ES2246826T3

ES2246826T3 - Composicion y procedimiento para obtener inmunizacion especifica contra uno o mas antigenos usando diferentes vectores recombinantes.

Info

Publication number: ES2246826T3
Application number: ES00904124T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Luke Heeney
Original assignee: Stichting Biomedical Primate Research Centre
Current assignee: Stichting Biomedical Primate Research Centre
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: ATE300314T1; DE60021523D1; US20050002967A1; US6783762B1; AU2579600A; DE60021523T2; WO2000044410A2; EP1144014A2; EP1144014B1; CA2361353A1; WO2000044410A3

Abstract

Un kit de partes para vacunar un animal o un ser humano con el fin de obtener una respuesta inmune contra un antígeno de un lentivirus, comprendiendo dicho producto al menos tres composiciones de vacuna diferentes para administración secuencial a dicho animal o dicho ser humano, - en el que cada composición de vacuna comprende dicho antígeno o un precursor del mismo, - en el que al menos tres de dichas composiciones de vacunas difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente de manera que se evita la amplificación de una respuesta inmune contra antígenos vectores, y - en la que al menos uno de dichos vectores o producto del mismo, funciona como un adyuvante.

Description

Composición y procedimiento para obtener inmunización específica contra uno o más antígenos usando diferentes vectores recombinantes.

Campo de la invención

La invención cae en el campo de la medicina. Más particularmente la invención se refiere a vacunas, composiciones de vacunas y estrategias de vacunación para obtener protección inmune mejorada contra enfermedades infecciosas.

Antecedentes de la invención

El último objetivo de desarrollo de vacunas profilácticas y/o terapéuticas para un gran número de agentes infecciosos ha sido difícil de lograr debido a la incapacidad de inducir respuestas inmunes óptimas para el patógeno de una manera segura y eficaz. Los planteamientos previamente ensayados y probados de vacunación con virus muertos enteros o vivos atenuados son o bien inseguros o ineficaces para el resto de enfermedades infecciosas de interés importante para la salud pública. Para evitar posibles problemas de salud ha sido posible desarrollar vacunas basadas en proteínas constituidas por una o varias proteínas virales o epítopes de las mismas. Éstas se derivan de genes virales individuales expresados in vitro y purificados como subunidades individuales en la proteína en ausencia de material genético. Los planteamientos de vacunas de subunidades recombinantes tienen eficacia probada para ciertos patógenos tales como hepatitis B. Sin embargo, para muchas aplicaciones las subunidades de antígenos no han sido exitosas debido a dificultades de expresión/producción, alteración de epítopes inmunológicos relevantes de notable variabilidad del patógeno requiriendo el desarrollo continuo, fermentación y purificación de nuevos antígenos.

Se desarrollaron vectores de vacunas virales o bacteriales vivos recombinantes como soluciones potenciales para algunos de estos problemas. Un virus o bacteria vivo replicante que no provoca enfermedad tiene el potencial de usarse como un vector. Los virus atenuados tales como adenovirus, poxvirus (es decir, vaccinia, MVA, canario, difteria aviar) o bacterias tales como E. coli, se están desarrollando y evaluando como vectores vivos. Debido a su capacidad de replicarse (en algunos casos de una manera limitada) en un huésped sin graves efectos secundarios, los hace candidatos a llevar y expresar genes foráneos como antígenos de "vacuna". Las vacunas recombinantes tiene la ventaja de que se replican en el huésped y por lo tanto inducen respuestas inmunes más fuertes que los virus muertos enteros. Una ventaja adicional es que una respuesta inmune a un antígeno codificado por dicho vector, se puede mejorar mediante la estimulación del sistema inmune mediante la presencia o la expresión de proteínas adicionales, por ejemplo proteínas específicas del vector por ejemplo proporcionando función adyuvante. Sin embargo, relativamente pocos sistemas de vectores recombinantes solos han tenido éxito suficiente para ser aceptados de manera amplia para uso clínico. Los principales problemas distintos de seguridad han sido la inmunidad preexistente en el caso de vectores derivados de agentes infecciosos comunes en poblaciones. Además, las respuestas inmunes posteriores contra las proteínas de vectores han creado ellas mismas una barrera inmunológica adicional cuando más de una inmunización se requería para estimular respuestas al (a los) antígeno(s) de vacunas recombinantes. Un problema es que el sistema inmune puede armar una respuesta inmune contra proteínas de vector o codificadas por vector junto con una respuesta inmune contra el antígeno, denominado antígeno de vacunación, la respuesta inmune se propuso que se dirigiera con el fin de proporcionar la protección del huésped. La observación de que el sistema inmune pueda armar una respuesta inmune contra una proteína de vector o proteína codificada por vector crea un potencial para la competición por recursos inmunes tal como la disponibilidad de células inmunes y/o citoquinas, por lo tanto ralentizando la respuesta deseada contra las proteínas de vacunación (véase por ejemplo, la figura 1A). Otro problema es el potencial para más antígenos inmunógenos presentes en proteínas de vector o proteínas codificadas por vector que dirigen la respuesta inmune fuera de las proteínas de vacunación. Adicionalmente, las respuestas inmunes contra el vector limitan eventualmente la replicación del vector en el huésped, reduciendo por lo tanto los vectores de propósito y eficacia propuestos. Un problema que se incrementa específicamente tras la estimulación de la respuesta inmune con el mismo o similar vector o sistema de vector. Por ejemplo, el uso de diferentes serotipos de adenovirus que comprende ácido nucleico que codifica proteínas de vacunación similares como vacunas no es óptimo ya que el sistema inmune todavía se reforzará contra antígenos comunes presentes en las proteínas de vector y/o proteínas codificadas por vector. Un procedimiento posible para evitar este problema es estimular respuestas inmunes inducidas por los vectores recombinantes con subunidades de proteínas. Varios estudios han mostrado que las respuestas inmunes se pueden mejorar ligeramente mediante este procedimiento pero no existe una mejora sustancial en la capacidad de la vacuna para proteger de infección.

Shengqiang y col., (1993) describen la preparación con virus de la gripe recombinante seguido de la administración de virus vaccinia recombinantes para inducir inmunidad protectora mediada por células T contra malaria. Se ha descrito el uso de dos vectores recombinantes diferentes para preparación y dosis de recuerdo para generar CTL en un planteamiento de vacunación antitumoral (véase el documento WO 97/39771 e Irvine y col., 1997).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona medios novedosos y usos de los mismos para obtener una respuesta inmune específica en un individuo o animal. La invención proporciona adicionalmente medios y usos de los mismos para disminuir los efectos negativos de las proteínas de vector y/o proteínas codificadas por vector mientras que se dejan los efectos deseados, tales como un efecto adyuvante de dichas proteínas al menos en parte intactos (véase por ejemplo un ejemplo no limitante en el esquema mostrado en la figura 1B).

En un aspecto la invención proporciona un producto para vacunar un animal o un ser humano para obtener en él una respuesta inmune contra al menos un antígeno, que comprende al menos tres composiciones de vacuna diferentes para la administración secuencial a dicho animal o dicho ser humano, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo, en el que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente.

En otro aspecto la invención proporciona el uso de un producto de la invención para vacunar un animal o ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra al menos un antígeno de un virus que provoca una alteración temporal, o de larga duración inmune, en la que dicha vacunación comprende la administración secuencial a dicho animal, de al menos tres composiciones de vacunas diferentes, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo y en el que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente.

Todavía en otro aspecto la invención proporciona un uso de un antígeno, o un precursor del mismo, para fabricar una composición de vacuna para vacunar un animal o un ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra dicho antígeno, en la que dicha composición de vacuna se administra secuencialmente con al menos otras dos composiciones de vacuna que contiene al menos una parte inmunógena, derivado y/o análogo de dicho antígeno o precursor de antígeno, y un vector diferente.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto la invención proporciona una solución para evitar los efectos negativos asociados con la exposición repetida de las proteínas de vector o proteínas codificadas por vector en un procedimiento de vacunación o una composición de vacuna. Para estudiar los problemas asociados a la amplificación de una respuesta inmune contra proteínas de vector y/o proteínas codificadas por vector se desarrolló una estrategia en la que se evaluó el uso de sistemas de vectores diferentes, para distribuir consecutivamente el (los) mismo(s) antígeno(s). El potencial existía no solamente para estimular sustancialmente respuestas para el antígeno recombinante, sino para confeccionar la naturaleza de las respuestas inmunes preparando y después distribuyendo dosis de recuerdo posteriores con combinaciones de vectores diferentes o distribuyendo los vectores de vacuna en sitios inmunológicos diferentes y/o poblaciones de células que presentan antígeno. De hecho, la capacidad de inducir respuestas de auxiliares T de tipo 1 o tipo 2 preferidas o generar adicionalmente respuestas específicas en sitios mucosales y/o sistémicos se puede prever con tal planteamiento.

En un aspecto la invención proporciona medios y usos de los mismos para vacunar un animal o un ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra al menos un antígeno de un virus que provoca una alteración inmune temporal, o de larga duración, que comprende al menos tres composiciones diferentes de vacuna para administración secuencial a dicho animal o ser humano, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo, en el que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente. Una vacunación 10 veces mucho mejor para tales virus se obtiene con al menos tres composiciones diferentes de vacuna en las que al menos tres dichas composiciones de vacunas difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente.

En otro aspecto la invención proporciona un producto para 15 vacunaciones de un animal o un ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra un antígeno que comprende al menos tres composiciones de vacuna diferentes para administración secuencial a dicho mamífero o dicho ser humano, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo, en las que al menos tres de dichas 20 composiciones de vacunas difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente. Se obtiene una vacunación mejorada con al menos tres composiciones diferentes de vacuna en las que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente. En un procedimiento de 25 vacunaciones que comprende una administración en serie a dicho animal de al menos dicho antígeno o un precursor del mismo y en el que al menos dos de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente, una amplificación por 30 de de una respuesta inmune contra antígenos de vector que pueden estar presentes en una o más de dichas composiciones de vacuna que pueden estar codificadas por ácido nucleico presente en una o más de dichas composiciones de vacuna o ambas, se evita al menos en parte en dicho animal. Evitando al menos en parte dicha amplificación de una respuesta inmune contra antígenos de vector en dicho animal, se evita al menos en parte el potencial enmascaramiento de una respuesta inmune contra dicho antígeno. Un procedimiento para evitar al menos en parte una amplificación de una respuesta inmune contra antígenos de vector en dicho animal es evitar al menos en parte la presencia de antígenos de vector en dicho animal durante dicho procedimiento de vacunación. Esto se puede lograr por ejemplo evitando la presencia de antígenos de vector en al menos una de dichas composiciones de vacuna o evitando al menos en parte la expresión de antígenos de vector codificados por un ácido nucleico en una composición de vacuna o ambos. Preferiblemente, la amplificación de una respuesta inmune en dicho animal o ser humano contra antígenos de vector se evita al menos en parte usando para dicha administración en serie de composiciones de vacuna, las composiciones de vacuna que comprenden diferentes vectores. Otro procedimiento preferido de evitar la amplificación de una respuesta inmune contra antígenos de vector en dicho procedimiento de vacunación es usar al menos una composición de vacuna útil para evitar la presencia de antígenos de vector en dicho animal y al menos una composición de vacuna que comprende un vector. Preferiblemente, cuando se usa más de una composición de vacuna que comprende un vector, dicho vector en dicha composición de vacuna es esencialmente
diferente.

Un procedimiento para la vacunación de un animal o ser humano puede ser un procedimiento de vacunación con tal que dicho procedimiento utilice la administración en serie de composiciones de vacuna que contienen al menos un antígeno o un precursor del mismo, contra el que dicho animal o ser humano al menos en parte se vacuna. Las composiciones de vacuna se administran preferiblemente a dicho animal o ser humano en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmune en dicho animal o ser humano.

Dicho antígeno puede ser una proteína completa o una parte de una proteína. Dicho antígeno también puede ser una molécula proteinácea, derivada natural o sintetizada químicamente.

En una realización de la invención dicho animal es un ser humano.

En una realización la invención proporciona un producto para la vacunación de un animal o un ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra al menos un antígeno, que comprende al menos tres composiciones de vacuna diferentes para una administración secuencial a dicho animal o dicho ser humano, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo, en la que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ella de un vector diferente. Preferiblemente dicho producto comprende al menos tres de dichas composiciones y en las que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente.

En una realización al menos parte de, dicho vector o producto del mismo, funciona como un adyuvante. Un adyuvante en el contexto de la presente invención es cualquier molécula o combinación de moléculas capaces de modular una respuesta inmune contra dicho antígeno. En un ejemplo un adyuvante tiene la capacidad de estimular el sistema inmune en dicho animal para provocar una respuesta inmune en la que dicha estimulación también estimula el inicio de la amplificación de una respuesta inmune contra dicho antígeno. En un ejemplo, un adyuvante es un adyuvante clásico tal como adyuvante de Freund completo o incompleto. En otro ejemplo, dicho adyuvante es una molécula proteinácea inmunológicamente diferente de dicho antígeno, capaz de provocar una respuesta inmune en dicho animal o ser humano.

Preferiblemente dicha molécula proteinácea comprende al menos una parte funcional de una molécula co - estimuladora tal como CD80, CD86, CD28, CD152, CD40 o ligando CD40; de una proteína de adhesión a células; de una proteína inhibidora de respuesta inmune; de una interleuquina; de una proteína del complejo principal de histocompatibilidad o de las otras proteínas capaces de la modulación de una respuesta inmune. Una respuesta inmune se puede modular a través al menos en parte inhibiendo o evitando una respuesta inmune y/o al menos en parte incluyendo o potenciando una respuesta inmune.

La vacunación se puede realizar junto con un procedimiento para influenciar al menos en parte un sistema inmune, por ejemplo en la dirección de un tipo T auxiliar 1 de una respuesta inmune o un tipo T auxiliar 2 de respuesta inmune. Ahora se acepta ampliamente que las respuestas inmunes dependientes de células T se pueden clasificar en base de activación y proliferación preferencial de dos subconjuntos distintos de células T CD4^{+} denominados T_{H}1 y T_{H}2. Estos subconjuntos se pueden distinguir entre sí mediante perfiles de secreción de citoquinas restringidos. El subconjunto T_{H}1 es un alto productor de IFN-\gamma con producción limitada o sin producción de la IL - 4, mientras que el fenotipo T_{H}2 muestra típicamente alto nivel de producción de tanto la IL - 4 como de la IL - 5 sin producción sustancial de IFN-\gamma. Ambos fenotipos se pueden desarrollar a partir de células CD4^{+} inactivas y actualmente existe mucha evidencia que indica que la IL - 12 y el IFN-\gamma por una parte y la IL - 4 por otra son citoquinas estimuladoras clave en el procedimiento de diferenciación de células precursoras pluripotentes T_{H}0 en células efectoras T_{H}1 o T_{H}2, respectivamente, in vitro, e in vivo. Ya que el IFN-\gamma inhibe la expansión y función de las células efectoras T_{H}2 y la IL - 4 tiene el efecto opuesto, la expansión preferencial de o bien las células que producen el IFN-\gamma (pc) o la IL - 4 pc es indicativo de si una respuesta inmune se produce en una dirección T_{H}1 o T_{H}2. Sin embargo, el entorno de citoquinas, no es el único factor que conduce a la diferenciación del linaje T_{H}. Los antecedentes genéticos, dosis de antígeno, vía de administración de antígenos, tipo de células que presentan antígeno (APC) y señalización mediante TCR y moléculas accesorias sobre células T.

En un aspecto preferido de la invención el sistema inmune se dirige hacia una o más tipos 1 ó 2 de auxiliares T de respuesta inmune a través del uso de vectores con la propiedad de modular una respuesta inmune en una dirección u otra. En un aspecto preferido de la invención al menos parte de dicha función adyuvante comprende medios para dirigir el sistema inmune hacia uno o más tipos 1 ó 2 de auxiliares T de respuesta inmune.

Preferiblemente mediante el uso de vectores con la propiedad de modular una respuesta inmune en una dirección u otra. Los ejemplos de vectores con la capacidad de estimular o bien un tipo 1 de auxiliar T o tipo 2 de auxiliar T más de respuesta inmune o de vías de distribución tales como distribución intramuscular o epidérmica se puede encontrar en Robinson 1997, Vaccine 15: 785 - 787; Sjolander y col., 1997, Cell. Immunol. 177: 69 - 75; Doc y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8578 - 8583; Feltquate y col 1997, J. Immunol 158: 2278 - 2284; Pertmer y col., 1996, J. Virol 70: 6119 - 6125; Prayaga y col., Vaccine 15: 1349 - 1352; Raz y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5141 - 5145.

En un aspecto preferido de la invención el sistema inmune se induce para producir respuestas inmunes innatas con potencial adyuvante en la capacidad de inducir respuestas inflamatorias locales. Estas respuestas incluyen interferones, quimoquinas, y quimoquinas en general, capaces de atraer procesamiento de antígenos y presentar células así como ciertas poblaciones de linfocitos para la producción de respuestas inmunes específicas adicionales. Estas respuestas de tipo innato tienen diferentes características dependiendo del vector de ADN usado y sus características inmunomoduladoras específicas, incluyendo tales como las codificadas por motivos CpG, y como tal, el sitio de inmunización. Mediante el uso en una secuencia específica vectores diferentes que codifican al menos un antígeno de vacuna específico común, se pueden generar y optimizar diferentes tipos de respuestas protectoras deseadas para amparo de un agente infeccioso particular. Combinando diferentes sistemas de vectores y distribuyéndolos en sitios diferentes o iguales específicos el efecto de vacuna deseado en un sitio particular de entrada (es decir, oral, nasal, entérica o urogenital) del agente infeccioso específico.

En un aspecto al menos uno de dichos vectores comprende células que presentan antígenos, preferiblemente engarzados in vivo pero también in vitro de dicho animal. Preferiblemente dichas células que presentan antígenos son células dendríticas. Preferiblemente dichas células que presentan antígenos presentan dicho antígeno, o una parte inmunógena, tal como un péptido, o derivado y/o análogo de los mismos, en el contexto de complejo I o complejo II de histocompatibilidad principal.

En una realización preferida al menos una de dichas composiciones comprende como antígeno precursor un ácido nucleico que codifica al menos una molécula proteinácea para intuir y/o estimular una respuesta inmune contra dicho antígeno. En una realización preferida dicho ácido nucleico es capaz de replicarse en una célula del animal o ser humano que se está vacunando. Con el término refuerzo en este respecto se pretende amplificar una respuesta inmune, de manera que cuando dicho animal se expone a dicho antígeno después de la amplificación, la respuesta inmune a dicho antígeno se incrementa en magnitud comparado a antes de dicha amplificación. Dicha molécula proteinácea para inducir y/o reforzar una respuesta inmune contra dicho antígeno puede ser dicho antígeno o una parte inmunógena, derivado o análogo del mismo. Como alternativa, el antígeno o una parte inmunógena, derivado o análogo del mismo puede estar codificado por un ácido nucleico presente en dicha composición de vacuna.

En una realización dicho antígeno es un antígeno codificado por un ácido nucleico de un lentivirus. En una realización particularmente preferida dicho antígeno es un antígeno codificado por un lentivirus. Para tales virus no ha sido posible diseñar una estrategia de vacunación satisfactoria para proteger completamente de infección. Sin embargo, la presente invención, sorprendentemente se aprovecha para proporcionar una vacunación satisfactoria para virus que provocan grados calidades de alteración inmune. Se obtiene alguna vacunación usando un producto que comprende al menos dos composiciones de vacuna diferentes para la administración secuencial a dicho animal o dicho ser humano, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo, en el que al menos dos de dichas composiciones difieren entre sí por la presencia en las mismas de un vector diferente. Sin embargo, la vacunación se mejora sustancialmente para proporcionar protección sustancial cuando al menos tres composiciones de vacuna diferentes se usan para la administración secuencial a dicho animal o dicho ser humano, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o precursor del mismo, en el que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente.

Para el mantenimiento eficaz y posterior refuerzo de la vacunación se prefiere que la capacidad inmune del individuo vacunado se estimule a intervalos con una vacuna que comprende no obstante otro adyuvante. En una realización preferida dicho antígeno comprende al menos una parte inmunógena, derivado y/o análogo de una proteína gag, pol, rev, tat, nef o env de lentivirus o una combinación de las mismas.

En una realización preferida al menos parte de dicha función adyuvante de un vector se proporciona por un ácido nucleico que codifica al menos una molécula proteinácea capaz de modular una respuesta inmune. Preferiblemente dicho ácido nucleico es capaz de replicarse en una célula del animal del animal o del ser humano que se está vacunando. Preferiblemente dicha molécula proteinácea capaz de modular una respuesta inmune comprende una parte funcional de una molécula co - estimuladora tal como CD80, CD86, CD28, CD152, CD40 o ligando CD40; de una proteína de adhesión a células; de una proteína inhibidora de respuesta inmune; de una interleuquina; de una proteína compleja de histocompatibilidad principal o de otras proteínas capaces de modulación de una respuesta inmune.

En una realización la invención proporciona composiciones de vacuna en las que dicho vector es vehículo de distribución de ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico. En una realización preferida dicho ácido nucleico es capaz de replicarse en una célula de un animal o ser humano que se está vacunando. En una realización preferida dicho ácido nucleico replicado tiene al menos una capacidad limitada de extenderse a otras células del huésped y comenzar un nuevo ciclo de replicación y presentación de antígenos y/o presentar función adyuvante. En una realización preferida dicho ácido nucleico comprende ácido nucleico de un virus del bosque Semiliki, un virus de sífilis, un virus herpes y/o un adenovirus En una realización preferida dicho vehículo de distribución de ácido nucleico es una partícula del virus del bosque Semiliki, una partícula del pox virus, una partícula de virus herpes o una partícula de adenovirus.

En otra realización la invención proporciona un uso de un producto de la invención para vacunar un animal con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra la menos un antígeno, en la que dicha vacunación comprende la administración secuencialmente a dicho animal, al menos tres composiciones de vacuna diferentes, conteniendo cada una al menos dicho antígeno o un precursor del mismo y en la que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente. Preferiblemente dicho animal es un ser humano.

Todavía en otra realización la presente invención proporciona un uso de una composición de vacuna en un procedimiento o un producto de la invención.

Todavía en otra realización la presente invención proporciona un uso de un antígeno, o un precursor del mismo, para fabricar una composición de vacuna para vacunar un animal o un ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra dicho antígeno, en la que dicha composición de vacuna se administra secuencialmente con al menos otras dos composiciones de vacuna que contienen al menos una parte inmunógena, derivado o análogo de dicho antígeno o precursor de antígeno, y un vector diferente.

Como prueba de principio, los inventores abordaron un estudio de eficacia de vacunas comparando un sistema de vector solo, dos combinaciones diferentes de dos sistemas de vectores diferentes, y el uso de tres vectores diferentes administrados secuencialmente. Todos los vectores usados para inmunizar animales expresaban antígenos SIV_{mac} similares. Dos meses después de la última inmunización los animales se expusieron por vía intravenosa con un inóculo de SIV_{mac}._{1XC} altamente patogénico y seguido para la evidencia de protección.

Ejemplos Materiales y procedimientos Población de estudio

Se llevó el estudio a cabo en monos rhesus (Macaca mulatta) no consanguíneos. Se estudiaron cuatro grupos de 4 animales y 1 grupo de 3 animales (19 monos rhesus en total). Cada animal se identificó por un único número en el animal tatuado en el pecho. Los animales se derivaron de las existencias genéticas indias y propósito de cría en cautividad o bien en los Estados Unidos (grupos A, B, C, D, E) o en Holanda (grupo F). Su edad variaba entre 2,5 y 3 años (grupos A, B, C, D, E) o 10 a 11 años (grupo F). Sus pesos variaban entre 2,7 y 3,9 kg (grupos A, B, C, D, E) o 5,2 a 9,1 kg (grupo F). Los animales eran negativos para SIV, STLV, SRV y no tenían ningún tratamiento previo inmunosupresor. Durante el experimento todos los animales se alojaron separadamente en jaulas individuales.

Se utilizaron tres sistemas de vectores diferentes, conteniendo cada uno la misma información genética para SIV gag/pol, rev, tat, nef, y env. Los vectores constaban de un vector de expresión de ADN basado en plásmido bacteriano, virus Ankara de vaccinia modificado (MVA) y virus del bosque de Semliki (SFV). El primer grupo (A) consistía en cuatro animales inmunizados solo con quiméricos SIV - MVA. En segundo lugar, las respuestas inmunes obtenidas después de inmunización con vectores de expresión de ADN y dos dosis de recuerdo con o bien vectores MVA - SIV (grupo B) o SFV - SIV (grupo C) se compararon con los obtenidos con una estrategia de vector triple; preparando mediante inmunización primero con vectores de expresión de ADN, la 1ª dosis de recuerdo con las construcciones MVA - SIV, después la 2ª dosis de recuerdo con las construcciones SFV - SIV (grupo D). Las cargas de virus (por PCR de ARN cuantitativa) se estudiaron antes y después de la exposición de SIV virulenta. Los animales se expusieron por vía intravenosa con una existencia de exposición de SIV asociada a células (1XC).

Además de los animales vacunados de novo, 3 monos protegidos de un estudio de vacuna SIV previo sirvió como grupo de dosis de recuerdo de vector iprotein primedi (grupo F). Los primeros recibieron una dosis de recuerdo con MVA - SIV, seguido de construcciones SFV - SIV.

Diseño experimental

Grupo A: Un grupo de 4 animales inmunizados tres veces con vectores de MVA que expresan SIV gag/pol, rev, tat, nef, y env administrados por vía intramuscular.

Grupo B: Un grupo de 4 animales inmunizados primero por vía intradérmica con los vectores de ADN que expresan gag/pol, rev, tat, nef, y env de SIV, después se les administró dosis de refuerzo dos veces por vía intramuscular con quiméricos MVA que expresan genes SIV similares.

Grupo C: Un grupo de 4 animales inmunizados con los vectores de ADN que expresan gag/pol, rev, tat, nef, y env de SIV y estimulados dos veces por vía intravenosa con vectores recombinantes SFV - SIV que expresan genes SIV similares.

Grupo D: Un grupo de 4 animales vacunados con los vectores de expresión de ADN, estimulados primero con quiméricos MVA - SIV y después con las construcciones SFV - SIV.

Grupo E: Un grupo de 4 animales control inyectados con ADN vacío, y con los vectores MVA y SFV vacíos como controles de infección.

Grupo F: Un grupo de 3 animales que habían probado estar protegidos de exposición en un estudio previo con una vacuna de proteína, después de administras dosis de refuerzo primero con los quiméricos MVA - SIV, después con las construcciones SFV - SIV.

Vacunas basadas en vectores de expresión de ADN

Los vectores pTH UbgagPk, pTH UbpolPk, pTH UbnefPk, pTH tat, y pTH rev expresan los genes gag, pol, nef,tat y rev de SIV _{macJ5} (Rud y col., 1994) bajo el control de potenciador/promotor inmediato - temprano (hCMV IE) de citomegalovirus humano (Hanke y col., 1998a). El vector pTH y sitios de clonación se han descrito previamente (Hanke y col., 1198a, 19998b) en los que el potenciador/promotor/intrón A de hCMV se clona en los sitios Mlul y HindIII y los genes SIV macJ5 individuales tat y se clonaron entre HindIII y Xbal. Dos vectores pTH.tat y pTH.rev contienen los genes rev respectivos en el sitio BamHI sin Ub-R cadena arriba. El clon molecular SIV _{macJ5} se usó como la fuente de estos genes como se ha descrito previamente (Rud y col, 1994; Rhodes, A. D. y col, 1994; y Hanke y col., 1994). El vector pND14-G1 expresa la secuencia que codifica gp 120 envuelta de SIV _{mac239} bajo control de potenciador/promotor de Ie de hCMV y la secuencia cis (SRV-1) de retrovirus 1 de tipo D de simio se clonó entre el gen gp 120 y la región BHG poli A/terminadora (Rhodes, G. H. y col., 1994; Indraccolo y col., 1998). Todas las construcciones contienen la secuencia 5I del intrón A de hCMV de los genes expresados, con el fin de incrementar la expresión de la secuencia del potenciador/promotor de hCMV, y llevan la secuencia de señal/terminadora de poli A de la hormona de crecimiento bovina (BHG). Cada construcción de SIV del vector de ADN diferente se administró separadamente a una dosis de 50 \mug de ADN en 200 \mul de solución salina con la ½ del volumen inyectado en dos sitios separados por vía intradérmica.

Vacunas basadas en SFV

Las vacunas basadas en SFV usadas en este estudio expresan las proteínas gag/pol, nef, tat, rev, y env de
SIV _{mac32H \ J5}. Las secuencias que codifican gag/pol, env y nef y los ADN de tat y rev del clon molecular pJ5 del genoma proviralk SIV _{mac32H} (Rud y col, 1994; Rhodes, A. D. y col., 1994) se subclonaron en el vector pSFV1 (Lilestrom y Garoff, 1991). Las secuencias que codifican gag/pol se obtuvieron mediante amplificación de PCR para flanquear estos genes mediante BamHI adecuado para subclonar en el vector pSFV1 (Zhang y col., 1997). Para empaquetamiento de existencias virales de SFV recombinante (rSFV) se usó un sistema de dos auxiliares (Smerdou y Lijestrom, 1999). Las valoraciones de virus se determinaron mediante infección de células BHK en diluciones limitantes seguido de inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos dirigidos contra proteínas de SIV relevantes. La expresión de los antígenos de SIV en células BHK infectadas también se demostró mediante transferencia de Western y análisis de inmunoprecipitación de células BHK21 marcadas metabólicamente.

Vacunas basadas en MVA

Recombinantes de Vaccinia Ankara modificados (MVA) (Sutter y Moss, 1995) en este estudio expresan los genes gag/pol, nef, tat, rev, y env de SIV _{macJ5} (Rud y col., 1994; Rhodes, A. D. y col, 1994) bajo control transcripcional del promotor temprano/tardío de virus de vaccinia P7 5 (Sutter y col., 1994). En resumen, las secuencias que codifican gag/pol, env y nef y los ADNc de tat y ref del clon molecular SIV _{macJ5} (Rud y col, 1994; Rhodes, A. D. y col, 1994) se subclonaron en el plásmido del vector de MVA pllLz P75 en el sitio SmaI (Sutter y Moss, 1995; Sutter y col., 1994; y Seth y col, 1998) con la excepción de env que se situó bajo control de un fuerte promotor de vector de vaccinia (Sutter y col., 1994). Todos estos reactivos se almacenan y son accesibles a través del almacén de reactivos NIBSC AIDS, Potters Bar, Reino Unido.

Cepa de exposición de vaccinia

Las existencias de SIV asociadas a células, patogénicas (SIV _{mac32H \ 1XC}) de PBMD de monos rhesus no cultivadas, primarias "1XC", descritas previamente (Niphuis y col., 1994) se usaron como el virus de exposición también descrito en un estudio de vacunas previo (Heeney y col, 1994).

Administración de las vacunas

Se sedaron monos rhesus con ketamina (10 mg/kg), antes de la administración de vacunas y se extrajo sangre. Las vacunas se administraron o bien por vía intradérmica (vectores de ADN) o por vía intramuscular (MVA) o por vía intravenosa (SFV). En particular, se administraron 50 \mug de cada vector de expresión de ADN en 200 \mul de solución salina por mono, la mitad del volumen inyectado en dos sitios separados. Todas las inmunizaciones con ADN se proporcionaron dos veces a intervalos de 12 semanas seguidas de o bien MVA y/o SFV (véase el diseño experimental) a intervalos de 12 semanas adicionales.

Exposición de virus y seguimiento

Todos los animales se expusieron 2 meses después de la última inmunización con 50 MID_{50} de las existencias de SIV asociado a células patogénicas "1XC" administrado por vía intravenosa (volumen: 1 ml/mono) (Niphuis y col., 1994). Las lecturas después de exposición incluían cuantificación de ARN viral en plasma como se ha descrito previamente) (Ten Haaft y col., 1998), y las determinaciones de números de células T CD4 en sangre periférica.

Resultados y discusión

Para determinar si se obtenía la inmunidad protectora todos los animales se expusieron con una existencia de PBMC de rhesus subcultivado in vivo altamente patogénico de SIV _{mac32H \ 1XC}. Como se observa en la figura 2E todos los animales control se llegaban a infectar fácilmente (grupo E) con cargas de virus máximas alcanzando a las dos semanas 5 x 10^{6} y 5 x 10^{7} Eq/ml de ARN y permaneciendo mayores que 1 x 10^{4} Eq/ml de ARN 12 semanas después de la infección. Todos los animales del grupo A, que recibían construcciones MVA - SIV solas, también se llegaban a infectar (tabla 1), aunque un animal tenía cargas de virus máximas menores y una carga menor que 1 x 10^{4} Eq/ml de ARN 6 semanas después de la infección (figura 2A). Todos los animales del grupo B que recibían preparación ADN - SIV y dosis de recuerdo MVA - SIV también se llegaban a infectar (tabla 1), persistiendo cargas altas de virus por encima de los niveles umbrales patógenos (> 1 x 10^{5} de eq/ml de ARN viral) después de exposición. En el grupo C uno de cuatro animales estaba protegido (tabla 1) de infección, aunque aquellos que se llegaban a infectase no se protegían de la carga de virus (figura 2C).

Se observó protección satisfactoria en animales que recibían tres vectores de vacuna diferentes (tabla 1) (figura 2) con la que se obtenía protección de exposición de SIV en el 50% de los animales. De hecho, cuando una subunidad de proteína vacunaba animales que estaban previamente protegidos de la exposición se reforzaron 5 años más tarde con una combinación de dos vectores (grupo F, tabla 1), la protección de vacuna se observó todavía en uno de tres animales. Los datos después de la infección revelaron que la inmunización no protegía suficientemente de la carga de virus (figura 2).

Se obtuvo protección mejorada contra infección de SIV cuando se usaban tres sistemas de vectores (grupos D, y F, tabla 1). En el grupo D, inmunizado con tres sistemas de vectores diferentes, la protección contra infección se encontró en 2 de 4 animales inmunizados (tabla 1, figura 2 D). Claramente, el uso de un sistema de vector solo para inmunizaciones múltiples era insuficiente para proteger de infección en el caso de MVA/SIV (grupo A) en este estudio (tabla 1>). Este fallo de protección de la infección se ha observado en otros estudios con SFV - SIV usados solos para inmunizaciones múltiples (Mossman y col., 1996), aunque se sugería protección de síntomas agudos (pero no enfermedad crónica). Una estrategia de vacunación que usa preparación de ADN y refuerzo de MVA no protegía a los monos inmunizados de infección (grupo B, tabla 1)El uso de ADN más SFV para inmunizar mostró una promesa limitada en la que un animal (grupo C, tabla 1, figura 2C) se protegía de infección.

El mejor resultado contra tales exposiciones potentes como la SIV _{mac32H\text{.}1XC} usadas en esta memoria descriptiva se lograban con el uso de tres vectores diferentes (grupo D, tabla 1, figura 2D). Se observó una prueba adicional cuando se examinaron los números de células T CD4^{+} de sangre periférica (figura 3). El SIV _{mac32H\text{.}1XC} usado en este estudio provoca una notable disminución en números de células T CD4^{+} con el tiempo como se observaba en el grupo control (E) (figura 3 E) así como en otros animales infectados en este estudio. Notablemente, los animales que se protegieron de infección mediante el uso de de una estrategia de vector triple (animales BJV y CTC, grupo D) mantenían niveles normales de células T CD4^{+} mientras que los de los animales infectados disminuían. Esto también se observó en el animal protegido (8645) en el grupo F (figura 3F) que ha recibido una triple combinación de una inmunización de proteína seguido de MVA y SFV, que soporta adicionalmente este concepto.

Mediante un refinamiento adicional de esta estrategia, usando combinaciones de vectores quiméricos divergentes, son probables niveles mejorados de protección de vacuna. Además, la optimización de diferentes combinaciones de sistemas de vectores distribuidos a sitios y poblaciones diferentes de células que presentan antígenos prestará esta aplicación a estrategias de vacunas mucosales y/o mucosales/sistémicas combinadas. Se prevé que una adición de modulación diferencial de respuestas inmunes (es decir, innata y específica tal como respuestas T_{H} de tipo 1 frente tipo 2) y la inducción de potente memoria inmunológica será posible usando combinaciones de diferentes sistemas de vectores de vacuna.

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TABLA 1 Grupo experimental y resultado

Grupo	"principal"	1ª dosis de recuerdo	2ª dosis de recuerdo	protegido
A	MVA – SIV	MVA – SIV	MVA – SIV	0/4
B	ADN – SIV	MVA – SIV	MVA – SIV	0/4
C	ADN – SIV	SFV – SIV	SFV – SIV	1/4
D	ADN – SIV	MVA -- SIV	SFV -- SIV	2/4
E	ADN	MVA	SFV	0/4
F	W. Proteína de virus	MVA – SIV	SFV – SIV	1/3
	"protegida"

Breve descripción de los dibujos Figura 1

Un diagrama que compara; (A) estrategias de inmunización existentes con un sistema de distribución (es decir, vector); (B) la combinación propuesta de sistemas de distribución (es decir, vectores múltiples) Respuestas inmunes al antígeno deseado se optimizan e intensifican con la dosis de recuerdo posterior con la estrategia de combinación (B) cuando se compara con sistemas únicos de distribución convencional (A).

Figura 2

Una comparación de cargas de virus de ARN en plasma en animales inmunizados y control que se llegan a infectar después de exposición con SIV. La figura 2A muestra las cargas de virus en animales que se han inmunizado repetidamente con el mismo vector (3X MVA). La figura 2 E muestra las cargas de virus en plasma en los animales control que no se inmunizaron con ningún antígeno de SIV. Las cargas de virus después de exposición para cada una de los otros grupos de combinaciones; B (ADN 2 X MVA), C (ADN, 2 X SFV), D (ADN, MVA, SFV) y F (proteína, MVA, SFV) respectivamente.

Figura 3

Comparación de niveles de células T CD4^{+} después de exposición por grupo. Las células T CD4+ de animales infectados decaían como era especialmente evidente en los animales control (E). Los niveles de células T CD4+ se pueden observar que permanecen a niveles normales, especialmente BJV y CTC en el grupo D (D) que recibía el protocolo de inmunización de combinación. Grupos mostrados; A (3X MVA), B (ADN 2 X MVA), C (ADN, 2 X SFV), D (ADN, MVA, SFV), E (controles), F (proteína, MVA, SFV) respectivamente.

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Claims

1. Un kit de partes para vacunar un animal o un ser humano con el fin de obtener una respuesta inmune contra un antígeno de un lentivirus, comprendiendo dicho producto al menos tres composiciones de vacuna diferentes para administración secuencial a dicho animal o dicho ser humano,

-: en el que cada composición de vacuna comprende dicho antígeno o un precursor del mismo,

-: en el que al menos tres de dichas composiciones de vacunas difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente de manera que se evita la amplificación de una respuesta inmune contra antígenos vectores, y

-: en la que al menos uno de dichos vectores o producto del mismo, funciona como un adyuvante.

2. Un kit de partes de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha función adyuvante dirige la respuesta inmunitaria hacia un tipo T auxiliar 1 o un tipo T auxiliar 2 de respuesta o ambos.

3. Un kit de partes de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que al menos una de dichas composiciones comprende, como un precursor de antígeno, un ácido que codifica al menos una molécula proteinácea para inducir y/o reforzar una respuesta inmune contra dicho antígeno.

4. Un kit de partes de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha molécula proteinácea comprende dicho antígeno, o una parte inmunógena, derivado o análogo del mismo.

5. Un kit de partes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que dicho antígeno comprende al menos una parte inmunógena, derivado y/o análogo de una proteína gag, pol, rev, tat, nef o env de lentivirus o una combinación de las mismas.

6. Un kit de partes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 - 5, en el que un vector comprende un ácido nucleico que codifica al menos una molécula proteinácea capaz de modular una respuesta inmune.

7. Un kit de partes de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha molécula proteinácea capaz de modular una respuesta inmune es una proteína co - estimuladora, una proteína inhibidora de respuesta inmune, una interleuquina, una proteína del complejo principal de histocompatibilidad o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

8. Un kit de partes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 - 7, en el que dicho vector es un vehículo de distribución de ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico.

9. Un kit de partes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 - 8, en el que dicho ácido nucleico comprende ácido nucleico de un virus del bosque de Semliki, un poxvirus, un virus herpes y/o un adenovirus.

10. Un kit de partes de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicho vehículo de distribución de ácido nucleico es un virus del bosque de Semliki, una partícula de poxvirus, una partícula de virus herpes o una partícula de adenovirus.

11. Uso de un kit de partes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, para la preparación de una vacuna.

12. Uso de un antígeno, o un precursor del mismo para fabricar una composición de vacuna para vacunar un animal o un ser humano con el fin de obtener en él una respuesta inmune contra un antígeno de un lentivirus, en la que dicha composición de vacuna se administra secuencialmente con al menos otras dos composiciones de vacuna que contienen al menos una parte inmunógena, un derivado y/o análogo de dicho antígeno o precursor de antígeno, y en el que al menos tres de dichas composiciones de vacuna difieren entre sí por la presencia en ellas de un vector diferente de manera que se evite la amplificación de una respuesta inmune contra antígenos vectores.