HIV) mogą wykorzystywać amplifikację DNA albo RNA do zastępowania izolowanych sekwencji odmian białka otoczki w wektorze (np. pVenv4 albo pVenv1 (Hallenberger i in., Virology 193:510-514 (1993)), który to wektor koduje znaną sekwencję białka otoczki HIV (np. dostępną z NLAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD).
Sposoby amplifikacji RNA albo DNA są dobrze znane w stanie techniki, i mogą być stosowane w rozwiązaniach według wynalazku bez nadmiernego eksperymentowania, w oparciu o zawarte tu wskazówki i wiedzę. Znane sposoby amplifikacji DNA albo RNA obejmują, choć nie są ograniczone do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i pokrewnych procesów amplifikacji (patrz, np. patent USA nr 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188 Mullis i in.; 4,795,699 i 4,921,794 Tabor i in.; 5,142,033 Innis; 5,122,464 Wilson i in.; 5,091,310 Innis; 5,066,584 Gyllensten i in.; 4,889,818 Gelfand i in.; 4,994,370 Silver i in.; 4,766,067 Biswas; 4,656,134 Ringold) oraz amplifikacji za pośrednictwem RNA, który wykorzystuje antysensowny RNA w celu ukierunkowania na sekwencję jako matrycę do syntezy dwuniciowego DNA (patent USA 5,130,238 Malek i in., pod znakiem towarowym NASBA).
Przykładowo, konstrukt rekombinowanego wirusa krowianki wytworzony tym sposobem można zastosować do immunizacji i wywołania reakcji limfocytów T i/lub B swoistych wobec HIV. Startery wykorzystują zakonserwowane sekwencje HIV i z powodzeniem amplifikują geny env z próbek wielu różnych pacjentów z HIV. Podstawowe techniki opisane tu mogą być podobnie zastosowane z PCR albo innymi rodzajami starterów amplifikacji, w celu zastąpienia mniejszych lub większych fragmentów sekwencji env z izolatów polowych przez spotykane w wektorach kodujących białko otoczki HIV (patrz, np. Ausubel (1995 rev.), niżej; Sambrook (1989) niżej).
Kwasy nukleinowe kodujące EPV. Technika rozpoczyna się izolacją DNA z komórek zakażonych HIV i amplifikacją sekwencji env przez PCR. Produkty PCR albo innych amplifikacji dostarczają najprostszego sposobu izolacji sekwencji HIV, ale można zastosować dowolną znaną metodę taką jak klonowanie i izolacja sekwencji kodujących EPV albo białek (patrz, np. Ausubel (1995 rev.); niżej; Sambrook (1989) niżej). Do sekwencji starterów PCR albo innych amplifikacji korzystnie włącza się miejsca enzymów restrykcyjnych w celu ułatwienia klonowania genów.
Wyizolowany DNA do PCR można wytworzyć z licznych źródeł wirusa, w tym świeżej albo mrożonej krwi pełnej od pacjentów HIV+ i komórek, które zakażono in vitro izolatami wirusa.
W celu wytworzenia nowych konstruktów env HIV korzystnie stosuje się reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji 100-2700 par zasad (bp) genu env z każdej z różnych próbek pacjentów z HIV. Startery PCR mogą stanowić dobrze zakonserwowane sekwencje HIV, które są przydatne do amplifikacji genów env ze znanych próbek genów env, wyizolowanych HIV albo próbek różnych pacjentów z HIV. Amplifikowany DNA korzystnie obejmuje część kodującą 10-900 (jak np. 100-400, 400-600 albo 600-900, albo dowolna wartość w tym zakresie) aminokwasów gp120 i gp41 (które to oba tworzą gp 160). Do produktów PCR korzystnie włącza się jeden albo wiele regionów zmiennych (V1-V5) i stałych (C1-C5 otoczki, korzystniej większość spośród regionów V1, C1, V2, C2, V3, C3, V4, C4 i V5. Oprócz tego, amplifikowane sekwencje kodują 1-200 aminokwasów po miejscu cięcia gp120/gp41. Korzystnie, amplifikuje się większość albo całość genu env. Ewentualnie, amplifikowana sekwencja kodująca gp160 pozbawiona jest części albo całości sekwencji ko26
188 641 dujących domenę śródbłonową i/lub domenę cjtpelazmatyczpą (patrz, np. Halletberger i in., (1993)).
Startery PCR można tak zaprojektować, że miejsca enzymów restrykcyjnych flankują sekwencję genu otoczki w plazmidzie krowianki, w taki sposób, że są one włączane do produktu amplifikacji DNA. Przez zastosowanie dobrze znanych technik klonowania przez zastępowanie, pochodne plazmidu krowianki, które wyrażają sekwencje odmian białka otoczki od 1-10000 pacjentów można wytworzyć przez zastępowanie częściami sekwencji kodującej EPV pacjentów odpowiednich części sekwencji eny plazmidu krowianki, np. przez zastosowanie do zastępowania fragmentów restrykcyjnych. Przykładowo, plazmid pVopy0 i produkty PCR traktuje się KppI i BsmI w celu uzyskania sekwencji kodującej okrojone gp160 o aminokwasach 1-639, która pozbawiona jest domeny śródbłopowoj i domeny cytoplazmatycznej gp01 (patrz, np. Hollotbergor i in., (1993)).
Po ligacji produktu PCR i produktów pVeny0, mieszaniną ligacyjną transfekuje się komórki gospodarza bakteryjnego dowolną spośród znanych w dziedzinie metod obejmujących np. elektroeorację, po czym wybiera się rokombinowape kolonie i bada przez sekwopcjppowαpio.
Rokpmbipowapo konstrukty wirusa krowianki kodujące białka otoczki HIV. Krowiankę kodującą EPV poddaje się rekombinacji z wirusem typu dzikiego w komórce gospodarza i selekcjonuje się łysinki wirusa wyrażającego EPV i tworzy się banki wirusa. Banki wirusa jako enyVV, zawiorająco różne sekwencje kodujące EPV miesza się stosując erzjnajmnioj 0-00 i do około 10000 różnych wirusów rekombinowanych, tworząc szczepionkę polieny według wynalazku.
Rokpmbipowano plazmidy krowianki zawierające sekwencje EPV ewentualnie sekwoncjonujo się albo przesiewa stosując przeciwciała swoiste wobec białek otoczki HIV, w celu identyfikacji różnych EPV. Korzystne jest sekwencjonowatie metodą rozrywania łańcucha didozoksypuklootydami Satgora. Procedurę korzystnie adaptuje się z uprzednio opisanych sposobów (Sambrook i in., (1989), niżej., United States Biochemicals, Sdquopasd yorsiop 2,0 - DNA Sequoncing Kit, wydanie 9, Amersham Lifo Sciences, Inc., (1990)) i powinno się odczytać około 50-300 bp od miejsca startera.
Sposoby wytwarzania wektorów ekspresyjnych W/ są dobrze znano (patrz, np. Mackott i it., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7015-7019 (1982); Panicali i Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:0927-0931 (1982); patent USA tr 0,169,763; Mazzara i it., Moth. Enzymol. 217:557-581 (1993), Ausubel i in., niżej, §§ 16.15-16.19). Opisany uprzednio wektor pSC11 (Chakrabarti i in., Mol. Coll. Biol. 5:3003-3009 (1985)) można korzystnie zastosować do wytworzenia plazmidu kodującego opy, takiego jak pVony0.
Jako wektor wirusowy, wirus krowianki ma wiolo przydatnych coch, w tym pojemność umożliwiającą klonowanie wielkich fragmentów obcego DNA (powyżej 20 kb), zachowanie zakaźności po wprowadzeniu obcego DNA, szeroki zakres gospodarzy, względnie wysoki poziom syntezy białka i wygodny transport, wydzielanie, obróbkę i modyfikacjo eptrapslacyjno, spowodowane strukturą pierwszorzędową wyrażanego białka i zastosowanego rodzaju komórek gospodarza. Przykładowo, glikozylacja -O i -N, fosforylacja, mirystylacja i cięcie, jak również łączenie wyrażanego białka zachodzi w sposób wiarygodny.
Opracowano kilka odmian wektora krowiatki i są one przydatne do zastosowania w wynalazku (tp. Ausubel i it., niżej, §§ 16.15-16-19). Najpowszechniej, po uzyskaniu banku wirusa (Ausubel i in., piżoj, $$ 16.15) sekwencję nuklootydową kodującą EPV umieszcza się pod kontrolą promotora wirusa krowianki i poddaje się integracji do gotomu krowiatki w taki sposób, żo zachowuje ota zakaźność (Ausubol i in., niżej, §§ 16.17). Alternatywnie, można uzyskać ekspresję przez transfekowanie plazmidu zawierającego gen pod kontrolą promotora krowianki kodujący EPV, do komórki zakażonej krowianką ty^u dzikiego.
Korzystnie, komórka gospodarza i wektor krowianki są przydatno i zatwierdzono do zastosowania w szczepieniu ludzi i zwierząt. Te rekombinowane wirusy poddaje się charakteryzacji z użyciem znanych metod (Ausubel i it., niżej, §§ 16.18). W jeszcze dalszej odmianie, łańcuch pjlimbrazy RNA bakteriofaga T7 można poddać integracji z genomem krowiatki, w taki sposób, żo sekwencjo kodujące EPV ulegają ekspresji pod kontrolą promotora T7, w transfekowapym osoczu, plazmidzie albo rekombinowapym wirusie krowiatki.
188 641
Zastosowanie promotorów wirusa ospy jest korzystne ponieważ promotory komórkowe i innych wirusów nie są zwykle rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny krowianki. Promotor wczesno-późny jest korzystnie stosowany w rekombinowanej krowiance do szczepionek polienv, ponieważ pożądane jest wyrażenie EPV jako antygenu, który jest prezentowany w komórce gospodarza zakażonej rekombinowanym wirusem krowianki, w połączeniu z głównym układem zgodności tkankowej (MHC) klasy I albo II. Takie białko otoczki HIV związane z MHC powinno stworzyć cel dla limfocytów T cytotoksycznych i zapoczątkować u szczepionych ssaków reakcję limfocytów T cytotoksycznych i/lub reakcję humoralną przeciwko wyrażanym EPV HIV, Spowodowane jest to zdolnością wektorów wirusa krowianki do indukowania prezentowania MHC w komórkach gospodarza tego rodzaju antygenów, która słabnie w późnych etapach zakażenia. Pojawiające się wcześnie transkrypty kończą się po sekwencji TTTTTNT i prowadzą do nieadekwatnej prezentacji MHC.
Alternatywnie, takie motywy terminacji w sekwencji kodującej genu można zmienić przez mutagenezę, jeżeli stosowany jest wczesny promotor wirusa ospy, w celu zwiększenia prezentacji MHC antygenów białka otoczki w komórkach gospodarza (Earl i in., niżej, 1990). W celu naśladowania mRNA wirusa krowianki, nie ulegającą translacji sekwencję liderową 3' zwykle utrzymuje się krótką, jeżeli stosuje się je w plazmidach krowianki zawierających sekwencje kodujące EPV HIV.
Korzystnie, plazmid według wynalazku zastosowany do wytworzenia konstruktów krowianki zaprojektowano z miejscami endonukleaz restrykcyjnych w celu wprowadzania genu env poniżej promotora krowianki (Ausubel i in., niżej, §§ 16.17). Korzystniej, Plazmid zawiera już sekwencję kodującą białko otoczki, w której występuje unikalne miejsce restrykcyjne w pobliżu obu końców sekwencji kodującej białko otoczki. Tym samym fragmentem restrykcyjnym sekwencji kodującej EPV można zastąpić odpowiednią sekwencję w plazmidzie. W takim przypadku, główną część sekwencji kodującej EPV można wprowadzić po usunięciu większości albo całości sekwencji kodującej białko otoczki z plazmidu.
Korzystnie, powstały konstrukt krowianki (zawierający sekwencję kodującą EPV oraz promotor krowianki) flankuje się DNA krowianki w celu umożliwienia rekombinacji homologicznej, gdy plazmid transfekuje się do komórek, które uprzednio zakażono wirusem krowianki typu dzikiego. Flankujący DNA wirusa krowianki jest dobrany w taki sposób, że rekombinacja nie przerwie żadnego z istotnych genów wirusa. ·
Bez selekcji, odsetek wirusów rekombinowanych do rodzicielskich wynosi około 1:1000. Jakkolwiek taka częstość wystarcza do zastosowania hybrydyzacji łysinkowej (Ausubel i in., niżej, §§ 6.3 i 6.4) albo immunologicznego testu przesiewowego (Ausubel i in., niżej, § 6.7) w celu wybrania rekombinowanych wirusów, stosuje się wiele sposobów ułatwiających identyfikację rekombinowanego wirusa. Nie ograniczające przykłady takich technik selekcji albo przesiewania są znane w stanie techniki (Ausubel i in., niżej, § 16.17). Zwykle, kaseta ekspresji jest flankowana przez segmenty genów kinazy tymidynowej (TK) krowianki, tak, że rekombinacja powoduje inaktywację TK. Wirusa o fenotypie TK-można odróżnić od posiadających fenotyp TK+ przez zakażenie linii komórkowej TK- w obecności 5-bromo-dezoksyurydyny (5-BrdU), która ulega fosforylacji przez TK aby zostać letalnie wbudowana do genomu wirusowego. Alternatywnie albo dodatkowo, wirusy rekombinowane można wyselekcjonować przez równoczesną ekspresję bakteryjnego genu oporności na antybiotyk, taki jak ampicylina (amp) albo transferazę fosforybozylo-guaniny (gpt). Jako dalszy przykład, równoczesna ekspresja genu lac Z E. coli umożliwia równoczesne przesiewanie łysinek wirusa rekombinowanego przy użyciu X-gal (Ausubel i in., niżej, $ 16.17).
Rekombinowane wirusy krowianki wyrażające EPV można ewentualnie atenuować albo inaktywować znanymi sposobami, takimi jak ciepło, traktowanie paraformaldehydem, napromieniowanie ultrafioletem, traktowanie propiolaktenem, tworzenie hybryd albo chimer albo innym znanym sposobem (patrz, np. Zagury i in, Nature 332:728-731 (1988); Ito i in., Cancer Res. 50:6915-6918 (1990); Wellis i in., J. Immunol. 99:1134-9 (1967); D'Horncht, Vaccine 10 (Suppl.):548-52 (1992); Selenka i in., Ach. Hyg. Bacteriol. 153:344-253 (1969); Grunwald-Bearch i in., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)). Przykładowo, inaktywacja ciepłem w 60°C powinna istotnie zmniejszyć miano wirusa. Takie techniki atenuacji testuje
188 641 się na bezpieczeństwo, ponieważ niekompletna atenuacja może spowodować śmierć pacjenta (Dorozynski i Anderson, Science 252:501-502 (1991)).
Taką atenuowaną albo inaktywowaną rekombinowaną krowiankę stosuje się, gdy pacjent ma osłabiony układ odpornościowy, ponieważ w przypadku podania żywej krowianki mogą nastąpić powikłania albo zgon.
Szczepionki według wynalazku, przydatne do szczepienia albo do podawania pozajelitowego albo doustnego, obejmują szczepionkę rekombinowanego wirusa polienv obejmującą przynajmniej 4, i do około 10000, korzystnie 4 do około 1000, a najkorzystniej około 10 do około 100 różnych wirusów rekombinowanych w postaci lizatu komórek, frakcji związanej z błoną, częściowo oczyszczonej albo w postaci oczyszczonej. Korzystnie, szczepionka polienv obejmuje lizat komórkowy zawierający rekombinowanego wirusa (albo jego frakcję związaną z błoną), który dalej obejmuje białka EPV już wyrażone przez rekombinowany wirus. Stwierdzono, że włączenie wyrażanych EPV zwiększa reakcję przeciwciał.
Szczepionki połienv mogą być w postaci sterylnych wodnych albo nie wodnych roztworów, zawiesin albo emulsji, i mogą również zawierać dodatkowe czynniki albo zaróbki znane w dziedzinie. Każdy spośród przynajmniej 4-40 do 10000 różnych wirusów koduje i wyraża inne EPV, jak to tu przedstawiono. DNA kodujące EPV można wyselekcjonować w taki sposób, że reprezentuje EPV występujące w konkretnej izolowanej społeczności pacjentów AIDS. Przykładowo, szczepionka może reprezentować sekwencje z Memphis, TN, i być przeznaczona do stosowania w Memphis, TN. Szczepionki zaprojektowane w sposób reprezentujący obszary ograniczone geograficznie mogą być również przydatne do zastosowania w społecznościach poza docelową społecznością.
Alternatywnie, DNA kodujące EPV można selekcjonować w sposób reprezentujący społeczności, miasta albo kraje odległe geograficznie, jako szczepy. Przykładowo, w jednej szczepionce polienv mogą być reprezentowane liczne klony. Kompozycja szczepionki polienv może dalej obejmować immunomodulatory, takie jak cytokiny, które zwiększają reakcję odpornościową na zakażenie wirusowe (patrz, np. Berków i in., wyd., The Merck Manuał, wyd. 15, Merck and Co., Rahway, NJ (1987); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 8, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery's Drug Treatment; Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, wyd. 3, AIDS Press, Ltd., Williams and Willkins, Baltimore, MD (1987); i Katzung, wyd., Basic and Clinical Pharmacology, wyd. 5, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992), które to cytowane tu odnośniki odzwierciedlają stan techniki.
Dla specjalisty w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że szczepionkę polienv można podawać pacjentowi w kompozycji obejmującej jedną lub więcej soli, buforów, adiuwantów albo innych substancji, które są pożądane do podwyższania skuteczności kompozycji. Adiuwantami są substancje, które można zastosować do swoistego zwiększenia przynajmniej jednej z reakcji odpornościowych. Normalnie, adiuwant i kompozycję miesza się przed prezentacją układowi odpornościowemu, albo prezentuje się osobno, ale w tym samym immunizowanym miejscu. Adiuwanty można z grubsza podzielić na kilka grup, w oparciu o ich skład. Grupy te obejmują diuwanty olejowe, sole mineralne (przykładowo A1K(SO4)2, AlNa(SO4)2, A1NH4(SO4), krzemionkę, kaolin, i węgiel, polinukleotydy (przykładowo, kwasy nukleinowe poli IC i poli AU) oraz niektóre substancje naturalne (przykładowo, wosk D z Mycobacterium tuberculosis, substancje spotykane w Corynebacterium parvum albo Bordetella pertussis oraz członków rodzaju Brucella). Wśród substancji szczególnie przydatnych jako adiuwanty są saponiny (np. Quill A, Superfos A/S, Dania). Przykłady materiałów przydatnych do zastosowania w kompozycjach szczepionek ujawniono np. w Osol, wyd., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), str. 1324-1341.
Szczepionka polienv według wynalazku może dalej zawierać przynajmniej jeden przeciwwirusowy związek chemioterapeutyczny. Nie ograniczające przykłady można wybrać spośród przynajmniej jednej grupy obejmującej gamma globulinę, amantadynę, guanidynę, hydroksybenzimidazol, interferon-a, interferon-β, interferon-γ, interleukinę-16 (IL-16, Kurth, Nature, grudzień 8, 1995); tiosemikarbazony, metisazon, rifampinę, ribavirinę, analog pirymidyny (np. AZT i/lub 3TC), analog puryny, foscamet, kwas fosfonooctowy, acyclovir, didezoksynukleozydy, inhibitor proteazy (np. saquinavir (Hoflmann-La Roche); indinavir (Merck);
188 641 ritonavir (Abbott Labs); AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78 (Glaxo Wellcome); chemokiny takie jak RANTES, ΜΙΡ-Ια albo MIP-Ιβ (Science 270:1560-1561 (1995)) albo ganciclovir.Patrz, np. odpowiednio, Richman, AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:1065-1071 (1992); Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:149-164 (1993); Antimirob. agents Chemother. 37:12071213 (1993); AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:901 (1994); Katzung (1992), niżej, oraz cytowane tam odnośniki na stronie 798-800 i 680-681.
Zastosowanie farmaceutyczne
Podawanie szczepionki polienv (albo wywołanych przez nią surowic) może być w celu „profilaktycznym” albo „terapeutycznym”, i korzystnie jest w celach profilaktycznych. Przy podawaniu profilaktycznym, żywą szczepionkę polienv podaje się przed wykryciem albo objawami zakażenia HIV albo choroby AIDS. Podawanie profilaktyczne związku (związków) służy zapobieganiu albo atenuacji ewentualnego późniejszego zakażenia HIV.
W celu terapeutycznym, szczepionka polienv podawana jest po wykryciu objawów istniejącego zakażenia. Podawanie żywej szczepionki polienv po zakażeniu HIV jest podawane wyłącznie wtedy gdy stwierdzi się, że układ odpornościowy pacjenta jest zdolny do reakcji na podanie żywej szczepionki polienv bez istotnego ryzyka nieodpowiednich komplikacji albo śmierci, przy czym podawanie żywego wirusa odbywa się w pożądanych dawkach, które służą osłabieniu istniejącego zakażenia HIV.
Alternatywnie, gdy układ odpornościowy pacjenta jest osłabiony, podawanie terapeutyczne korzystnie obejmuje zastosowanie szczepionki wirusowej atenuowanej albo inaktywowanej, przy czym wirusy rekombinowane są atenuowane albo inaktywowane, jak to opisano wyżej. Patrz, np. Berków (1987), niżej; Goodman (1990), niżej; Avery (1987), niżej i Katzung (1992), niżej, Dorozynski i Andersen, Science 252:501-502 (1991).
Szczepionka określana jest jako „farmaceutycznie dopuszczalna” jeżeli jej podanie jest tolerowane przez pacjenta. Środek określany jest jako podawany w „ilości skutecznej terapeutycznie albo profilaktycznie” jeżeli podawana ilość jest istotna fizjologicznie. Szczepionka według wynalazku jest istotna fizjologicznie, jeżeli jej obecność wywołuje wykrywalne zmiany w fizjologii biorcy, korzystnie przez zwiększenie reakcji odpornościowej humoralnej albo komórkowej na HIV.
Zapewniana „ochrona” nie musi być całkowita, tj. zakażenie HIV albo choroba AIDS nie musi być całkowicie wykluczona albo wykorzeniona, zakładając, że występuje istotna statystycznie poprawa względem populacji kontrolnej. Ochrona może być ograniczona do ograniczenia zaawansowania albo gwałtowności wystąpienia objawów choroby.
Farmaceutyczne sposoby podawania
Szczepionka według niniejszego wynalazku powoduje odporność na jeden lub więcej szczepów HTV.
Tak więc niniejszy wynalazek odnosi się i dostarcza środków do zapobiegania i osłabiania zakażenia powodowanego przez przynajmniej jeden szczep HTV. Niniejsza szczepionka zapobiega lub osłabia przebieg choroby, co w znaczeniu tu utytym oznacza, że podanie jej osobnikowi powoduje albo całkowite lub częściowe osłabienie (tj. zahamowanie) występujących objawów lub przebiegu choroby albo całkowite lub częściowe uodpornienie osobnika na chorobę.
Przynajmniej jedna szczepionka polienv według niniejszego wynalazku może być podawana każdym sposobem, który osiągnie zamierzony cel z wykorzystaniem kompozycji farmaceutycznej tutaj opisanej.
Na przykład, szczepionkę można podawać różnymi drogami podawania pozajelitowego, takimi jak podskórna, dożylna, doskóma, domięśniowa, dootrzewnowa, donosowa, śródskórna lub dopoliczkowa. Korzystne jest podawanie podskórne. Podawanie pozajelitowe może być w postaci wstrzyknięcia w bolusie lub stopniowy wlew w czasie. Patrz np. Berków (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra i Katzung (1992), infra.
Typowy sposób podawania do zapobiegania, zahamowania lub leczenia choroby lub stanu, który może być złagodzony przez immunologiczną odpowiedź komórkową wywołaną przez swoiście komórkową czynną immunoterapię, obejmuje podawanie skutecznej ilości szczepionki, jak opisano powyżej, podawanej jako pojedyncze leczenie lub powtarzanej jako
188 641 wzmożenie lub dawki przypominające w danym okresie i obejmującej od tygodnia do około 24 miesięcy.
„Skuteczna ilość” szczepionki oznacza ilość wystarczającą do osiągnięcia pożądanego efektu biologicznego, w tym przypadku przynajmniej jednej: komórkowej lub humoralnej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie HIV. Jest zrozumiałe, że skuteczna dawka będzie zależeć od wieku, płci, stanu zdrowia i wagi biorcy, rodzaju podawanego jednocześnie leczenia, jeśli jest takie, częstotliwości leczenia i skutku jaki się chce osiągnąć. Zakresy dawek skutecznych podanych poniżej nie ograniczają wynalazku i pokazują korzystne zakresy dawek. Jednakże najkorzystniejszy sposób dawkowania będzie dopasowany do danego osobnika, co będzie zrozumiałe i określane przez specjalistów bez dalszych doświadczeń. Patrz, np. Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985) i Katsung (1992), infra.
Mówiąc ogólnie, dawkowanie dla osobników dorosłych będzie wynosiło od około 105-109 jednostek tworzących blaszki (pfu)/kg lub jednostek tworzących kolonie (CFU)/kg na dawkę, korzystnie 105-108. Jakakolwiek dawkowanie jest zastosowane, powinno być bezpieczne a skuteczna ilość powinna być określona znanymi metodami, jak to również tutaj opisano.
Osobnicy biorący udział w doświadczeniu
Biorcami szczepionki według niniejszego wynalazku może być każdy ssak, osiągający swoistą odporność na HIV przez komórkową lub humoralną odpowiedź immunologiczną, gdzie w odpowiedzi komórkowej pośredniczą białka MHC klasy I lub klasy II. Między ssakami, korzystnymi biorcami są naczelne (w tym ludzie, szympansy i małpy). Najbardziej korzystnymi biorcami są ludzie. Korzystnie osobnicy biorący udział w doświadczeniu są zakażeni HIV lub zapewniają model zakażenia HIV [np. Hu i in., Nature 328:721-723 (1987)].
Wynalazek opisany ogólnie będzie łatwiej zrozumiały w odniesieniu do poniższych przykładów, które dostarczono w celu ilustracji nie zaś jego ograniczenia.
Przykłady
Przykład 1: wytwarzanie wektorów wirusa krowianki do ekspresji białka env HIV
Nomenklatura. W celu ujednolicenia, rekombinowany konstrukt wirusa krowianki jest określany inaczej jako konstrukt VVenv, przy czym konkretne konstrukty wirusa krowianki zaprojektowane są zależnie od pacjenta albo instytucji depozytowej (np. ATCC albo GenBank, jako źródło DNA env w konstrukcie). Przykładowo, VVenv-Doe oznacza konstrukt wektora wirusa krowianki zawierający sekwencję env od anonimowego pacjenta, zaś VVenv-U28305 oznacza wektor wirusa krowianki zawierający sekwencje env znalezione w GenBank pod numerem dostępu U28305.
Szczepionka polienv składa się z 4-100 osobnych rekombinowanych wirusów krowianki, z których każdy wyraża unikalne białko otoczki HIV-1. Dla celów ujednolicenia, mieszanina końcowa wirusa określana jest jako polienv.
Wytwarzanie każdego z VVenv wykorzystuje plazmid określony jako pVenv4 oraz wirus typu dzikiego krowianki oznaczony NYCDH, opisany poniżej. Dalsze szczegóły można znaleźć w Ryan i in., „Preparation of Vaccinie Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization”, Immunology Methods Manual, wyd. Lefkovitz, Academic Press (1996).
Wektory i komórki gospodarza. Uprzednio opisany wektor pSC11 (Chakrabarti i in., Mol. Cell Biol. 5:3403-3409 (1985)) można zastosować do rekombinacji wielu genów HIV do genomu W. Elementy plazmidu pSC11 obejmują gen lacZ (gen reporterowy dzięki któremu można łatwo rozpoznać transformowane bakterie i rekombinanty W/, jako posiadające aktywność β-galaktozydazy), część genu kodującego kinazę tymidynową (TK) i gen oporności na ampicylinę (amp). Geny klonowane do pSC11 wprowadza się do genomu VV przez rekombinację homologiczną pomiędzy genem TK wirusa typu dzikiego i częścią genu TK zawartego w pSC11. Wprowadzenie plazmidowego DNA do wirusowego locus TK inaktywuje gen wirusowy, tak że wirusy rekombinowane można łatwo wyselekcjonować od wirusów TK+ tła, na podstawie wzrostu w bromodezoksyurydynie (BUdR). Aby rekombinowany wirus TKprzeżył tę selekcję, musi być hodowany na komórkach, które nie dostarczają enzymu TK, takich jak linia komórkowa TK-143, która jest pozbawioną TK pochodną ludzkiej linii mięsaka kości R970-5 (Rhim i in., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975)), która podtrzymuje wzrost VV (Weir i in., niżej (1982)). Wytwarzanie segmentu genu HIV może polegać na wprowadzeniu w miej188 641 sce Smal wektora pSCl 1 całego genu. Geny pełnej długości można wyrażać pod kontrolą promotora p7.5K.
Jako alternatywa do klonowania kompletnych genów HTV, można zastąpić częściowo sekwencje genów HTV genami, które juz klonowano do pSCl 1. Przykładowo, wytworzono z pSCl 1 konstrukt określony jako pVenvl i wyrażający gen białka otoczki (env) HTV BH10 (Hallenberg i in., niżej (1993); Kilpatrick i in., J. Biol. Chem., 262:116-121 (1987)). Konstrukt można zastosować jako wektor rodzicielski w celu zastępowania i wyrażania różnych białek otoczki z izolatów polowych HTV. Podobnie, wektor określony jako pVenv4 skonstruowano z pSCll w celu ekspresji białka env HB10, okrojonego z wyłączeniem domeny śródbłonowej i cytoplazmatycznej kodującej sekwencję gp41, przy zachowaniu domeny oligomeryzującej (Hallenberger i in., niżej (1993)). Jak zauważy specjalista, określenie „domena oligomeiyzacyjna” oznacza część gp41, która umożliwia oligomeryzaację białek env, tj. oznacza strukturę wystarczającą do oligomeryzacji. Wektor pVenv4 koduje okrojoną gpl60 (również gpl60t; gpl40), która jak stwierdzono, tworzy struktury trzeciorzędowe podobne do przetworzonego oligomeru gp41/gpl20 (dimer, trimer albo tetramer) jakie występują na powierzchni komórek zakażonych HIV. Ta struktura trzeciorzędowa zachowana jest w postaci sekrecyjnej, jak i w postaci związanej z błoną (Hallenberger i in., niżej (1993)). Wektor ten jest korzystnie wykorzystywany jako wektor rodzicielski do zastępowania alternatywnie wyizolowanymi sekwencjami env.
W tym przykładzie, wytwarzanie konstruktu Wenv obejmuje zastosowanie pVenv4 i wirusa krowianki typu dzikiego NYCDH i odpowiednich komórek gospodarza, jak to opisano szczegółowo poniżej.
pVenv4. Wektor pVenv4 wytworzono uprzednio przez wprowadzenie sekwencji kodującej otoczkę HIV-1 do rekombinowanego wektora wirusa krowianki pSCll (Hallenberger i in., Virology 193:510-514 (1993); Chakrabarti i in., Mol. Cell Biol. 5:3403-3409 (1985)). Sekwencje HTV-1 uzyskano z laboratoryjnego banku żywego wirusa. Sekwencję tę określono jako „BH10” (Ratner i in., Nature 313:277-284 (1985)). Przy zastosowaniu technik PCR, można amplifikować unikalną sekwencję otoczki od pacjentów zakażonych HTV-1 i zastąpić nią sekwencję env BH10 tworząc nowy wektor. Przykładowo, do PCR można zastosować następujące startery:
(A) sensowny, położenie 5785 (Identyfikator Sekw. nr. 1 AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA (B) antysensowny, położenie 7694 (Identyfikator Sekw. nr 2) CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT (C) sensowny-Kpnl, położenie 5903 (Identyfikator Sekw. nr 3) GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT (D) antysensowny-Bsml, położenie 7659 (Identyfikator Sekw. nr 4) CCAGCGCTTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG (E) (ew.) sensowny-Drain, położenie 6153 (Identyfikator Sekw. nr 5) CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG (F) (ew.) antysensowny-Bsu36I, położenie 6917 (Identyfikator Sekw. nr 6) TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG
Sekwencja starterów jest od 5' do 3'. Podkreślono miejsca restrykcyjne (numerowane położenie opiera się na sekwencji BH10 (Ratner i in., Nature 313:277-284 (1995))).
Strategia PCR. W celu wytworzenia nowych konstruktów env HTV-I zastosowano reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji 1800 par zasad (bp)genu otoczki z czterdziestu różnych próbek od pacjentów z HTV-1. Startery PCR odpowiadają dobrze zakonserwowanym sekwencjom HIV-1, a więc z powodzeniem amplifikują geny env z wielu różnych próbek pacjentów HIV-1. Amplifikowany DNA obejmuje całe białko gpl20, z wyjątkiem 10 wysoce zakonserwowanych aminokwasów na końcu aminowym białka. Wszystkie regiony zmienne otoczki (VI-V5) zawierają się w produkcie PCR. Oprócz tego, amplifikowane sekwencje kodują około 100 aminokwasów poza miejscem cięcia dla gpl20/gp41.
Startery PCR zawierające miejsca enzymów restrykcyjnych KpnI i BsmI, które flankują sekwencję genu otoczki BH10 w pVenv4, wchodzą w skład produktów DNA.
188 641
Pierwsza runda PCR: w probówce 500 pl zmieszano:
pl startera A (Identyfikator Sekw. tr 1), 300 tg/pi;
I pl startera B (Identyfikator Sekw. tr 2), 300 pg/pl
2,5 pl 10 mM każdego z 0 dNTP;
pl DNA;
pl 10X bufora PCR; i HPLC H2O do 99 pl.
Rundy w urządzeniu „Thermal Cycler”:
Inkubacja w 95°C, 3 minuty w colu stopienia DNA;
cykli po: 1 mit. w 95°C; 2 min. w 05°C; 3,5 min. w 72°C.
Druga runda PCR: Reakcję PCR przygotowuje się jak wyżej, ale zo starterami C i D (pdeowib0pio, Identyfikator Sokw. tr 3 i 0) bez DNA. Objętość końcową doprowadza się do 95 pl. Reakcję pokrywa się olejem. Końcówką pobiera się 5 pl z poprzedniej reakcji PCR (z pod oleju). Próbkę miesza się z drugą mieszaniną reakcyjną, pod olejem i rozpoczyna się cykle jako poprzednio. Zwykle wystarcza 30 cykli. Pożądane jest śledzenie produktu przez pobieranie 2 pl co 10 cykli do analizy ta żelu, dopóki tie pojawi się wyraźny prążek wielkości około 1800 bp.
Przez zastosowanie dobrze znanych technik klonowania substytucyjnego, wytworzono pochodną eVeny0, która wyrażała sekwencję ety od jednego z 00 pacjentów, zamiast sekwencji otoczki BH10. Pokrótce, plazmid eVepy0 i produkt PCR cięto KptI i BsmI, po czym cięty pVeny0 puszczono ta żelu i wyizolowano większy fragment. Mniejszy fragment (1800 bp) onr BH10 usunięto. Cięty produkt PCR wyizolowano również i poddano ligacji z większym fragmentom pVepy0 tworząc chimeryczną sekwencję otoczki, zawierającą 1800 bp odmiottej opy z DNA pacjenta. Po ligacji produktu PCR i produktów eVeny, komórkę gospodarza bakteryjnego transformowano mieszaniną ligacyjną dowolnym sposobom znanym w dziedzinie, w tym przez blektroeρrację, po czym wybrano rekombitowapo kolonie i badano przez sokwbncjoppwαpib.
Plazmid pVony0 albo rokombitatt wytworzony z pVony0 ułatwia wprowadzanie gotów do gotomu wirusa krowiatki przez rekombinację homologiczną pomiędzy gonom kinazy tymidypowej (TK) wirusa typu dzikiego i sekwencjami TK w plazmidzie. Wprowadzanie DNA eVbny0 do wirusowego locus TK daje wirusa krowiatki z genem otoczki HIV-1 wyrażanym poO kontrolą promotora wczesno/późnego P7.5K. Wirus jest atenuowaty pod względem aktywności wzrostu z powodu zniszczenia locus TK. Dodatkowym elementom eVeny0 jest get lacZ, który koduje aktywności β-galaktozydazy. Aktywność lacZ można zastosować 0o selekcji rekombitantów wirusa krowiatki (patrz niżej).
Get otoczki wyrażany przez eVeny0 jest okrojony z wyłączeniem sekwencji śródbłonpwoj7C-końcowoU gp01. Woktor jest wyrażany jako struktura oligomoryczna, spotykana w komórce albo w postaci wydzielpiczej.
Wirus krowiatki NYCDH. Każdy nowy, podstawiony plazmid jest indywidualnie rokombitowapy z wirusom krowianki typu dzikiego NYCDH. Wirus ten otrzymano z ATCC (tr dostępu VR-325) i przoO zastosowaniem oczyszczono go przez selekcję łysinek (Buck i Paulipo, wyd., Amorican Typo Culture Collectlpp Catalogue of Atimal Virusos and Attisora, Chlamydiao atO Rickottsiao, wyd. 6, American Type Culture Colloctiop, Rock/ille, Maryland, (1990) str. 138).
Komórki gospodarza bakteryjnego. Plazmid można hodować ta dowolnych znanych komórkach, (patrz, Ausubol, niżej (1995 rer), §§ 16.15-16.19). Jednym z tie ograniczających przykładów są komórki DH5a.
Komórki pozbawiono TK. Transformację i substytucję wirusa krowianki wykonano ta ludzkiej linii komórkowej TK-103B, która jest pozbawioną TK pochodną ludzkiej linii komórkowej mięsaka kości R970-5 (Rhim i it., (1975), wyżej), która podtrzymuje wzrost VV (Woir i in., (1982), wyżej). Każdy rekombipant wirusa krowiatki zawierający unikalną sekwbncję otr HIV jest selekcjonowany na podstawie ekspresji genu lacZ (łysinki wirusa pokrywa się Bluo-gal i selekcjonuje na aktywność β-galakozydazy ocenionej wytworzeniom niebieskiego zabarwienia). Można wykonać Owio rundy PCR.
188 641
Przykład 2: Wytwarzanie szczepionki polienv
Komórki Vero. Końcowy etap wytwarzania obejmuje hodowlę n konstruktów VVenv na komórkach Vero świeżo zakupionych z ATCC (nr dostępu CCL81 albo Χ38) klonowanych i namnożonych do hodowli wirusa. Linia komórkowa Vero została zaaprobowana do wytwarzania szczepionek przez Światową Organizację Zdrowia (Hay i in., wyd., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, wyd. 7, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, (1992), str. 48).
Komórki Vero hodowano w pożywce DMEM (Bio-Whitaker), z dodatkiem glutaminy (Bio-Whitaker) i surowicy płodowej cielęcej inaktywowanej ciepłem (HyClone, Inc.). Alternatywnie, można zastosować pożywkę bezsurowiczą. Każdy konstrukt zaszczepiono na osobnej zlewnej warstwie komórek Vero i zebrano, gdy komórki zaczęły wykazywać efekty cytopatyczne z powodu zakażenia wirusem. Ekstrakty komórkowe płukano intensywnie PBS (Bio-Whitaker) po zebraniu i przed zamrożeniem. Komórki zniszczono przez zamrażanie-rozmrażanie, sonikację albo odwirowanie na małych obrotach w wirówce (ewentualnie). Porcje nadsączu przechowywano w -70°C. Białko otoczki występowało w lizacie w stężeniu wystarczającym do wywołania przeciwciała swoistego wobec otoczki HIV (wykrywane w ELISA) w modelu ssaka, nawet po atenuacji VV, np. po podgrzaniu do 60 °C przez godzinę.
Produkt szczepionki. Każdy bank wirusa (konstrukt VVenv) z komórek Vero indywidualnie mrozi się a następnie miareczkuje i bada pod względem bezpieczeństwa. Po zakończeniu testów, porcje każdego z wirusów miesza się uzyskując roztwór wirusa o aktywności 108 pfu/ml („pfu” jest skrótem od jednostek tworzących łysinki). Jeżeli wykorzystuje się 40 konstruktów VVenv, każdy z VVenv jest korzystnie reprezentowany w równej ilości w mianie 2,5x106 pfu/ml w szczepionce. Powinno to dać 1x108 pfu.
Badanie szczepionek polienv
Myszy. Myszy można zakażać przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1x107 pfu VV wyrażającego env. Przeciwciała można identyfikować przez ELISA na HIV albo w teście neutralizacji, jak to opisano powyżej, w trzy tygodnie po wstrzyknięciu VV.
Przed wytworzeniem szczepionki polieny do zastosowania u ludzi, podobne grupy wirusów wytwarza się w celu testowania szczepionki na myszach. Wirusy te podaje się myszom drogą dootrzewnową albo podskórną. Następnie badano przeciwciała surowicze swoiste wobec HIV-1 na aktywność w enzymatycznym teście immunosorpcyjnym (ELISA). Test obejmował wysianie całego, zniszczonego wirusa HIV-1 (HTWnm) na płytki ELISA i zablokowanie płytek albuminą surowicy bydlęcej. Następnie, dodawano próbki surowicy w rozcieńczeniach 1:100, 1:1000 i 1:10000 w roztworze soli buforowanym fosforanem. Test odczytywano przy użyciu koziej immunoglobuliny swoistej wobec mysich przeciwciał sprzęgniętej z fosfatazą alkaliczną oraz fosforanu p-nitrofenylu. Reakcję barwną zatrzymywano przez dodanie roztworu wodorotlenku sodu i odczytywano gęstość optyczną przy długości fali 405 nm w czytniku płytek ELISA.
Jak pokazano na fig. 2, pojedyncze zaszczepienie preparatem lizatu komórkowego o aktywności 106-107 pfu wirusa krowianki (zawierającego pojedynczą sekwencję kodującą białko otoczki HIV-1 i wyrażającego białko otoczki związane z błoną komórkową) wywoływało silną reakcję przeciwciał przeciwko HIV-1, która utrzymywała się przez czas trwania doświadczenia czyli przez sześć miesięcy. Taka reakcja przeciwciał była istotnie wyższa niż opisywane uprzednio. Tę wysoką reakcję przeciwciał można przypisać obecności w preparacie szczepionki białka związanego z błoną komórkową. Jak pokazano na fig. 3, rea^ty^Jte były . zależne od dawki. Słabszą reakcję obserwowano u ssaków, którym podawano dawkę 10 pfu, niż u ssaków, którym podawano dawkę 107 pfu.
Wytworzono również mieszaniny wirusa krowianki wyrażające różne białka otoczki HIV-1. Gdy myszy otrzymały 107 pfu mieszaniny pięciu wirusów, ich reakcja była zasadniczo identyczna co do wielkości jak reakcja przeciwko 107 pfu na pojedynczy rekombinowany wirus krowianki (fig. 4). Mieszanie wielu wirusów krowianki wyrażających env nie było do tej pory opisywane i oczekuje się, że zapewni to szerokie spektrum przeciwciał neutralizujących.
Ludzie. Przed badaniami klinicznymi wykonano testy na mieszanych roztworach wirusa, przy czym pierwsze dotyczyły zwiększania dawki oraz względów bezpieczeństwa.
188 641
W badaniu klinicznym badającym zwiększanie dawki obejmowało grupy po czterech ochotników. Każda grupa otrzymała następujące dawki szczepionki:
2x104pfu
2x105 pfu
2x106 pfu
2x107 pfu
Każdy z ochotników otrzymał mieszaną szczepionkę wirusa w 0,5 ml we wstrzyknięciu podskórnym.
Przykład 3: Indukcja odporności neutralizującej pierwotny izolat u szympansów, przez podanie poliwalentnej szczepionki wielu otoczek HIV-1 opartej na wirusie krowianki
Populacja izolatów HIV-1 jest wyposażona w szereg wyrafinowanych białek otoczki. Białka env są jedynymi białkami zewnętrznymi kodowanymi przez wirusa i celami przeciwciał, jednakże przeciwciała wywołane przeciwko jednemu izolatowi niekoniecznie neutralizują inny. Z tego powodu, wytworzono mieszaninę szczepionek przeciwko HIV-1, polienv wyrażający liczne białka env. Wytwarzanie szczepionki rozpoczyna się przez wytworzenie 30 osobnych rekombinantów VV, z których każdy wyraża osobne białko env. VVenv badano indywidualnie i w kombinacji (polienv) na modelu szympansów. Cztery szympansy immunizowano podskórnie trzema wstrzyknięciami pojedynczych VVenv (szympans 1 i 2) albo polienv (szympans 3 i 4), a następnie jednym wstrzyknięciem domięśniowym rekombinowanego białka gp120/gp41 w alumie.
Bezpieczeństwo stosowania wykazano u wszystkich czterech szympansów, z których tylko dwa wykazywały owrzodzenie w miejscu wstrzyknięcia. Próbki surowicy śledzono licznymi testami na wiązanie HIV i neutralizację. Przeciwciała szympansów 3 i 4 wykazywały wyższą jakość aktywności przeciwciał. Działanie neutralizujące wykazano zarówno przeciwko izolatowi laboratoryjnemu, jak i pierwotnemu izolatowi HIV-1, z których żaden nie występował w szczepionce. Tak więc, uczulanie limfocytów mieszanymi białkami env zapewnia obiecującą metodę dzięki której można wywołać wysokiej jakości przeciwciała przeciwko HIV-1.
Materiały i metody pVenv4, rekombinowany wektor VV. pVenv4 wytworzono uprzednio przez wprowadzenie kodonu stop do sekwencji env BH10 i wprowadzenie zmodyfikowanego genu otoczki env BH10 do pSC11. pVenv4 wyrażał białko env, które było okrojone przy aminokwasie 640, i było zdolne do wydzielania i oligomeryzacji. Wytwarzanie rekombinowanego VV, Venv4m wyrażającego okrojone białko env BH10 opisano uprzednio (Hallenberger i in., niżej (1993).
PCR do amplifikacji sekwencji env od osobnika zakażonego HIV-1. W celu amplifikacji sekwencji env HIV zastosowano PCR. Zasadniczo, próbki pochodziły z krwi osobników zakażonych HIV-1, pobranej do diagnostyki na HIV. Inne próbki pochodziły od osobników z klinicznymi objawami AIDS albo z produktów dostarczonych przez instytucje badające AIDS oraz gromadzące reagenty referencyjne. W przypadku próbek krwi, DNA wytworzono przez dodawanie do krwi albo zakażonych komórek kroplami buforu do lizy opartego na SDS i inkubację w 65°C przez 30 minut. Dodano pronazę w stężeniu 0,5 mg/ml, a następnie lizat inkubowano przez noc w 45°C. Wykonano dwie ekstrakcje fenolem, a następnie precypitację etanolem i zawieszono DNA w wodzie.
Standardowymi sposobami wykonano dwie rundy PCR na wszystkich próbkach DNA. Sekwencje starterów dobrano na podstawie opublikowanej sekwencji BH10 (Ratner i in., wyżej Nature 313:277-284 (1985). W celu otrzymania fragmentów obejmujących sekwencje ze wszystkich regionów zmiennych i części gp41, zastosowano startery PCR jak opisane w przykładzie 1. Produkty PCR klonowano przez zastąpienie do wektora pVenv4 stosując standardowe sposoby. Na nowych plazmidach wykonano sekwencjonowanie metodą Sangera z użyciem startera jjαtgtgtαaaattaaccccactctgtg (Identyfikator Sekw. nr 5).
Wytwarzanie VVerw. Nowe rekombinanty VV (VVenv) wytworzono przez transfekowanie komórek zakażonych VV (NYCDH,ATCC) nowo zastąpionymi plazmidami rekombinowanymi. Transfectam (Promega) i Lipofectamine (Gibco BRL) zastosowano w celu ułatwienia transfekcji, według instrukcji producenta. Następnie oczyszczono VV z łysinek.
Immunizacie. Lizaty komórek zakażonych VV podawano szympansom przez wstrzyknięcie podskórne. VVerw zastosowano pojedynczo albo w kombinacji. Całkowita ilość VV
188 641 w pfu była podobna w każdym wstrzyknięciu (około 107 pfu) na zwierzę. Domięśniowo wstrzykiwano mieszaninę około 40 pg gp120 (nr kat. 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 gg gp41 (nr kat. 036001, Intracel) i 500 gg ałunu (Rehsorphat Aluminum hydroxyide Adsorptive Gel, Intergen Co., Purchase, NY) we wstrzyknięciu.
ELISA. Wykonywano następujących pięć testów ELISA: ELISA nr 1, kliniczny test ELISA firmy Abbott, zakupiony w Abbott Laboratories i wykonany według instrukcji producenta, (HIVAB HIV-1/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) , EILSA nr2 : ELISA wykonana przez wysianie rekombinowanej MN-gp160 (Quality Biological, Inc., Gaithersurg, MD) w ilości 1 gg/ml. Płytki zablokowano i wykonano badanie z trzykrotnym rozcieńczeniem surowicy. Płytki płukano i oceniano przy użyciu przeciwciał przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętych z fosfatazą alkaliczną. ELISA 3: płytki ELISA pokryto 1 gg/ml LAI-gp120 (białko pochodzące z CHO, Intracel). Próbki surowicy rozcieńczano 1:100 i oceniano przy użyciu przeciwciał przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętych z fosfatazą alkaliczną (mysie przeciw ludzkim IgG1-AP, nr kat 9050-04, Southern Biological Associates, Inc., Birmingham, AL.) i fosforanem p-nitrofenylu. Odczyty OD zbierano przy długości 405 nm. ELISA nr 4 wykonano jak ELISA nr 3, z takim wyjątkiem, że płytki pokryto 1 gg/ml UlB-gp120 (białko pochodzące z bakulowirusa, Intracel, nr kat. 12001, Cambridge, MA). ELISA nr 5: Elisa wykonano jak ELISA 3, z takim wyjątkiem, że płytki pokryto 1 gg/ml lizatu wirusa IIIB (Organon Teknika Co., Durham, NY).
Test neutralizacji. Testy neutralizacji wykonano na izolatach laboratoryjnych i pierwotnych (Montefiori i in., J. Clin. Microbiol. 26:231-237 (1988); Montefiori i in., J. Infect. Dis. 173:60-67 (1996)). Izolaty laboratoryjne: wirusa zmieszano z rozcieńczeniem 1:20 każdej próbki surowicy i wysiano na komórki MT-2 albo CEM-x174. W celu oceny żywotności komórek zastosowano barwienie czerwienią obojętną. 35-40% zmniejszenie śmiertelności komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi określano jako efekt pozytywny. Izolaty pierwotne: wirusa zmieszano z próbkami surowic rozcieńczonymi 1:4 i wysiano na pobudzone PHA PBMC. Testy oceniano przez p24. Zmniejszenie zakaźności o co najmniej 75% w stosunku do kontroli uznawano za wynik pozytywny.
Wyniki
Wytworzenie nowych rekombinowanych wirusów krowianki VVenv. W celu wytworzenia nowych rekombinantów VV (VVenv), z których każdy wyraża unikalne białko env HIV-1, wyizolowano DNA z próbek HIV-1. Większość DNA pochodziła z krwi osobników nie wykazujących objawów choroby, prawdopodobnie po raz pierwszy badanych na HIV-1. Dodatkowe DNa pochodzące od pacjentów z AIDS oraz wirusów wywołujących AIDS dostarczono z AIDS Research and Reference Reagent Repository. PCR wykonano z dwiema parami starterów zawierających miejsca restrykcyjne KpnI i BsmI. Następnie fragmenty podstawiono do wektora pVenv4 przedstawionego na fig. 5 (pVenv4 oryginalnie wyrażający okrojone białko HIV-1, BH10) w miejsce restrykcyjne KpnI i BsmI. W ten sposób, sekwencje gp120 (VI-V5) i gp41 z BH10 zostały zastąpione przez odpowiednie sekwencje produktów PCR. Wytworzono nowe rekombinowane wirusy VV (VVenv) z każdym zastępującym plazmidem.
Metoda ta zapewnia prosty sposób, dzięki któremu można wprowadzać wiele różnorodnych sekwencji env do unikalnych rekombinantów VV (VVenv). Co ciekawe, większość z sekwencji była produktywna, co wskazuje, że sekwencje env w genomach prowirusowych (z których pochodziła większość produktów PCR) rzadko były uszkodzone. Wśród VVenv zastosowanych w mieszaninach szczepionek panuje niezwykła różnorodność.
Immunizacja szympansów pojedynczymi i mieszanymi VVenv. Cztery szympansy zastosowano do badania pojedynczych i mieszanych szczepionek rekombinantów Weiw. Schemat immunizacji pokazano na tabeli 2. Pierwsze trzy wstrzyknięcia zawierały WJ, podczas gdy ostatnie wstrzyknięcie zawierało kombinację gp120, gp41 i alumu podawaną domięśniowo. Szympansy 1 i 2 otrzymały tylko jeden wirus krowianki i odpowiednie białko otoczki, podawane w każdym z trzech wstrzyknięć. Szympansy 3 i 4 otrzymały mieszaninę 10 rekombinowanych VV (i odpowiednie env w pierwszym wstrzyknięciu), dziesięć dodatkowych env w drugim wstrzyknięciu i dodatkowych, unikalnych 10 w ostatniej immunizacji, dając w sumie 30 różnych wektorów przed dawką przypominającą białka. Wszystkie szympansy otrzymały podobne pod względem pfu ilości wirusa krowianki oraz podobne ilości białka.
188 641
Tabela 2
Schemat immunizacji szympansów mieszanymi rekombinantami VV
Data Wstrzyknięcie
1/9/96 VV (env nr 1)
4/16/96 VV (env nr 1)
Szympans 1 i 2 6/11/96 VV (env nr 1)
7/30/96 rekomb. gp120 i rekombb. gp41 i alum
1/9/96 VV (envnr 1-10)
4/16//96 VV(envnr 11-20)
Szympans 3 i 4 6/11/96 VV (env nr 21-30)
7/30/96 rekomb. gp120 i rekomb. gp41 i alum
Rekombinowane VVenv można podawać bez wywoływania owrzodzenia. Wszystkie cztery szympansy śledzono pod kątem objawów choroby układowej i tworzenia owrzodzenia w miejscach wstrzyknięć. Zwierzęta badano w oparciu o codzienną ocenę biegunki, kataru, kaszlu, szybkiego oddechu, letargu, ograniczenia ruchliwości i utraty apetytu. Żaden z objawów nie pojawił się u żadnego ze zwierząt. Wykonywano zdjęcia miejsc wstrzyknięcia w regularnych odstępach czasu po pierwszej immunizacji VV, kiedy to u wszystkich czterech zwierząt pojawiło się obrzmienie. W miejscu wstrzyknięcia u szympansa 1 i 3 pojawiło się delikatne owrzodzenie typowe dla szczepień przeciwko ospie, podczas gdy nie zaobserwowano owrzodzenia u szympansów 2 i 4. Nie wywołano objawów choroby, obrzmienia i owrzodzenia w drugim, trzecim i czwartym wstrzyknięciu u żadnego zwierzęcia, wskazując, że swoista odporność została wywołana po pierwszym wstrzyknięciu.
Wstrzyknięcia VVenv, z następnymi immunizacjami przypominającymi dają przeciwciała ELISA-pozytywne. Przeciwciała przeciwko HIV-1 śledzono podczas schematu immunizacji pięcioma różnymi ELISA. ELISA zastosowano do pomiaru względnej ilości, niż absolutnej ilości przeciwciał u każdego ze zwierząt. W większości przypadków, testy wykonywano z fragmentami wirusa pozbawionymi struktury trójwymiarowej i oligomerycznej charakterystycznej dla natywnych env. W tych przypadkach, ELISA wiążą jedynie podtyp przeciwciał swoistych wobec HIV. Uzyskane wyniki pokazano na fig. 6. Szympans 3 przekroczył granicę odcięcia dla pozytywności po pierwszej immunizacji W, podczas gdy szympans 4 przekroczył tę granicę po drugiej immunizacji. Reakcje szympansów 3 i 4 pod koniec badania znacznie przekroczyły schemat immunizacji szympansów 1 i 2. W ELISA nr 2, z MN gp160, szympans 3 był jedynym silnym respondentem. Reakcja ta zaszła przed dawką przypominającą białka i nie była zakłócona przez wstrzyknięcie przypominające. Reakcja ta na CHO-LAI związanymi z płytkami ELISA (ELISA nr 3) z użyciem tego samego antygenu, co zastosowany do dawki przypominającej oczyszczonego białka wywołała silnią reakcję jedynie szympansa 3. W ELISA nr 4 z IIIB-gp120 związanym z płytką, szympans 2 wykazał wysokie tło, prawdopodobnie z powodu wysokiego tła najsilniejszą reakcję ze wszystkich zwierząt. Reakcje w ELISA nr 5, z lizatem wirusa IIIB Organon Technika wykazały pozytywność surowic u wszystkich czterech zwierząt.
Reakcje neutralizacji wobec izolatów laboratoryjnych i pierwotnych. Testy neutralizacji wykonano z surowicami wszystkich czterech zwierząt wobec izolatów laboratoryjnych i pierwotnych. Pierwszy test wykonano na linii limfocytów T, podczas gdy drugi na seronegatywnych PBMC pobudzanych PHA. We wszystkich przypadkach izolaty nie pasowały do prezentowanych w szczepionkach HIV-1.
Jak pokazano w tabeli 3, próbki od szympansów 2, 3 i 4 dały efekt pozytywny (35-40% zahamowania wzrostu wirusa) wobec izolatu laboratoryjnego MN na limfocytach T. Testy z innymi dwoma wirusami laboratoryjnymi (IIIB (Lockey i in., Aids Res. Hum. Retrovir. 12:1297-1299 (1996)) i SF2) nie reagowały pozytywnie z żadną z próbek. Pokazano wyniki testu neutralizacji (Montefiori i in., 1988, wyżej; Montefiori i in., 1996, wyżej) z czterema pierwotnymi izolatami badanymi na pobudzonych PHA PBMC. Wirus uważa się za trudny do neutralizacji w tym teście, ponieważ surowice pacjentów często dają wynik negatywny, nawet
188 641 w rozcieńczeniu 1:2 (Fenyo i in., AIDS 10:397-3106 (1996); Moore i Ho, AIDS 9:3117-3136 (1995); Montefiori i in., 1996, wyżej). Co ciekawe, rozcieńczenie 1:4 surowicy szympansa 4 neutralizowało jeden z badanych izolatów pierwotnych. Sytuacja różniła się od doświadczeń innych ze szczepionkami env, ponieważ w większości poprzednich przypadków, surowice od osobników immunizowanych env dawały negatywne wyniki w testach neutralizacji izolatów pierwotnych (Steele, J. NIH Res. 6:40-42 (1994); Moore, Nature 376:115 (1995)).
Tabela 3
Neutralizacja wirusów nieobecnych w szczepionce przez surowice odpornościowe szympansów
Izolat Szympans 1 Szympans 2 Szympans 3 Szympans 4
Szczep laboratoryjny MN - efekt pozytywny efekt pozytywny efekt pozytywny
Pierwotny nr 1 - - - -
Pierwotny nr 2 - - - -
Pierwotny nr 3 - - - pozytywny
Pierwotny nr 4 - - - -
Mieszana VVenv wywołuje przeciwciała przeciwko HIV-1 wyższej jakości niż pojedyncze VVenv. Wyniki ELISA i testów neutralizacji podsumowano w tabeli 4, pokazując szympansy, których surowice dawały silniejsze reakcje w siedmiu opisanych wyżej testach. Jak można zauważyć na tabeli, szympansy 3 i 4 reagowały pozytywnie w skojarzeniu pięciu spośród siedmiu testów, podczas gdy szympansy 1 i 2 reagowały pozytywnie w trzech spośród siedmiu testów. Wyniki te mogą odzwierciedlać wyższąjakość przeciwciał wywołanych przez polienv w porównaniu pojedynczą szczepionką env.
Tabela 4
Podsumowanie ELISA i testów neutralizacji
Test Silna reakcja wśród szympansów, którym podawano pojedynczą VV Silna reakcja wśród szympansów, którym podawano mieszaną W
ELISA nr 1, Abbott (IIIB-gp41) - szympans 1 i 2
ELISA nr 2, MN-gp160-BAC - szympans 3
ELISA nr 3, IIIB-gp120-BAC szympans 2 -
ELISA nr 4, LAI-gp120-CHO - szympans 4
ELISA nr 5, lizat wirusa IIIB szympans 1 i 2 szympans 3 i 4
neutralizacja szczepu laboratoryjnego szympans 2 szympans 3 i 4
neutralizacja izolatu pierwotnego - szympans 4
Dyskusja. Doświadczenia opisane w tym przykładzie zaprojektowano w celu zbadania bezpieczeństwa stosowania szczepionki przeciwko HV-1 opartej na wirusie krowianki, oraz w celu porównania uczulania koktajlem otoczek i pojedynczą szczepionką otoczkową. Wyniki pokazują po raz pierwszy, że wirusa krowianki można zastosować jako immunogen, bez wywoływania otwartego owrzodzenia, oraz przy użyciu koktajlu otoczek można wywołać niezwykle szeroką aktywność swoistą wobec HV-1
188 641
Model szympansów umożliwił badanie bezpieczeństwa polioty ta naczelnych. Szczególnie interesujące było określenie nasilenia tworzenia owrzodzoń, ponieważ szczepienie W może wywołać niebezpieczeństwo przotiosionia wirusa pa osobnika tie uczulonego. W przypadku HIV, jest to poważny problem, eopibwαO pacjenci z AIDS mogą tie być zdolni do zablokowania. W colu określenia togo, badano zastosowanie podskórnych szczepień u szympansów, sprawdzając, czy możliwe jest uniknięcie otwartych owrzodzoń. Podobne wyniki obserwowano, gdy w badaPiach klinicznych zastosowano podskórne wstrzyknięcie roztworu wirusa krowianki NYCDH jako szczepionkę przeciwko ospie (Cottor i in., J. InfecŁ Dis. 135:167-175 (1977; Botetsop i in., J. Infoct. Dis. 135:135-100 (1987).
Możliwo jest, że przy zachowaniu szczególnej ostrożności podczas procesu szczepienia i późniejszej opieki pad miejscem wstrzyknięcia, można uniknąć owrzodzenia we wszystkich przypadkach. Wyniki te pokazują, że względy bezpieczeństwa nie wykluczają zastosowania wirusa krowiatki jako wektora szczepionki HIV-1.
Koktajle otoczek badano ta myszach (przykład 2) oraz na królikach. W doświadczeniach ta myszach, przeciwciała przeciwko HIV obserwowano po ppUbdynczym wstrzyknięciu VVepy, podczas gdy u królików, VVony zastosowano w colu przypomnienia reakcji wywołanych DNA. Doświadczenia pokazują, żo przeciwciała swoisto wobec HIV-1 można wywołać albo przypomnieć przy użyciu VVeny, zaś pierwotne izolaty można neutralizować reakcją przeciwciał. W celu zbadania działania mieszanych VVopy (polioty) szympansy podzielono ta dwie grupy. Pierwsze dwa szympansy otrzymały tylko jodtą VVopy, podczas gdy szympansy 3 i 0 otrzymały koktajle skomponowane z 30 różnych VVopy.
Po otrzymaniu immunizacji wirusem krowiatki, wszystkim czterem szympansom podano dawkę przypominającą pojbOjPCzeU mieszaniny białka gp120/gp01 w alumio. Surowico od wszystkich czterech szympansów badato w pięciu różnych ELISA, z których każdy wykorzystywał różno fragmenty i/lub konfiguracjo eny. Co ciekawe, szympansy 1 i 2 w sumio reagowały silnio joOypio w jednym z tych ELISA, podczas gdy surowico od szympansów 3 i 0 w sumio reagowały siltio w 0 spośród tych testów. Ponieważ każdy tost mierzył tylko frakcję przeciwciał swoistych wobec HIV-1 u zwierząt, wyniki prawdopodobnie p0zWibrcle0lαłj większą szerokość aktywności wiązania wywołaną przez mieszaną szczepionkę.
Wykonywano również testy neutralizacji przeciwko izolatom pierwotnym i laboratoryjnym. Co ciekawe, reakcję pozytywną wobec izolatu pierwotnego zanotowano u szympansa 0, mimo iż izolat pierwotny tie występował w mieszaninie szczepionki. Wyniki to pokazują szerszy zakres przeciwciał wywołanych przez koktajl szczepionek polioty. Wzrost komploksowania antygenu szczepionki może prowadzić do zwiększonej różnorodności limfocytów i oOpowioOpiej reakcji przeciwciał.
Wykazanie, żo przeciwciała neutralizująco można wywołać przeciwko izolatowi pierwotnemu, który nie występował w szczepionce wykazuje, że liniowo różne białka posiadają wspólne struktury kopformacjjpb. Obserwacja ta jest również wykazana w reakcjach odpornościowych pacjentów zakażonych HIV-1, ponieważ dowolni dwaj osobnicy eksponowani ta wiele wzajemnie wyłącznych wirusów są chropioti przed padkażetiem podczas ekspozycji krzyżowej. Zastosowanie szczepionki polieny stanowi pierwszą próbę w układzie szympansów naśladowania tej sytuacji u pacjentów z HIV-1. Oznacza to, że przeciwciała neutralizujące są wywoływane przez cały zestaw, niż przez ppjeOypczb białko ety.
Podsumowując, zbadano koktajl szczepionek przeciwko HIV-1 opartych pa VV, określany jako poliety ta modelu szympansów. Przykład ten wykazał, że:
1) VV można zastosować jako szczepionkę bez wywoływania otwartego owrzodzenia skóry;
2) przy użyciu tej szczepionki można wywołać szeroki zakres aktywności przeciwciał swoistych wobec HIV-1; i
3) koktajl konstruktów eny (polioty) daje przeciwciała swoiste wobec HIV-1 wyższej jakości niż pojedynczy kopstrukt eny.
Wirus krowiatki znany jest od Oawta jako potencjalna szczepionka, zarówno w postaci typu dzikiego jak i w postaci rekombitowapęj. Siła VV polega ta jego zdolności Oo rekrutacji zarówno składowej limfocytów B jak i T układu p0eorpościpwbgo. W stanowi jedyną szczepionkę zdolną Oo wykorzenienia choroby (ospy) z populacji ludzkiej. Dato
188 641 w tym przykładzie wskazują, że rekombinowane wektory VV przyczynią się do kontroli HTV-1 w przyszłości.
Przykład 4: Wytwarzanie plazmidów bi-funkcjonalnych
Szczepionki DNA, jak wykazano, wywołują silną reakcję przeciwciał i CTL w kilku różnych układach (grypa, HIV-1 itp.). Szczepionki przeciwko grypie i HIV-1 oparte na DNA są już badane klinicznie na zdrowych ochotnikach. Wirus krowianki służy również jako silna podstawa programów szczepienia. W rzeczywistości, wirus krowianki stanowił jedyną szczepionkę zdolną do wykorzenienia choroby (ospy) z populacji ludzkiej. Liczne rekombinowane wirusy krowianki wywoływały ochronne reakcje odpornościowe, jak wykazano w badaniach na zwierzętach. Dane pokazują skuteczność szczepionki polienv i skojarzonych strategii szczepienia, np. szczepionki DNA i wirusowe.
Skonstruowano plazmid bifunkcjonalny, który może działać jako szczepionka DNA i rekombinowany wektor W/. Figura 7 pokazuje mapę tego plazmidu, który obejmuje promotor CMV, do ekspresji w komórkach ssaków oraz promotor wczesny i późny krowianki do wytwarzania rekombinowanego wirusa krowianki.
Bezpośrednie wstrzyknięcie oczyszczonego plazmidowego DNA można zastosować w celu wywołania u badanych osobników reakcji odpornościowej na białko env HIV. Plazmid można również zastosować do wytwarzania i badania żywych, rekombinowanych wirusów krowianki jako nośników immunizujących białek env HIV.
Osobników można potencjalnie szczepić schematem złożonym, obejmującym szczepienie DNA i immunizację rekombinowanym wirusem krowianki, podawanymi w dowolnej kolejności, we wstrzyknięciu pojedynczym albo w wielu i/lub w połączeniu z dodatkowymi nośnikami szczepionek.
Wynalazek nie jest ograniczony do zakresu konkretnych opisanych tu wykonań. W rzeczywistości, liczne modyfikacje wynalazku oprócz tu opisanych staną się oczywiste dla specjalisty w oparciu o powyższy opis i dołączone figury. Modyfikacje takie wchodzą w zakres wynalazku w świetle dołączonych zastrzeżeń. Należy również rozumieć, że wszystkie wielkości zasad i aminokwasów oraz wszystkie ciężary cząsteczkowe, podane dla kwasów nukleinowych albo peptydów są przybliżone i są dostarczone w opisie.
Cytowane są tu różne publikacje, których zawartość włączona jest tu w całości jako odnośnik.
LISTA ODNOŚNIKÓW
Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988,1989,1990,1991,1992,1993, 1^^^, 1995)
Avery 's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)
Belshe, R.B. et al., J Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994)
Berkow et al., eds., The Merck Manual, Fifteenth Edition, Merck and Co., Rahway. NJ (1987)
Bimboim, H.C. and Doły, J.. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523 (1979)
Buck. C., and Paulino. M.S., eds., American Type Culture Colleaion Catalogue iAnimal Eiruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990)
Burns, D.P.W. and Desrosiers, R.C., Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994) Chakrabarti. S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)
Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993)
Creighton, T.E.. Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco. CA (1983)
DeVita Jr., V.T. et al., AIDS, Etiology. Diagnosis, Treatment and Prevention, 3rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992)
D'Honcht, Vaccine 10 Suppl.:548-52 (1992)
Dorozynski and Andersen, Science 252:501-502 (1991)
Ebadi. Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston. MA (1985)
188 641
Eichberg, Int. Conf. AIDS 7:88 (1991)
Embretson. J. etal., Nature 362:359-362 (1993)
Enamietał., J Virol. 65:2711-2713 (1991)
Enami et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3802-3805 (1990)
Fauci, Science 264:1072-1073 (1994)
Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Fharmacoiogical Basis ofTherapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990)
Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 70 (Suppl. 2): 141-143 (1994)
Gribskov and Burgess, Nuci. Acids Res. 14:6745 (1986)
Graham et al., J. Infect. Dis. 766:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993)
Grundwald-Bearch et al., J. CancerRes. Clin. Oncol. 77 7:561-567 (1991)
Hallenberger etal., Virology 793:510-514 (1993)
Hay, R., et al., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th Ed.. American Type Culture Collection. Rockville. MD (1992)
Hirsch. M.S., and Curran. J. „Humań immunodeficiency viruses, biology and medical aspects,” in Virology, Fields and Knipe. eds.,Raven Press, Ltd., New York, NY (1990). pp 1545-1570
Ilu etal.. Nature 328:721-123 (1987)
Ish-Horowicz, D. and Burkę, J.F., Nucleic Acids Res. 9:2989-2998 (1981)
Ito et al.,J. Virol. 65:5491-5498 (1991)
Ito etal., Cancer Res. 50,6915-6918 (1990)
Javaherian. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:6763-6772 (1989)
Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)
Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):S139-143 (1994)
Kienyeia/., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989)
Kilpatrick et al. J. Biol. Chem. 262:116-121(1987)
Luytjes et al.. Cell 59:1107-1113 (1989)
Mackett, M. etal.. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982)
Mazzara, G.P. etal., Methods in Enz. 277:557-581 (1993)
McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994)
Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)
Osol. A., ed., Remingtoris Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341
Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927-4931 (1982)
Pantaleo, G. etal., Nature 362:355-358 (1993)
Rhim, J.S. etal., Int. J. Cancer 75:23-29 (1975)
Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses 8: 1065-1071 (1992);
Richman, Annu Rev Pharmacol Toxico 33: 149-164 (1993);
Richman, Antimicrob Agents Chemother 37: 1207-1213 (1993);
Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994)
Richmond and McKinney, eds, Biosafety in microbiological and biomedical Laboratories, 3rd Edition, U.S. Dept. of Health & Humań Services, Washington DC (1993)
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)
Schulz, GE. et al., Prindples of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978)
Schwartz and Dayhoff. eds., Atlas of Protein Seąuence and Structure, National Biomedical Research Foundation; (Washington, DC ?-wp] (1979), pp. 353-358
Selenka et al., Arch. Hyg. Bakterio! 753:244-253 (1969)
Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)
Starcich etal., Cell 45:637 (1986)
Towbin, H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 76:4350 (1979)
United States Biochemical, Seąuenase Version 2.0 - DNA Seąuencing Kit, Ninth Edition. Amersham Life Science. Inc., Boise, Idaho (1994)
Weire/a/., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:1210-1214 (1982)
188 641
Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-9 (1967)
Wong-Staal. F., „Human immunodeftciency viruses and their replication”, in Wrology, Fields and Knipe, eds., Raven Press. Ltd., New York, NY (1990), pp 1529-1543
Wrin et al., J. Acąuir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)
Wu et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Malec. Biol. 27:101-141 (1978)
Zagury et al., Nature 332:728-731 (1988)
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: St. Jude Children's Research Hospital
332 North Lauderdale PO Box 318
Memphis, TN 38101-0318 United States of America
ZGŁASZAJĄCY/WYNALAZCY: Hurwitz, Julia
Colecough, Christopher Owens, Randall J.
Slobod, Karen (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Mieszanina rekombinowanych wektorów krowianki jako szczepionki polienv przeciwko HIV.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 7 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: KLAUBER & JACKSON (B) ULICA: 411 HACKESSACK AVENUE (C) MIASTO: Seattle (D) STAN: NJ (E) KRAJ: USA (F) KOD: 07601 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: Floppydisk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY:: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:
(A) NAZWA: Paul F. Fehler (B) NUMER REJESTRACYJNY: 35.135 (C) NUMER SPRAWY: 13401011/PCT (ix) DANE TELPIKOMIUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: 201-487-5800 (B) TELEFAX: 201-343-1684 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
188 641 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2 CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3; GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCR:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4: CCAGAGATTT ATTACTCCAA CTAGCATTCC AAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5: CCATGTGTAAAATTAA.CCCC ACTCTGTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCR :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6 TACAATTTCT GGGTCCCCTC CTGAGG
188 641 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 880 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: obie (D) TOPOLOGIA: obie (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7
Lys Glu Gln 1 Lys Thr Val Ala Met Arg Val Lys Glu Ser Gln Met 15 Lys
5 10
Lys Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg Tp Gly Thr Met Leu Leu
20 25 30
Gly Leu Met Ile cys css rri Ala GAu Lys Ltu LUp Val Thr lel iyr
35 40 45
Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys du ,AALa TAo Tho Thr Leu Phe <y<s Ala
50 55 60
Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Tir Glu Val His Asn Val Top ASLa TTr
65 70 75 80
His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Vel
85 90 95
Asn Val TTr Glu Am Phe Ast Mst Trp Lyi Ay»n Asn sp 1 VaV dn dn
100 105 111
Met His d^^ Asp Ile Ilu lei Leu Tup Asp asp Gan Uri Vul s^P^o Ccs
115 120 115
Val Lys Leu TJhr Pro Leu tys Val Ser Leu Lys <y<s Tir TAs Leu Ll-t
130 135 140
Asn Asp Thr Asn Thr Ser Asn Asn Val Tir Ser Ser Ser Top Gly Aiy
145 150 155 116
Asn Ile Mętu Glu Glu Gly Glu Ilu Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile SSr
165 170 175
Thr Ser III Arg dy Gss SsT Gln Lyn Glu Glu TTa nai AVp UTt· Tys
180 185 119
Leu Asp lis Ile Pis Ilo Sst Lys Gly Asn isn {ter rr t snp pta TTa
195 200 225
Ser Tyr Lys Phe Tir Leu Thr Ser Cys Tsn TAi Ser Vel lis Thr dn
210 2>iS 220
Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro He Pro Ile His Tyr Cys AU.a
225 230 235 224)
Pro Ala dy Phe Ala Ile Luu Lys tys Asn Asn Lys Thr Phe Asn d^as
245 250 255
Thr Gly Pro Cys TCs Tai sn1 Ser Thr Val dn Gin Tln hls dn lis
260 265 220
Arg Pro Val Val Sea TUr hli Leu Ilsu Leu Auu dy Ss 1 Vru ula Hu
275 280 225
188 641
Glu Glu 290 Val Val Ile Arg Ser 295 Ala Asn Phe Thr Asp 300 Asn Ala Lys Thr
Ile 305 Ile Val Gln Leu Asn 310 Gln Ser Val Glu Ile 315 Ann <Cys T!eo Arg Pro 320
Asn Asn Asn Tler A;pg 325 Lys Ser Ile /Arg IIe 330 Gln Arg Gly PPe Gly 335 /aoj
Ala Phe Val T!a 340 Ile Gly Lys Ile ^BU 345 Gly /Asn Met Arg Gln 350 /A.a His
Cys Asn Ile 355 Ssr Arg Ala Lys Trp 360 Asn Asn Thr /LU Lys 365 Gln Ile /Ap
Ser Lys 370 Leu /Ag Glu Gln Phe 375 Gly Asn Asn Lys The 380 Ile Ul Phe Lys
Gln 385 Ser Ser GŁy Gly /Asp 390 Pro Glu Ile Val Thr 395 lis Ser PPe /An /cs 400
Gly Gly Glu PPh Phe 405 /Tyr /Cs Asn./er The 43.0 Gln Leu PPe /An Ser 415 TTj
Trp Phe Asn SiiJT 420 Thr Tjt> Ser Thr Lys 425 Gly Ser /An Asn TTe 443 Glu Gly
Ser Asp Thr 435 Sie Thr ILU Pro cys 440 Arg Ile Lys Gln Ile 445 IIl Asn Met
Trp Gln 450 Glu Val Gly Lys Ala 455 Met Tyr Ala Pro Pro 460 Ile Ssu Gly Gln
Ile 465 Arg Cys ssr Ser /Asn 477) Ile Tłur Gly Leu Leu 475 Leu Thr /Ag /Asp Gly 488)
Gly Ala Asn Glu /Asn 485 Asn Glu Ser Glu liii 490 Phe Arg Pro Gly Gly 495 Gly
Asp Met /Ag JAp 500 Asn Tir? /Ag Ser Glu SOS Leu T^r Lys Tyo Lys SIO Val Val
Lys Ile Glu 515 Pro Litu Gly Val Ala 520 Pro Thr Lys /Aa Lys 525 /Ag Aog vai
Val Gln 530 Arg Glu Lys /Arj /ALa 535 Val Gly Glu Ile Gly 540 Ala Ilu Phe LeU
Gly 545 Phe Leu Ala Ala 550 Gly Ser Thr Met Gly 555 Ala Ala Ser Met Tler 560
Leu Thr Val Gln Ala 565 Arg Gln Leu Leu Ser 570 Gly Ile Val Gln Gln 575 Gln
Asn Asn Leu Leu 580 Arg Ala Ile Glu Ala 585 Gln Gln His Ltu Leu 590 Gln Leu
Thr Val Τη? 595 Gly Ile Lys Gln leu 600 Gln Ala Arg Ile Ltu 605 Ala Val Glu
Arg Tyr 610 Leu Lys Asp Gln Gln 615 Leu Leu Gly Ile Trp 620 Gly Cys Suo Gly
Lys 625 Leu He Cys Thr Thr 630 Ala Val Pro Trp /nsn 635 Ala Suo Top Suo Asn 640
188 641
Lys Ser Leu Glu Gln 645 Ile Tip) Asm Hn Met Thr Trp Met Glu Tipł Asp
650 655
Arg Glu Ile Hn Asn Tyr Thr Seo Leu Ile His Ser Leu Ile Glu GAa
660 665 670
Ser Gln Asn Gln Gln Glu nys Hn Glu Gln sly Gag Iiu ulu LeL Hp
675 680 685
Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn tppa Phe Hh Ile Tsr Hu UTh Asn PpL
690 695 700
Tyr Ile Lys Leu Phe IIe Met He Val Gly Gly Leu nal Gly Leu Arg
705 77.0 715 720
Ile lal Phe Ala Val Llu Ser Val Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Ter
725 730 735
Ser Pro Leu SSr Phe Gln Thr His Leu Pito IGu Pro Upr Gly Ppo ysp
740 745 750
Arg Pro Glu Gly Ile Glu U1u Gln Gly Gly AAu Arg hu Ayg Hp Arg
755 760 765
Ser Ile Arg Leu Val Asn Hy Ser leS PLu Leu Ile Trp Aia Hp ipu
770 775 780
Arg Ser Leu Cys Leu PhL Upr Ser Hos Ayg pgu Uup Asp Le u Leu ŁLiU
785 779 795 800
Ile lal Thr Arg Ile VaI rna Ggu Uul u 1 y Aeg gAp Gly Top Glu Ala
805 810 885
Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Lru Lru Gln Ty: Trp Ser Gln Glu Llu Lys
820 825 830
Asn Ser Ala Val Ser Leu Om Hn ua a Thr sn y 11 CS Alu eyl AUl ale
835 840 845
Gly Thr Hp Arg Val lin G1u Val Val Gln Gly Aln Tyu HaG T1o Olu
850 855 860
Arg His Ile Pro gorg Aup Ile Arg Gln lly Leu Glu Arg Ile Leu )L5U
865 870 875 S80
188 641
1340-1-011 PCT
Fig 2 kontrola
188 641
1340-1-011 PCT
Fig 3
1340-1-011 PCT
188 641
1340-1-011 PCT
Fig 5
188 641
O.D. 405 nm
1340-1-011 PCT
Fig 6
1340-1-011 PCT
Fig 7
188 641
1340-1-011 PCT gen łac Z pil p7.5
-H+otoczka
HIV-1 segment genu TK sonda segment genu TK
miejsce miejsce
restrykcyjne restrykcyjne
HindIII 1 Kb Hindl I-i
Fig 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (24)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Szczepionka polienv przeciwko HIV, znamienna tym, że obejmuje od przynajmniej 4 do około 10000 różnych rekombinowanych wirusów, z których każdy zawiera sekwencję nukleotydową (EV), która jest wariantem env kodującą inny wariant białka otoczki ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), przy czym:
    a) sekwencja nukleotydowa EV koduje zarówno regiony zmienne jak i stałe wariantu białka otoczki; i
    b) szczepionka polienv jest zdolna do wywoływania u ssaka przynajmniej jednej reakcji odpornościowej komórkowej i humoralnej przeciwko szczepowi HIV.
  2. 2. Szczepionka polienv, według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje od 10 do około 100 rekombinowanych wirusów obejmujących różne odmiany env HIV.
  3. 3. Szczepionka polienv, według zastrz. 1, znamienna tym, że rekombinowane wirusy wybrane są z grupy obejmującej wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, adenowirus i wirus towarzyszący adenowirusowi (AAV).
  4. 4. Szczepionka polienv, według zastrz. 1, znamienna tym, że wariant białka otoczki obejmuje gp120 i część gp41 zdolne do oligomeryzacji białek env.
  5. 5. Szczepionka polienv, według zastrz. 4, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa EV obejmuje fragment restrykcyjny KpnI-BsmI sekwencji nukleotydowej kodującej białko otoczki HIV.
  6. 6. Szczepionka polienv, według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa EV jest wyizolowana od pacjentów zarażonych HIV z regionów ograniczonych geograficznie albo od pacjentów zarażonych HIV z różnych szczepów.
  7. 7. Szczepionka polienv. według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje warianty białka otoczki wyrażane przez rekombinowanego wirusa.
  8. 8. Szczepionka polienv, według zastrz. 1, znamienna tym, że dalej obejmuje przynajmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, adiuwant i chemioterapeutyczny związek przeciwwirusowy.
  9. 9. Sposób wytwarzania szczepionki polienv, znamienny tym, ze obejmuje zmieszanie od przynajmniej 4 do około 100ϋ0 różnych rekombinowanych wirusów w celu uzyskania szczepionki polienv, w której:
    i) każdy z rekombinowanych wirusów obejmuje sekwencję nukleotydową EV, która jest wariantem env kodującą inny wariant białka otoczki HIV;
    ii) sekwencja nukleotydowa EV koduje zarówno regiony zmienne jak i regiony stałe wariantu białka otoczki; i iii) szczepionka polienv jest zdolna do wywoływania u ssaka przynajmniej jednej reakcji odpornościowej komórkowej i humoralnej przeciwko szczepowi HIV.
  10. 10. Sposób, według zastrz. 9, znamienny tym, że łączy się od około 10 do około 100 rekombinowanych wirusów obejmujących różne warianty env HIV.
  11. 11. Sposób, według zastrz. 9, znamienny tym, że rekombinowane wirusy wybrane są z grupy obejmującej wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, adenowirus i wirus towarzyszący adenowirusowi (AAV).
  12. 12. Sposób, według zastrz. 9, znamienny tym, że wariant białka otoczki obejmuje gp120 i część gp41 zdolne do oligomeryzacji białek env.
  13. 13. Sposób, według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa EV obejmuje fragment restrykcyjny KpnI-BsmI sekwencji nukleotydowej kodującej białko otoczki HTV.
    188 641
  14. 14. Sposób, według zastrz. 9, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa EV jest wyizolowana od pacjentów zarażonych HIV z regionów ograniczonych geograficznie albo od pacjentów zarażonych HIV z różnych szczepów
  15. 15. Sposób, według zastrz. 9, znamienny tym, ze obejmuje warianty białka otoczki wyrażane przez rekombinowanego wirusa.
  16. 16. Sposób, według zastrz. 9, znamienny tym, że dalej obejmuje zmieszanie przynajmniej jednego dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika, adiuwantu i chemioterapeutycznego związku przeciwwirusowego.
  17. 17. Zastosowanie szczepionki polienv określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do zapobiegania lub opóźniania początku infekcji wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HTV) u ssaków:
  18. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że rekombinowany wirus jest wirusem krowianki a lek jest wytwarzany do podawania podskórnego.
  19. 19. Zastosowanie szczepionki polienv określonej w zastrz. 1, do wytwarzania leku obejmującego dwie szczepionki, które zawierają różne szczepy rekombinowanych wirusów do zapobiegania lub opóźniania początku infekcji wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HIV) u ssaków.
  20. 20. Zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HlV, albo obu do wytworzenia leku podstawowego lub przypominającego do zapobiegania lub opóźniania początku infekcji wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HIV) u ssaków.
  21. 21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że rekombinowane białko env HIV jest w mieszaninie z adiuwantem albo jest wytwarzane do podawania domięśniowego, bądź jest podawane domięśniowo w mieszaninie z adiuwantem; albo wektor DNA jest wytwarzany do podawania urządzeniem „strzelba genowa”.
  22. 22. Plazmid bifunkcjonalny, który może służyć jako szczepionka DNA i wektor rekombinowanego wirusa obejmujący gen heterologiczny i/lub miejsce insercji genu heterologicznego pod kontrolą zwierzęcej sekwencji kontrolującej ekspresję i wirusowej sekwencji kontrolującej.
  23. 23. Plazmid bifunkcjonalny według zastrz. 22, znamienny tym, że genem heterologicznym jest sekwencja nukleotydowa (EV), która jest wariantem env kodująca zarówno regiony zmienne i stałe wariantu białka otoczki HIV.
  24. 24. Plazmid bifunkcjonalny według zastrz. 22, znamienny tym, że zwierzęcą sekwencją kontrolującą ekspresję jest wczesny promotor wirusa cytomegalii (CMV), a wirusową sekwencją kontrolującą ekspresję jest wczesny promotor wirusa krowianki, późny promotor wirusa krowianki albo oba.
PL97328193A 1996-01-23 1997-01-23 Szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv,zastosowanie szczepionki polienv,zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, plazmid bifunkcjonalny. PL188641B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/590,288 US5741492A (en) 1996-01-23 1996-01-23 Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
PCT/US1997/000669 WO1997027311A1 (en) 1996-01-23 1997-01-23 Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL328193A1 PL328193A1 (en) 1999-01-18
PL188641B1 true PL188641B1 (pl) 2005-03-31

Family

ID=24361647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97328193A PL188641B1 (pl) 1996-01-23 1997-01-23 Szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv,zastosowanie szczepionki polienv,zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, plazmid bifunkcjonalny.

Country Status (28)

Country Link
US (3) US5741492A (pl)
EP (2) EP1378516A1 (pl)
JP (2) JP2000504326A (pl)
KR (1) KR100571479B1 (pl)
CN (1) CN1229501C (pl)
AP (1) AP1200A (pl)
AT (1) ATE278790T1 (pl)
AU (1) AU709174B2 (pl)
BG (1) BG64711B1 (pl)
BR (1) BR9707611A (pl)
CA (1) CA2243570C (pl)
CZ (1) CZ296575B6 (pl)
DE (1) DE69731075T2 (pl)
DK (1) DK0876498T3 (pl)
EA (1) EA002390B1 (pl)
ES (1) ES2230596T3 (pl)
GE (1) GEP20032902B (pl)
HU (2) HU224344B1 (pl)
IL (2) IL156919A0 (pl)
NO (1) NO322261B1 (pl)
NZ (1) NZ331024A (pl)
OA (1) OA10814A (pl)
PL (1) PL188641B1 (pl)
PT (1) PT876498E (pl)
RO (1) RO120268B1 (pl)
TR (1) TR199801418T2 (pl)
UA (1) UA73712C2 (pl)
WO (1) WO1997027311A1 (pl)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US6919318B1 (en) * 1998-04-22 2005-07-19 Chiron Corporation Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine
WO1999061049A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University Of Massachusetts Medical Center Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids
US6562800B1 (en) * 1998-10-30 2003-05-13 University Of Southern California Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
AU780231B2 (en) * 1998-11-10 2005-03-10 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Virus vectors and methods of making and administering the same
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1141314A2 (en) 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
JP4776075B2 (ja) * 1998-12-31 2011-09-21 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 改変ｈｉｖｅｎｖポリペプチド
JP2002533124A (ja) * 1998-12-31 2002-10-08 カイロン コーポレイション Ｈｉｖポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成
US6783762B1 (en) * 1999-01-28 2004-08-31 Stichting Biomedical Primate Research Centre Product and method for obtaining specific immunization with one or more antigens
DE19907485B4 (de) * 1999-02-12 2008-01-17 Strathmann Ag & Co. Virus-Vakzine
US6420545B1 (en) * 1999-05-24 2002-07-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics
WO2001037878A2 (en) * 1999-11-29 2001-05-31 Orchid Biosciences, Inc. Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
CN1311871C (zh) 2000-03-02 2007-04-25 爱莫里大学 Dna表达载体及其应用方法
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
CA2417240A1 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and composition for immunization using mixed pools of mutated nucleic acids or peptides
WO2002080982A2 (en) * 2001-01-12 2002-10-17 Chiron Corporation Nucleic acid mucosal immunization
ATE445411T1 (de) * 2001-03-08 2009-10-15 Us Gov Health & Human Serv Mva-exprimierende modifizierte hiv-envelope-, gag-und pol-gene
EP2280074A3 (en) * 2001-07-05 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
AU2002316578A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-18 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
US20070269456A1 (en) * 2001-11-05 2007-11-22 Lasher Alfred W DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
CA2467486A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Isis Innovation Limited Vaccine
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US20040106566A1 (en) * 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
ATE414176T1 (de) * 2002-07-18 2008-11-15 Univ Washington Schnelle, effiziente reinigung von hsv- spezifischen t-lymphozyten und damit identifizierte hsv-antigene
CA2505583C (en) * 2002-12-03 2014-07-15 University Of Massachusetts Polyvalent, primary hiv-1 glycoprotein dna vaccines and vaccination methods
CN100387301C (zh) * 2003-05-12 2008-05-14 佛罗里达大学研究基金公司 针对fiv感染的免疫接种材料和方法
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
US8076060B2 (en) * 2003-08-04 2011-12-13 Emil William Chynn Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma
AU2004270275B2 (en) * 2003-09-09 2010-02-18 Virxsys Corporation Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV humans
AU2004279362B2 (en) * 2003-09-15 2011-03-17 Genvec, Inc. HIV vaccines based on ENV of multiple clades of HIV
EP1667631A4 (en) * 2003-09-15 2010-04-14 Novartis Vaccines & Diagnostic COMBINATION PATHS FOR GENERATING IMMUNE RESPONSES
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
WO2005117964A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
WO2006101503A2 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
EP1784416B1 (en) * 2004-07-16 2011-10-05 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccines against aids comprising cmv/r nucleic acid constructs
WO2006044864A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Duke University Vaccine adjuvant
EP1814583A2 (en) 2004-11-01 2007-08-08 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination approaches for generating immune responses
WO2006066066A2 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric vectors
WO2008048984A2 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine
US8889641B2 (en) 2009-02-11 2014-11-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2012070974A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения
CA2826286C (en) 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
AU2012238351B2 (en) 2011-04-06 2016-11-24 Biovaxim Limited Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an HIV disease in humans
MX2014005548A (es) 2011-11-14 2014-08-21 Novartis Ag Complejos inmunogenicos de carbomeros polianionicos y polipeptidos env y metodos de manufactura y usos de los mismos.
WO2013126622A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for displaying polypeptides and uses thereof
WO2017102929A1 (en) * 2015-12-15 2017-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
EP3946605A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Tauc3 Biologics Limited Anti-tauc3 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198214A (en) * 1983-08-31 1993-03-30 Stolle Research & Development Corporation Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof
NZ217645A (en) * 1985-09-25 1991-11-26 Oncogen Recombinant viruses expressing lav/htlv-iii related epitopes and vaccine formulations
IL82104A0 (en) * 1986-04-08 1987-10-30 Usa Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus genes and method for producing htlb-iii envelope proteins
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US5081226A (en) * 1986-12-30 1992-01-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
ATE160377T1 (de) * 1989-04-18 1997-12-15 Applied Biotechnology Inc Erzeugung von hybrid-genen und proteinen durch rekombination mittels viren
EP1156102A1 (en) * 1991-06-14 2001-11-21 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
ES2348013T3 (es) * 1994-01-27 2010-11-26 University Of Massachusetts Medical Center Inmunización por inoculación de una unidad de transcripción de adn.
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro

Also Published As

Publication number Publication date
US5741492A (en) 1998-04-21
DK0876498T3 (da) 2005-02-07
DE69731075T2 (de) 2006-03-09
GEP20032902B (en) 2003-02-25
OA10814A (en) 2003-01-28
JP2007259870A (ja) 2007-10-11
IL156919A0 (en) 2004-02-08
KR100571479B1 (ko) 2007-06-07
HUP9900389A2 (hu) 1999-06-28
DE69731075D1 (de) 2004-11-11
AU709174B2 (en) 1999-08-26
CN1214083A (zh) 1999-04-14
RO120268B1 (ro) 2005-11-30
NZ331024A (en) 2000-02-28
TR199801418T2 (xx) 1998-10-21
US6086891A (en) 2000-07-11
CZ229398A3 (cs) 1998-12-16
PL328193A1 (en) 1999-01-18
AP9801325A0 (en) 1998-09-30
US5846546A (en) 1998-12-08
IL125497A0 (en) 1999-03-12
NO322261B1 (no) 2006-09-04
EP1378516A1 (en) 2004-01-07
CA2243570C (en) 2001-08-14
HK1016218A1 (en) 1999-10-29
BG102712A (en) 1999-04-30
EP0876498A1 (en) 1998-11-11
HUP9900389A3 (en) 2001-06-28
HU224344B1 (hu) 2005-08-29
ATE278790T1 (de) 2004-10-15
CA2243570A1 (en) 1997-07-31
JP2000504326A (ja) 2000-04-11
BR9707611A (pt) 1999-07-27
KR19990081931A (ko) 1999-11-15
NO983377D0 (no) 1998-07-22
ES2230596T3 (es) 2005-05-01
UA73712C2 (en) 2005-09-15
AU1829997A (en) 1997-08-20
EA002390B1 (ru) 2002-04-25
PT876498E (pt) 2005-02-28
AP1200A (en) 2003-08-29
WO1997027311A1 (en) 1997-07-31
CZ296575B6 (cs) 2006-04-12
EA199800638A1 (ru) 1999-02-25
BG64711B1 (bg) 2005-12-30
IL125497A (en) 2007-07-04
HU0402182D0 (en) 2004-12-28
NO983377L (no) 1998-09-23
CN1229501C (zh) 2005-11-30
EP0876498B1 (en) 2004-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL188641B1 (pl) Szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv,zastosowanie szczepionki polienv,zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, plazmid bifunkcjonalny.
JP5122983B2 (ja) Ｈｉｖｃｏｎ：ｈｉｖ免疫原及びその使用
KR102159626B1 (ko) 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
WO1997027311A9 (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv
US20040191269A1 (en) Polyvalent, primary HIV-1 glycoprotein DNA vaccines and vaccination methods
Bailey An assessment of the role of chimpanzees in AIDS vaccine research
RU2302461C2 (ru) Химерный ген cr3 и кодируемый им химерный белок cr3 (варианты), индуцирующий иммунный ответ против вич-1
JP2006514549A (ja) Ｉｌ−１５を発現する組換えワクチンウイルスおよびその使用方法
ES2396915T3 (es) Secuencias consenso, antígenos y transgenes del VIH-1 del clado A
CA2330618C (en) Viral chimeras comprised of caev and hiv-1 genetic elements
US6723558B1 (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
US20120321655A1 (en) Lentivirus vaccine based on the recombinant viral vaccine against yellow fever
HK1016218B (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polygeur vaccines for hiv
NZ767061B2 (en) Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection