JP4125128B2 - ヒト免疫不全ウイルスのキメラタンパク質用組換えポックスウイルス - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫学の分野に関し、詳細には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の予防又は治療用ワクチンの開発に関する。ＡＩＤＳの治療及び予防に有用なキメラ遺伝子及びそれを発現する鶏痘ウイルスを開示する。
【０００２】
（従来技術）
ＨＩＶは、ＡＩＤＳの原因となる病原体である（Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｍ、Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ Ｍ、Ｒｅａｄ Ｇ、及びＧａｌｌｏ ＲＣ、サイエンス（Science）、１９８４、２２４：４９７〜５００）。このウイルスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｋｌａｔｚｍａｎ Ｄ、Ｂａｒｒｅ Ｓｉｎｏｕｓｓｉ Ｆ、Ｎｕｇｅｙｒｅ ＭＴ、Ｄａｕｇｕｅｔ Ｃ、Ｖｉｌｍｅｒ Ｅ、Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ Ｃ、Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔ Ｆ、Ｒｏｕｚｉｏｕｘ Ｃ、Ｇｌｕｃｋｍａｎ、ＪＤ、Ｃｈｅｒｍａｎｎｎ ＪＣ、及びＭｏｎｔａｇｎｉｅｒ Ｌ、サイエンス（Science）、１９８４、２２５：５９〜６３）だけでなく、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア、上皮細胞など他のタイプの細胞にも感染する。
【０００３】
ＨＩＶは、高レベルの抗体が感染全体を通して持続するにもかかわらず、宿主の免疫応答から逃避することができる。長期的には、ＨＩＶは重い免疫不全を宿主に起こし、宿主は日和見感染の攻撃を極めて受け易くなる。
【０００４】
３６００万人以上の人々がＨＩＶ／ＡＩＤＳに感染しており、日々１６０００件の感染のうち９４％が発展途上国で起きている。（国連エイズ合同計画（ＵＮＡＩＤＳ）、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの世界的流行に関するレポート（Report on the global HIV/AIDS epidemic）、２０００年６月）。これらの警鐘的な数値及びこの病気の有効かつ容易に実施可能な治療法の欠如のため、ＨＩＶワクチンの開発が早急に求められている。
【０００５】
この課題を困難にしている幾つかのＨＩＶ特性のうちでも、より重要なことは、おそらくその抗原、特にエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１６０）の遺伝的変異性が高いことである。エンベロープには、感染プロセスに関与し、中和抗体の標的となる主ドメインがある。
【０００６】
中和抗体に基づくワクチン候補は、チンパンジーをＨＩＶから防御することができた（Ｂｅｒｍａｎ ＰＷ、Ｇｒｅｇｏｒｙ ＴＪ、Ｌａｖｏｎ Ｒ、Ｎａｋａｍｕｒａ ＧＲ、Ｃｈａｍｐｅ ＭＡ、Ｐｏｒｔｅｒ ＪＰ、Ｗｕｒｍ ＦＭ、Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ ＲＤ、Ｃｏｂｂ ＧＫ、及びＥｉｃｈｂｅｒｇ ＪＷ、ネイチャー（Nature）、１９９０、３４５：６２２〜６２５；Ｇｉｒａｒｄ Ｍ、Ｋｉｅｎｙ ＭＰ、Ｐｉｎｔｅｒ Ａ；Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ Ｆ、Ｎａｒａ Ｐ、Ｋｏｌｂｅ Ｈ、Ｋｕｓｕｍｉ Ｋ、Ｃｈａｐｕｔ Ａ、Ｒａｉｎｈａｒｔ Ｔ、Ｍｕｃｈｍｏｒｅ Ｅ、Ｒｏｎｃｏ Ｊ、Ｋａｃｚｏｒｅｋ Ｍ、Ｇｏｍａｒｄ Ｅ、Ｇｌｕｃｋｍａｎ ＪＣ、及びＦｕｌｔｚ ＰＮ、ＰＮＡＳ、１９９１、８８：５４２〜５４６）。しかし、これらの実験はほぼ理想的な条件で実施され、ウイルス接種の投与量、経路、及び時期が自然感染とは非常に異なっていた。また、これらの免疫原は、異なるＨＩＶ分離株に対して防御することができず、産生された抗体はＨＩＶ初代分離株を中和することができない。
【０００７】
種々のワクチン候補が、第一相及び第二相臨床試験で評価された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＭＩ、ＡＩＤＳワクチンの開発：現況と今後の方向性（AIDS vaccine development: status and future directions）、１９９９、ＸＩＩコルクデサンギャルドゥ（XII Colloque des Cent Gardes）、Ｇｉｒａｒｄ Ｍ、及びＤｏｄｅｔ Ｂ編、１６１〜１６３）。これらの大部分は、エンベロープタンパク質ｇｐ１６０及びｇｐ１２０に基づいている。組換えｇｐ１２０に基づく１種のワクチンだけが、現在、タイ国及び米国において第三相治験の薬効評価にかけられている。これまでの治験の結果から、このワクチンでは、あったとしてもごく限られた防御しか期待されないことが示唆された。
【０００８】
種々のＨＩＶ分離株及びサブタイプを防御できる体液性応答を引き起こすにはこのように重大な限界があるため、研究者の努力の大部分は、ここ数年、免疫系細胞ブランチ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｒａｎｃｈ）、特にＨＩＶ抗原に対して誘導される細胞障害性Ｔ細胞を主に刺激できるワクチン候補を開発することに方向転換してきた。
【０００９】
抗ＨＩＶ ＣＴｌの臨床的関連性を強く示唆する実験的知見は以下の通りである：サル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）を予め接種したマカクに抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与すると、ウイルス血症のレベルが著しく増大した（Ｍａｔａｎｏ Ｔ、Ｓｈｉｂａｔａ Ｒ、Ｓｉｍｅｏｎ Ｃ、Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｍ、Ｌａｎｅ Ｃ、Ｍａｒｔｉｎ Ｍ、抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与するとアカゲザルの初感染中におけるサル／ヒト免疫不全キメラウイルスの排除が妨害される（Administration of an Anti-CD8 monoclonal antibody interferes with the clearance of chimeric Simian/Human Immunodeficiency virus during primary infections of rhesus macaques）、ウイルス学ジャーナル（Ｊ Ｖｉｒｏｌ）、１９９８、７２、１：１６４〜１６９）；ＣＤ８＋Ｔ細胞で認識されないウイルス変異株が、ＨＩＶ感染個体（Ｂｏｒｒｏｗ、Ｐ．、Ｈ．Ｌｅｗｉｃｋｉ、Ｘ．Ｗｅｉ、Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｎ．Ｐｅｆｆｅｒ、Ｈ．Ｍｅｙｅｒｓ、Ｊ．Ａ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｅ．Ｇａｉｒｉｎ、Ｂ．Ｈ．Ｈａｈｎ、Ｍ．Ｂ．Ａ．Ｏｌｄｓｔｏｎｅ、及びＧ．Ｍ．Ｓｈａｗ、１９９７、ＣＴＬ逃避ウイルス（ｅｓｃａｐｅ ｖｉｒｕｓ）を迅速に選択することによって実証される、初感染中のＨＩＶ−１特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって発揮される抗ウイルス圧力（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（Antiviral pressure exerted by HIV-1 specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) during primary infection demonstrated by rapid selection of CTL escape virus）、ネイチャーメディスン（Nature Med.）、３：２０５〜２１１）とＳＩＶ感染マカク（Ａｌｌｅｎ、Ｔ．Ｍ．、Ｏ．Ｃ．ＤＨ、Ｐ．Ｊｉｎｇ、Ｊ．Ｌ．Ｄｚｕｒｉｓ、Ｂ．Ｒ．Ｍｏｔｈｅ、Ｔ．Ｕ．Ｖｏｇｅｌ、Ｅ．Ｄｕｎｐｈｙ、Ｍ．Ｅ．Ｌｉｅｂｌ、Ｃ．Ｅｍｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｋ．Ｊ．Ｋｕｎｓｔｍａｎ、Ｘ．Ｗａｎｇ、Ｄ．Ｂ．Ａｌｌｉｓｏｎ、Ａ．Ｌ．Ｈｕｇｈｅｓ、Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、Ｊ．Ｄ．Ａｌｔｍａｎ、Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｉｎｓｋｙ、Ａ．Ｓｅｔｔｅ、及びＤ．Ｉ．Ｗａｔｋｉｎｓ、２０００、Ｔａｔ特異的細胞障害性Ｔリンパ球は、初期ウイルス血症（ｐｒｉｍａｒｙ ｖｉｒａｅｍｉａ）の回復中にＳＩＶ逃避変異株（ｅｓｃａｐｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）を選択する（Tat-specific cytotoxic T lymphocytes select for SIV escape variants during resolution of primary viraemia）、ネイチャー（Nature）、４０７：３８６〜９０）の両方で選択される；ＨＩＶ−１組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）を注射したボランティア由来のＰＢＭＣを入れたＳＣＩＤマウスは、中和抗体の非存在下で接種ウイルスから防御された（Ｖａｎ Ｋｕｙｋ Ｒ、Ｔｏｒｂｅｔｔ Ｂ、Ｇｕｌｉｚｉａ Ｒ等、ＨＩＶのｎｅｆタンパク質に特異的なヒトＣＴＬは、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスをＨＩＶ感染から防御する（Human CTL specific for the nef protein of HIV protect hu-PBL-SCID mice from HIV infection）、ＡＩＤＳ研究とヒトレトロウイルス（AIDS Res Hum Retroviruses）、１９９３；９（追補（ｓｕｐｐｌ）１：Ｓ７７）；かなりの割合の曝露非感染者が、ＨＩＶタンパク質に特異的な細胞性免疫応答を示し、このことはアフリカの売春婦（Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ＳＬ、Ｊ Ｓｏｔｔｏｎ、Ｋ Ａｒｉｙｏｓｈｉ、Ｔ Ｄｏｎｇ、Ｆ Ｇｏｔｃｈ、ｓ ＭｃＡｄａｍｓ、Ｄ Ｗｈｉｔｂｙ、Ｓ Ｓａｂａｌｌｙ、Ａ Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ、Ｔ Ｃｏｒｒａｈ、Ｍ Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ、Ｔ Ｓｃｈｌｔｚ、Ａ ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ｈ Ｗｈｉｔｔｌｅ、１９９５、ＨＩＶに曝露されたが感染していないガンビアの女性のＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞（HIV-specific cytotoxic T cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women）、ネイチャーメディスン（Nature Medicine）、１：５９〜６４）及び血清陽性の母親から生まれた子供に当てはまる。（Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ＳＬ、ＤＦ Ｎｉｘｏｎ、ＭＣ Ａｌｄｈｏｕｓ、Ｆ Ｇｏｔｃｈ、Ｋ Ａｒｏｙｏｓｈｉ、Ｎ Ｈａｌｌａｍ、ＪＳ Ｋｒｏｌｌ、Ｋ Ｆｒｏｅｂｅｌ、Ａ ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、ＨＩＶに曝露されたが感染していない乳児のＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞活性（HIV specific cytotoxic T-cell activity in an HIV-exposed but uninfected infant）、ランセット（Lancet）、１９９３、３４１：８６０〜８６１）さらに、長期未発症者は強いＣＴＬ応答を示す（Ｃａｏ、Ｙ、Ｑｉｎ Ｌ、Ｚｈａｎｇ Ｉ、Ｓａｆｒｉｔ Ｊ、及びＨｏ ＤＤ、ニューイングリッシュジャーナルオブメディスン（New Engl J Med）、１９９５、３３２：２０１〜２０８；Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｙ、ＭｃＣｈｅｓｎｅｙ ＭＢ、Ｐｏｒｒｏｔ Ｅ等、ＡＩＤＳ研究とヒトレトロウイルス（AIDS Res Hum Retroviruses）、１１：９０３〜９９０）；ＨＬＡクラスＩタイプは、ＨＩＶ−１感染個体の病気の進行速度と関連付けられた（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｍ．、Ｇ．Ｗ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｍ．Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｔ．Ｋｉｓｓｎｅｒ、Ｄ．Ｖｌａｈｏｖ、Ｊ．Ｊ．Ｇｏｅｄｅｒｔ、Ｒ．Ｋａｓｌｏｗ、Ｓ．Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ、Ｋ．Ｈｏｏｔｓ、及びＯ．Ｂ．ＳＪ．１９９９．ＨＬＡとＨＩＶ−１：ヘテロ接合体の利点とＢ^*３５−Ｃｗ^*０４の欠点（HLA and HIV-1: heterozygote advantage and B^*35-Cw^*04 disadvantage）、サイエンス（Science）、２８３：１７４８〜５２）。ＣＴＬ応答は、自然感染において中和抗体に先行し、急性感染におけるウイルス血症の制御と関連付けられており（Ｋｏｕｐ ＲＡ、Ｓａｆｒｉｔ ＪＴ、Ｃａｏ Ｙ等、初期ヒト免疫不全症候群におけるウイルス血症の初期制御に対する細胞性免疫応答の時間的関連（Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency syndrome）、ウイルス学ジャーナル（J Virol）、１９９４；６８：４６５０〜４６５５）、ＡＩＤＳへの進行は、ＣＴＬ活性の減少との相関性が高い。（Ｈａｒｒｅｒ Ｔ、Ｈａｒｒｅｒ Ｅ、Ｋａｌａｍｓ Ｓ、Ｅｌｂｅｉｋ Ｔ、Ｓｔａｐｒａｎｓ Ｓ、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ＭＢ、Ｃａｏ Ｙ、Ｈｏ ＤＤ、Ｙｉｌｍａ Ｔ、Ｃａｌｉｅｎｄｏ Ａ、Ｊｏｎｓｏｎ ＲＰ、Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ Ｓ、及びＷａｌｋｅｒ Ｂ．健常な長期無症候性ＨＩＶ感染におけるＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答（HIV-specific CTL- response in healthy long-term asymptomatic HIV infection）、ＡＩＤＳ研究とヒトレトロウイルス（AIDS Res Hum Retroviruses）、１９９６、１２、７：５８５〜５９２）。最後に、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するワクチンは、ＨＩＶ感染のＳＩＶモデルにおいて感染結果に有利に作用し得る（Ｂａｒｏｕｃｈ、Ｄ．Ｈ．、Ｓ．Ｓａｎｔｒａ、Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｔｚ、Ｍ．Ｊ．Ｋｕｒｏｄａ、Ｔ．Ｍ．Ｆｕ、Ｗ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．Ｂｉｌｓｋａ、Ａ．Ｃｒａｉｕ、Ｘ．Ｘ．Ｚｈｅｎｇ、Ｇ．Ｒ．Ｋｒｉｖｕｌｋａ、Ｋ．Ｂｅａｕｄｒｙ、Ｍ．Ａ．Ｌｉｆｔｏｎ、Ｃ．Ｅ．Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、Ｗ．Ｌ．Ｔｒｉｇｏｎａ、Ｋ．Ｐｕｎｔ、Ｄ．Ｃ．Ｆｒｅｅｄ、Ｌ．Ｇｕａｎ、Ｓ．Ｄｕｂｅｙ、Ｄ．Ｃａｓｉｍｉｒｏ、Ａ．Ｓｉｍｏｎ、Ｍ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｍ．Ｃｈａｓｔａｉｎ、Ｔ．Ｂ．Ｓｔｒｏｍ、Ｒ．Ｓ．Ｇｅｌｍａｎ、Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、Ｍ．Ｇ．Ｌｅｗｉｓ、Ｅ．Ａ．Ｅｍｉｎｉ、Ｊ．Ｗ．Ｓｈｉｖｅｒ、及びＮ．Ｌ．Ｌｅｔｖｉｎ、２０００、サイトカインで増強したＤＮＡワクチン接種による、アカゲザルのウイルス血症の制御及び臨床的ＡＩＤＳの予防（Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination）、サイエンス（Science）、２９０：４８６〜９２；Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ、Ａ．、Ｍ．Ｃｒａｎａｇｅ、Ｎ．Ｃｏｏｋ、Ｎ．Ａｌｍｏｎｄ、Ｊ．Ｂｏｏｔｍａｎ、Ｅ．Ｒｕｄ、Ｐ．Ｓｉｌｖｅｒａ、Ｍ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｔ．Ｃｏｒｃｏｒａｎ、Ｊ．Ｓｔｏｔｔ、Ａ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、及びＦ．Ｇｏｔｃｈ、１９９５、ワクチン接種マカクにおける、ＣＤ８＋ｎｅｆ特異的細胞障害性Ｔ細胞によるＳＩＶ複製の初期抑制（Early suppression of SIV replication by CD8+nef-specific cytotoxic T cells in vaccinated macaques）、ネイチャーメディスン（Nature Med）、１：１１６７〜１１７３）。
【００１０】
これらの実験から得られる知見のすべてが、治療及び予防戦略は、それらの目標の少なくとも１つとして、この免疫応答という武器の誘導／維持／回復を含むべきであるということを強く示唆している。
【００１１】
動物又はヒトにおいて、ＣＴＬを産生するために様々な方法が開発されてきた。これまでのところ、最も効果的な方法は、生きている組換えベクターである。この方法は、無害なウイルス又はバクテリアを使用して、病原体から選択した遺伝子をレシピエントの細胞中に輸送し、そこで選択した抗原を産生させるものである。細胞中に遺伝子を送達するこの操作は、宿主中でのＣＴＬエピトープのプロセシング、ＭＨＣ−Ｉ分子によるそれらの提示、及びその後のＣＴＬクローンの効率的な刺激を最大化するものである。
【００１２】
ベクターとしてより成功裡に使用されてきたウイルスは、ポックスウイルス（ポックスウイルス科）である。この科の最もよく知られたメンバーは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）であり、これは天然痘撲滅運動中に大量にヒトに使用された。
【００１３】
ＨＩＶタンパク質のＶＶ組換え体を用いて幾つかの臨床試験が実施された（Ｃｏｒｅｙ Ｌ、ＭｃＥｌｒａｔｈ Ｊ、Ｗｅｉｈｏｌｄ Ｋ、Ｍａｔｔｈｅｗａ Ｔ、Ｓｔａｂｌｅｉｎ Ｄ、Ｇｒａｈｍ Ｂ、Ｋｅｅｆｅｒ Ｍ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｄ、Ｇｏｒｓｅ Ｇ、組換えワクチン療法を用いた、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１エンベロープに対する細胞障害性Ｔ細胞及び中和抗体の応答（Cytotoxic T Cell and Neutralizing Antibody Responses to Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope with a combination vaccine regimen）、感染症ジャーナル（J Infectious Dis）、１９９８、１７７：３０１〜９；Ｇｒａｈａｍ ＢＳ、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＴＪ、Ｂｅｌｓｈｅ Ｒ、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＭＬ、Ｄｏｌｉｎ Ｒ、Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ、Ｇｏｒｓｅ ＧＪ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＤＨ、Ｋｅｅｆｅｒ ＭＣ、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ ＤＰ、Ｃｏｒｅｙ Ｌ、Ｓｔａｂｌｅｉｎ Ｄ、Ｅｓｔｅｒｌｉｔｚ ＪＲ、Ｈｕ ＳＬ、Ｓｍｉｔｈ ＧＥ、Ｆａｓｔ Ｐ、Ｋｏｆｆ Ｗ、感染症ジャーナル（J Infectious Dis）、１９９３、１６７：５３３〜７）。しかし、ＶＶをヒトに使用するには、２つの主な制限がある：（１）ワクチン接種を受けた人のうちの少数が、免疫不全（ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）個体の場合に致命傷になり得る強い有害反応を示した、（２）過去にＶＶワクチン接種を受けた人は、異種抗原に対する応答が悪くなる。
【００１４】
これらの欠点に対する解決策は、ＶＶの代わりにアビポックスウイルスを使用することである。これらはポックスウイルス科のメンバーであるが、その複製はトリ細胞に限られており、その複製サイクルはヒト細胞ではうまく働かない。カナリア痘瘡ウイルス（ＣＰＶ）及び鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）の２種類のアビポックスウイルスがこれらの目的で使用されている。
【００１５】
腫瘍関連抗原である種々のヒト病原体のアビポックスウイルス組換え体は、動物のＣＴＬ応答を誘導する（Ｌｉｍｂａｃｈ ＫＪ、及びＥ Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、非複製発現ベクター：ワクチン開発及び遺伝子治療への応用（Non-replicating expression vectors: applications in vaccines development and gene therapy）、疫学と感染症（Epidemiol. Infect）、１１６：２４１〜２５６）。組換えアビポックスウイルスをワクチン開発に使用することは米国で特許化され（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ．他、１９９２年、米国特許第５１７４９９３号、Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ．他、１９９３年、米国特許第５５０５９４１号）、特に、組換えアビポックスウイルスをレンチウイルス抗原に使用する特許出願が欧州で提出された（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ等、欧州特許第０９５６３６０号）。
【００１６】
ＨＩＶ−１ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖのＣＰＶ組換え体が、第一相及び第二相治験において健常ボランティアで評価された（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ−Ｍａｎｎ ＭＬ、Ｋ Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、ＴＪ Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ＢＳ Ｇｒａｈａｍ、ＧＬ Ｇｏｒｓｅ、ＭＣ Ｋｅｅｆｅｒ、ＭＪ ＭｃＥｌｒａｔｈ、Ｒ−Ｈ Ｈｓｉｅｈ、Ｊ Ｍｅｓｔｅｃｋｙ、Ｓ Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ、Ｊ Ｍａｓｃｏｌａ、Ｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ、Ｌ Ｃｏｒｅｙ、ＰＦ Ｗｒｉｇｈｔ、Ｒ Ｂｅｌｓｈｅ、Ｒ Ｄｏｌｉｎ、Ｓ Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｓ Ｘｕ、Ｐ Ｆａｓｔ、ＭＣ Ｗａｌｋｅｒ、Ｄ Ｓｔａｂｌｅｉｎ、Ｊ−Ｌ Ｅｘｃｌｅｒ、Ｊ Ｔａｒｔａｇｌｉａ、Ａ−Ｍ Ｄｕｌｉｅｇｅ、Ｆ Ｓｉｎａｎｇｉｌ、Ｅ Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９８、血清陰性成体において、ＨＩＶ−１ＭＮ ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１ＳＦ２組換えｇｐ１２０を発現するカナリア痘瘡、及び両方のワクチンによって誘導される、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプ１に対する免疫応答（Immune responses to Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type 1 induced by Canarypox expressing HIV-1MN gp120, HIV-1SF2 recombinant gp120, or both vaccines in seronegative adults）、感染症ジャーナル（J Infect Dis）、１７７：１２３０〜１２４６；Ｅｇａｎ ＭＡ、ＷＡ Ｐａｖｌａｔ、Ｊ Ｔａｒｔａｇｌｉａ、Ｅ Ｐａｏｌｅｔｔｉ、ＫＪ Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、ＭＬ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、ＲＦ Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ、１９９５、ＨＩＶ−１ ＭＮ ｅｎｖ遺伝子を有する非複製宿主域限定カナリア痘瘡ベクター（ＡＬＶＡＣ）による、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）特異的細胞溶解性Ｔ細胞応答の血清陰性成体における誘導（Induction of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1)-specific cytolytic T lymphocyte responses in seronegative adults by a nonreplicating, host-range-restricted canarypox vector (ALVAC) carrying the HIV-1 MN env gene）、感染症ジャーナル（J Infect Dis）、１７１：１６２３〜１６２７）。少なくとも１つのＨＩＶ抗原に対するＣＴＬが、ウガンダにおける第一相治験のワクチン接種の５０％、第二相治験の３０％、最終第一相の１０％未満で報告された。このｒＣＰＶ（ｖＣＰ２０５）は、ゲノム中の異なる３箇所の非必須領域にＨＩＶ遺伝子を挿入して作製され、複数のＨＩＶ標的に対してＣＴＬ応答を示した。
【００１７】
一方、ＦＰＶも、ＤＮＡ免疫と併用して、マカクのＨＩＶ抗原に対するＣＴＬ応答を誘導するのに使用されてきた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＨＬ、ＤＣ Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、ＲＰ Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＫＨ Ｍａｎｓｏｎ、ＭＬ Ｋａｌｉｓｈ、ＪＤ Ｌｉｆｓｏｎ、ＴＡ Ｒｉｚｖｉ、Ｓ Ｌｕ、Ｓ−Ｌ Ｈｕ、ＧＰ Ｍａｚｚａｒａ、ＤＬ Ｐａｎｉｃａｌｉ、ＪＧ Ｈｅｒｎｄｏｎ、Ｒ Ｇｌｉｃｋｍａｎｍ、ＭＡ Ｃａｎｄｉｄｏ、ＳＬ Ｌｙｄｙ、ＭＳ Ｗｙａｎｄ、及びＨＭ ＭｃＣｌｕｒｅ、１９９９、ネイチャーメディスン（Nature Medicine）、５：５２６〜５３４）。免疫源をこのように併用すると、ＨＩＶ−１／ブタオザル感染モデルでは、あるレベルの防御がもたらされた（Ｋｅｎｔ ＳＪ、Ａ Ｚｈａｏ、ＳＪ Ｂｅｓｔ、ＪＤ Ｃｈａｎｄｌｅｒ、ＤＢ Ｂｏｙｌｅ、ＩＡ Ｒａｍｓｈａｗ、ＤＮＡによる連続した初回抗原刺激と組換え鶏痘ウイルスによる追加免疫からなるヒト免疫不全ウイルスタイプ１ワクチン療法のＴ細胞免疫原性及び予防効果の亢進（Enhanced T-Cell immunogenicity and protective efficacy of a human immunodeficiency virus type 1 vaccine regime consisting of a consecutive priming with DNA and boosting with recombinant fowlpox virus）、１９９８、ウイルス学ジャーナル（J Virol）、７２：１０１８０〜１０１８８）。しかし、ブタオザルのＨＩＶ感染は、非効率的で再現が困難なので、この動物モデルには重大な限界がある。
【００１８】
幾つかの病原体に由来する一連の正確なＣＴＬエピトープからなるミニ遺伝子を用いた免疫によって、ＣＴＬ応答が引き起こされることも報告されている（Ｗｈｉｔｔｏｎ Ｌ、Ｓｈｅｎｇ Ｎ、Ｏｌｄｓｔｏｎｅ ＭＢ、及びＭｃＫｅｅ Ｔ、連結されたミニ遺伝子を含む「数珠（ｓｔｒｉｎｇ ｏｆ ｂｅａｄｓ）」ワクチンは、致死量を投与したウイルス接種に対して保護作用を示す（A "string of beads" vaccine, comprising linked minigenes, confers protection from lethal-dose virus challenge）、ウイルス学ジャーナル（J Virol）、１９９３、６７、１：３４８〜３５２；幾つかの微生物由来のＢ細胞、細胞障害性Ｔリンパ球、及びＴｈエピトープを含む多価ミニ遺伝子ワクチンは、インビボで適切な応答を誘導し、複数の病原体に対して保護作用を示す（A multivalent minigene vaccine, containing B-cell, cytotoxic T-Lymphocyte and Th epitopes from several microbes、induces appropriate responses in vivo and confers protection against more than one pathogen）、ウイルス学ジャーナル（J Virol）、７１、３：２２９２〜２３０２）。
【００１９】
ｇａｇ遺伝子全体と共にｇａｇにより誘導されるミニ遺伝子の改変ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）組換え体を用いて、マウスでＣＴＬ応答が誘導された（Ｈａｎｋｅ Ｔ、ＲＶ Ｓａｍｕｅｌ、ＴＪ Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、ＶＣ Ｎｅｕｍａｎｎ、ＴＭ Ａｌｌｅｎ、ＪＥ Ｂｏｙｓｏｎ、ＳＡ Ｓｈａｒｐｅ、Ｎ Ｃｏｏｋ、ＧＬ Ｓｍｉｔｈ、ＤＩ Ｗａｔｋｉｎｓ、ＭＰ Ｃｒａｎａｇｅ、ＡＪ ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、１９９９、マルチエピトープ遺伝子と、ＤＮＡ初回抗原刺激によって改変したワクシニアウイルスアンカラの追加免疫ワクチン接種療法とを用いた、マカクのサル免疫不全ウイルス特異的細胞障害性Ｔリンパ球の効果的誘導（Effective induction of simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T lymphocytes in macaques by using a multiepitope gene and DNA prime-Modified Vaccinia Virus Ankara boost vaccination regimen）、ウイルス学ジャーナル（J Virol）、７３、９：７５２４〜７５３２）。これらのミニ遺伝子は、ｇａｇに由来する一連の別個のＣＴＬエピトープからなる。
【００２０】
ミニ遺伝子による手法の主な限界は、個々のＣＴＬエピトープの組合せが、限られた範囲のＨＬＡ抗原しか対象とせず、したがって誘発されるＣＴＬ応答は、当然、かなり限定されたものになるということである。
【００２１】
（発明の説明）
本発明の本質は、ＨＩＶタンパク質由来のＣＴＬエピトープリッチ領域からなるキメラ遺伝子を構築することであり、これらの領域は内部に保存されたタンパク質とウイルスの生活環の極めて初期に発現される調節タンパク質の双方から選択される。
【００２２】
この解決策は、多数のＨＬＡ対立遺伝子によって提示される重複したＣＴＬエピトープを同時にプロセシングすることが可能なので、前記ＨＩＶミニ遺伝子よりも有利である。この解決策の別の利点は、幾つかのＨＩＶ−１タンパク質の他のアビポックスウイルス組換え体と比較して、幾つかのタンパク質に由来する免疫学的に関連した領域が単一遺伝子内に集中していることにより、組換えウイルスの生成が促進され、同一組換えウイルスにおいて幾つかの抗生物質耐性系を使用する必要がなくなることである。また、これは、単一の組換えウイルスにおいて、幾つかのＨＩＶサブタイプ由来のエピトープを組み合わせることを促進するものである。この選択領域は、最も変異の少ないウイルスタンパク質及び初期に発現された調節産物に属する。これらのＣＴＬエピトープリッチ領域は、２個のリジンが隣接しそれによって保護されたヘルパーＴ細胞エピトープと相まって、細胞プロテアーゼによるそれらのプロセシングを促進する。最後に、モノクローナル抗体によって認識されるＢ細胞エピトープを加えて、免疫化学的手法によるポリペプチドの検出を促進させる。
【００２３】
キメラ遺伝子は、種々のＤＮＡ断片を一緒に結合させて構築されるが、その断片は、化学合成により生成されるものもあれば、ＨＩＶ遺伝子を鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されるものもある。このＤＮＡ断片を、適当なプラスミドベクター中で一緒にクローン化し、配列を決定し、ポックスウイルス組換えベクターに移す。
【００２４】
より具体的には、本発明は、遺伝子ｃｒ３に関し、この遺伝子はＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ４１、及びＶｐｒ由来のＴｈ細胞エピトープ、Ｍａｂ ２Ｃ４によって認識されるｇｐ１２０のＶ３ループ上のエピトープ（Ｄｕａｒｔｅ ＣＡ、Ｐｅｒｅｚ Ｌ、Ｖａｚｑｕｅｚ Ｊ、Ｄｕｅｎａｓ Ｍ、Ｖｉｌａｒｕｂｉａ ＯＬ、Ｎａｖｅａ Ｌ、Ｖａｌｄｅｓ Ｒ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｍｏｎｔｅｒｏ Ｍ、Ａｙａｌａ Ｍ、及びＧａｖｉｌｏｎｄｏ Ｊ．、ＨＩＶ−１ Ｖ３ループに対する２種のモノクローナル抗体のエピトープマッピング、Ｖ領域ＤＮＡ配列、及び中和Ｆａｂ断片（Epitope mapping, V region DNA sequence, and neutralizing Fab fragments of two monoclonal antibodies against the HIV-1 V3 loop）、免疫技術（Immunotechnology）、１９９６、２：１１〜２０）、並びにＲＴ、Ｇａｇ、及びＮｅｆタンパク質上のＣＴＬエピトープリッチ領域を含む。
【００２５】
これらのキメラ遺伝子を、生きている細菌又はウイルスのベクター（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、ＢＣＧ、サルモネラ）、好ましくはポックスウイルス、より具体的にはアビポックスウイルス、さらに具体的にはＦＰＶのゲノム中に挿入する。これらの生きている組換えベクターを用いて、動物又はヒトのＨＩＶに対して、ＴＨ１免疫応答及び細胞障害性Ｔ細胞を誘導する。
【００２６】
さらに具体的には、本発明は、これらキメラタンパク質のＦＰＶ組換え体、特にＦＰＣＲ３及びＦＰＳＣＲ３ｇｐｔと称する組換えＦＰＶ株に関し、これはキメラ遺伝子ｃｒ３を含んでいる。ｃｒ３を、上述のように構築した後、ポックスウイルス組換えベクター、特にＦＰＶ組換えベクター中にクローン化する。この具体例では、プラスミドｐＥＦＬ２９及びｐＦＰ６７ｘｇｐｔを組換えベクターとして使用した。ｐＥＦＬ２９には、ＦＰＢゲノムの６ｋｂ ＢａｍＨＩ末端断片に相同な領域が存在し、これは異種遺伝子が挿入されるＶＶ ７．５Ｋプロモーター制御下の転写ユニットに隣接し、ＦＰＶの４ｂプロモーターの制御下にある被レポート遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｇｅｎｅ）及びＬａｃＺも含む。ｐＦＰ６７ｘｇｐｔには、相同組換えシグナルとして、１１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ領域由来のオープンリーディングフレーム６及び７がある。これらの領域は、異種遺伝子が位置する合成ポックスウイルスＥ／Ｌプロモーター制御下の転写ユニットに隣接し、組換えウイルスの選択を可能にするマイコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ遺伝子も含む。
【００２７】
得られたプラスミドをそれぞれｐＦＰＣＲ３及びｐＦＰＳＣＲ３ｇｐｔと称する。これらのプラスミドを、現況技術で可能ないくつかのトランスフェクション技術のうちの１つを用いて、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の初代培養物にトランスフェクトする。この具体例では、トランスフェクションは、ＦＰＶのＦＰ２９株に予め感染させたＣＥＦ中でリポフェクチン（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて実施されるが、他の方法、とりわけエレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法なども使用することができる。プラスミドとＦＰＶゲノム上の対応する非必須領域との相同組換えの結果、ｐＦＰＣＲ３の場合はＢガラクトシダーゼを発現する組換えウイルスを、ｐＦＰＳＣＲ３ｇｐｔの場合はマイコフェノール酸耐性のＢガラクトシダーゼ発現組換えウイルスを回収することができる。選択マーカーが存在すると、組換えウイルスのプラークを同定し、また、それらをＣＥＦで数回継代させることによって精製することができる。選択したウイルスに異種遺伝子が存在するかどうかはＰＣＲで確認することができ、タンパク質の発現はウェスタンブロット法で確認することができる。
【００２８】
本発明は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＣＴＬ活性を伴うＴＨ１免疫応答を誘導し、上述のようにして得られる組換えＦＰＶの単独での使用、又は現況技術の製剤から選択される薬剤的に許容される製剤との併用にも関する。
【００２９】
本発明は、前記キメラ遺伝子の組換えＦＰＶ、特にＦＰＣＲ３及びＦＰＳＣＲ３ｇｐｔと、ＴＨ１免疫応答を選択的に刺激する免疫調節薬又はアジュバント、とりわけＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＦＮγ、ＧＭＳＣＦ、ＧＳＣＦなどのサイトカインとを治療又は予防に併用することにも関する。
【００３０】
特に、本発明は、ＦＰＣＲ３又はＦＰＳＣＲ３ｇｐｔウイルスと、１日量が１０²〜１０⁷ｉｕの範囲のＩＬ２とを動物又はヒトに併用することに関する。ＦＰＶ投与開始日以降に、ＩＬ２をＢａｌｂ／ｃマウスに毎日投与すると、ＣＲ３に対する細胞免疫応答が増強される。
【００３１】
本発明は特にＣＲ３に関するが、ＣＲ３中のＣＴＬリッチ断片以外のＣＴＬリッチ断片、又はＣＲ３中のＣＴＬリッチ断片に相当する断片だけでなく、他のＨＩＶ−１分離株由来の断片も使用できることは、本質的に本発明の範囲内にある。
【００３２】
同様に、本発明は特にＦＰＶのＦＰ９株に関するが、他のＦＰＶ親株を用いて、組換えウイルス、並びにＣＰＶなどの他のアビポックスウイルス、ＶＶ、ＭＶＡなどの他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルスなどさらに別のウイルス、さらにＢＣＧ、サルモネラなどの細菌さえも構築できることは、本質的に本発明の範囲内にある。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、前記遺伝子を適当なプラスミドベクター中にクローン化して哺乳動物細胞内で発現させることができ、また、薬剤的に許容されるキャリアと組み合わせて哺乳動物に注射してＴＨ１免疫応答及びＣＴＬ活性を誘導することができる。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態は、上述の組換えプラスミドと、免疫調節薬、或いは上述のアジュバント又はリポソーム、多糖、リポペプチド、脂質、蛋白リポソーム、それらの組合せなどさらに別のアジュバントとを、治療又は予防に併用することも含む。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態では、これらの遺伝子を別のプラスミド中にクローン化して、細菌、酵母、真菌、昆虫、又は哺乳動物の細胞、植物において、又はトランスジェニック動物の乳中で、組換えタンパク質を発現させることができる。これらの系から回収したタンパク質を用いて、薬剤的に許容されるキャリア中で発現される適当なものの中に投与した時に、動物又はヒトにおいて、ＴＨ１免疫応答及びＣＴＬ活性を誘導することもできる。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態は、ＣＲ３タンパク質と、免疫調節薬、或いは上述のアジュバント又はリポソーム、多糖、脂質、蛋白リポソームなどさらに別のアジュバント、或いは動物又はヒトのＴＨ１タイプ免疫応答及びＣＴＬ活性を増強可能で現況技術により入手可能な他のアジュバントとを治療又は予防に併用することも含む。
【００３７】
（実施例）
実施例１．ｃｒ３の入手
ｃｒ３は、種々のＨＩＶ遺伝子断片で構築されたキメラ遺伝子である。これは、ｐＴＡＢ９と本質的に等しいｐＴＡＢ１１プラスミド上に構築されているが（Ｇｏｍｅｚ ＣＥ、Ｎａｖｅａ Ｌ、Ｌｏｂａｉｎａ Ｌ、Ｄｕｂｅｄ Ｍ、Ｅｘｐｏｓｉｔｏ Ｎ、Ｓｏｔｏ Ａ、及びＤｕａｒｔｅ ＣＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０で補助されたＶ３ループを基にしたマルチエピトープポリペプチドＴＡＢ９は、非ヒト霊長類で免疫原性が高く、５種のＨＩＶ分離株に対する中和抗体を誘導する（The V3 loop based Multi-Epitope Polypeptide TAB9 Adjuvated with Montanide ISA720 is Highly Immunogenic in Nonhuman Primates and Induces Neutralizing Antibodies Against Five HIV-1 isolates）、ワクチン（Vaccine）、１７：２３１１〜２３１９、１９９９）、Ｐ６４Ｋタンパク質のＮ−末端部分をコードする断片の代わりに、その遺伝子の５’末端にｇｐ１２０由来のＴ１及びＴ２ Ｔヘルパー細胞エピトープを有する。ｇｐ１２０由来のＴ２エピトープ、ＭＮ株のＶ３エピトープ、並びにｇｐ４１及びｖｐｒ由来のＴヘルパー細胞エピトープをコードする１８６ｂｐ平滑末端ＢａｍＨＩ合成ＤＮＡ断片を、予めＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩで消化したｐＴＡＢ１１中にクローン化する。２個の連続するリジンをコードするＤＮＡ配列を、個々のエピトープ間に挿入して、細胞内プロセシングを促進させた。得られたプラスミドをｐＣＲ１と命名した。（ＨＩＶ−１ ＳＦ２プロウイルス由来の２６６３〜３１０９を有する）ｐ６６／ｐ５１（ＲＴ）タンパク質をコードする６０３ｂｐ断片を、Ｏ．２６６０及びＯ．２６６１プライマーを用いてＰＣＲで増幅した（表１）。このＰＣＲ断片を、低融点アガロースから抽出し、ＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐＣＲ１ベクターにサブクローニングしてＣＲ２タンパク質をコードするｐＣＲ２プラスミドを得た。次に、（ＨＩＶ−１ ＬＡＩ単離株由来の８５１６〜８８１８を有する）ｎｅｆ遺伝子配列を含む３２４ｂｐ断片を、Ｏ．２６６２及びＯ．２６６３プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。最後に、（ＨＩＶ−１ ＳＦ２由来の１４５１〜１６９６を有する）ｇａｇ遺伝子中の２６７ｂｐの別のセグメントをＯ．２６６４及びＯ．２６６５プライマーを用いて増幅した（表１）。次いで、２０ｐｍｏｌのＯ．２６６２及びＯ．２６６６プライマーを用いてオーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を実施した（表１）。各鎖（ｂａｎｄ）の等量（０．４７ｐｍｏｌ）を、それぞれＰＣＲ緩衝液［ＫＣｌ ５０ｍＭ；トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、（ｐＨ８．３）、２５℃；ゼラチン０．００１％］、ＭｇＣｌ₂ ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、及び４ＵのＴａｑポリメラーゼ中で、５０μＬの容量で混合した。Ｏ．２６６３及びＯ．２６６４オリゴヌクレオチドの９ｂｐ相補末端による、これらの鎖のアニーリングを促進するために、この混合物をまず９２℃で２分間加熱し、次いで５０℃に冷却した。最後に、温度を７２℃に５分間上げて、アニーリングしたセグメントを伸長させた。その後、１０μＬの上記反応生成物を２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌのＯ．２６６２及び２０ｐｍｏｌのＯ．２６６６、及び４ＵのＶｅｎｔ ｐｏｌ．を含有する全容量が５０μＬのＰＣＲ緩衝液混合物に添加した。標準の増幅条件は、９２℃で２分間、その後９２℃４０秒間、５０℃１分間、及び７２℃１分間を３０サイクル、最後に伸長が７２℃で５分間であった。次に、重複ｎｅｆ−ｐ２４の増幅鎖を、低融点アガロース中で電気泳動して精製し、ＸｂａＩで消化した。最後に、形成された平滑末端ＸｂａＩの鎖を、ＮｒｕＩ−ＸｂａＩで予め切断したｐＣＲ２ベクター中にクローン化して、ｐＣＲ３プラスミドを得た。したがって、ｃｒ３は、Ｔヘルパー細胞及び広範なＨＬＡ抗原によって提示されるｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｖｐｒ、ＲＴ、ｎｅｆ、及びｇａｇ由来のＣＴＬエピトープを含むキメラタンパク質をコードしている（表２）。
【００３８】
【表１】

【００３９】
【表２】

【００４０】
実施例２．ｐＦＰＬ２９中でのｃｒ３のクローニング
ｃｒ３遺伝子は、ｐＣＲ３では、ｐＴｒｙｐの制御下でクローン化され、５’にＣｌａＩ部位、３’にＴ４ファージ遺伝子３２ターミネーター及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を有していた。このプラスミドをＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ Ｉで処理して５’末端にＡＴＧ、３’末端に翻訳停止コドンを有するｃｒ３遺伝子を得た。このＤＮＡ断片をポックスウイルス組換えベクターｐＥＦＬ２９中にクローン化した。
【００４１】
ｐＥＦＬ２９は、ＦＰＶゲノム内の相同組換え用非必須領域として、ＦＰＶのＢａｍＨ１ ６Ｋｂ末端断片を有する。この断片は、３個のＯＲＦを含み、ＯＲＦ１は分断されている。これらの相同領域に隣接するのは、ＶＶ ｐ７．５Ｋ、プロモーター、それに続くＳｍａＩ部位、ＦＰＶの後期プロモーター４ｂの制御下にあるレポーター遺伝子ｌａｃＺである。このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子及び細菌の複製起点も含んでいる。
【００４２】
ＰＥＦＬ２９を、ＳｍａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、ｃｒ３遺伝子を含むＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した鎖と連結させた。ｐ７．５Ｋの制御下で正しく配向したｃｒ３を有する幾つかのクローンを選択した。大腸菌株ＤＨ５α（φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒＫ− ｍＫ＋）、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｄｅｏＲ、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９）を用いて、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地中で組換えプラスミドを増殖させ、選択した。遺伝子操作はすべて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、１９８９、分子クローニング 研究所マニュアル第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Sec Ed. Cold Spring Harbor Laboratory）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）に従って行った。
【００４３】
クローンｐＥＦＬ−ｃｒ３（図１）のＤＮＡ配列を、自動配列プロセッサ（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて確認した。このクローンをＣｓＣｌ勾配を用いて精製し、それを用いてニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にトランスフェクトした。
【００４４】
実施例３．ｐＦＰ６７ｘｇｐｔ中でのｃｒ３のクローニング
ｃｒ３遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐＭｏｓｂｌｕｅベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）中にクローン化した。得られたプラスミドを、ｐＴＣＲ３と命名した。ｐＴＣＲ３をＨｐａＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｃｒ３を含む短い方の鎖をポックスウイルスベクターｐＦＰ６７ｘｇｐｔ中にクローン化した。
【００４５】
ｐＦＰ６７ｘｇｐｔは、ＦＰＶゲノム内の相同組換え用非必須領域として、ＦＰＶゲノムの１１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を有する（Ｔｏｍｌｅｙ Ｆ、Ｂｉｎｎｓ Ｍ、Ｃａｍｐｗｅｌｌ Ｊ、Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ Ｍ、鶏痘ウイルスの末端近くにある（ｎｅａｒ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）１１．２キロベースＢａｍＨＩ断片の配列分析（Sequence Analysis of an 11.2 Kilobase, near-terminal, Bam HI fragment of fowlpox virus）、一般ウイルス学ジャーナル（J Gen Virol）、１９８８、６９、１０２５〜１０４０）。この断片は、この領域のオープンリーディングフレーム６及び７を含み、この遺伝子間領域で挿入が起こる。これらの相同領域に隣接するのは、Ｅ／Ｌ合成プロモーター（Ｃａｒｒｏｌｌ ＭＷ、Ｍｏｓｓ Ｂ、組換えワクシニアウイルス用マーカーとしての大腸菌Ｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（E. coli B-glucoronidase (GUS) as a marker for recombinant vaccinia viruses）、バイオ技術（Biotechniques）、１９９５、１９、３：３５２〜３５４）、及びＶＶの７．５Ｋプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子Ｅｃｏｇｐｔである。このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子及び細菌の複製起点も含んでいる。
【００４６】
プラスミドｐＦＰ６７ｘｇｐを、ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ｐＴＣＲ３のＨｐａＩ／ＢａｍＨＩ消化由来のＤＮＡ断片を含むｃｒ３と連結させた。Ｅ／Ｌ合成プロモーターの制御下で適正に配向したｃｒ３を含む幾つかのクローンを選択した（図１）。大腸菌株ＤＨ５α（φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒＫ− ｍＫ＋）、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｄｅｏＲ、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９）を用いて、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地中で組換えプラスミドを増殖させ、選択した。遺伝子操作はすべて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等に従って行った。クローンｐＦＰ６７ｘｇｐｔｃｔのＤＮＡ配列を、自動配列プロセッサ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて確認した。このクローンをＣｓＣｌ勾配を用いて精製し、それを用いてＣＥＦにトランスフェクトした。
【００４７】
実施例４．組換えＦＰＶの生成
組換え体の生成に使用した親ＦＰＶは、ＣＥＦでの６回連続の継代、さらにしょう尿膜での２回の継代、最後にＣＥＦでの４３８回の継代により病原体株ＨＰ−１から誘導された弱毒ＨＰ−４３８株であった（Ｍａｙｒ Ａ及びＫ Ｍａｌｉｃｋｉ、１９６６、細胞培養における毒性鶏痘ウイルスの弱毒化及び弱毒ウイルスの特性（Attenuierung von virulentem Huhnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus）、中央獣医学誌シリーズＢ（Zentralbl. Veterinaermed. Reihe B）、１３：１〜１３）。次いで、２回プラーク精製したＨＰ４３８（ＦＰ９）単離株を６回継代してストックを形成した。ＦＰＶストックを、２％新生子ウシ血清（ＮＢＣＳ）を含有する１９９培地中のＣＥＦで増殖させた。
【００４８】
前記と同様に、ＦＰ９とプラスミドｐＥＦＬ２９又はその誘導体との相同組換えにより組換えＦＰＶを生成させた。２５ｃｍ²フラスコ中で増殖させたＣＥＦを、２プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）でＦＰ９に感染させ、次いで２時間後、この細胞にＣｓＣｌで精製した１０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＦＬ−ｃｒ３又はｐＦＰ６７ｘｇｐｔｃｔｌ）を２０μｇのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国）を用いてトランスフェクトした。新鮮な培地（１０％トリプトースホスフェートブロス及び２％ＮＢＣＳを含有する１９９培地３ｍｌ）を添加し、ＣＯ₂インキュベータ中３７℃でこの細胞をインキュベートした。新鮮な培地を２４時間後に再び添加し、次いでこの細胞をさらに３〜４日間インキュベートした。その後、この細胞を、３回凍結融解させた。次いで、組換えウイルスを選択するために、この細胞の溶解物をＣＥＦ中で滴定した。２時間吸着させた後、このウイルス接種原を除去し、ＥＭＥＮを含有するアガロース層を添加した。この層は、２％低融点アガロースとＥＭＥＮ ２×（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｌａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州）を等量の４％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｌａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州）と混合して調製した。４日目にウイルスのプラークが明らかに見られた。０．３３％Ｘｇａｌ（Ｍｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）を含む別のアガロース層を培養物に添加して、ｐＥＦＬ−ｃｒ３をトランスフェクトしたＣＥＦを染色した。青いプラークを選択し、ウイルスプラークの１００％がＢガラクトシダーゼ発現に対して陽性になるまで３回精製した。次いで、ｌａｃＺ＋ウイルスのストックを、２５ｃｍ²フラスコ内の１０％トリプトースホスフェートブロス＋２％ＮＢＣＳ含有１９９培地中で増殖させたＣＥＦ中で増幅させた。選択した組換えＦＰＶをＦＰＣＲ３と命名した。
【００４９】
プラスミドｐＦＰ６７ｘｇｐｔｃｔｌのトランスフェクション用選択培地は、マイコフェノール酸（２５μｇ／ｍｌ）、キサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）、及びヒポキサンチン（１μｇ／ｍｌ）を含有していた。４日目にウイルスプラークが明らかに見られた。ｇｐｔ及びｃｒ３遺伝子は同じ相同領域に隣接しているので、選択培地中でウイルスプラークが分離したことは、組換えが起こり、両方の遺伝子がＦＰＶゲノムに挿入されたことを示している。プラークをＣＥＦ中で３回連続して精製した。選択した組換えウイルスをＦＰＳＣＲ３ＧＰＴと命名した。
【００５０】
実施例５．ＦＰＣＲ３のＰＣＲ分析
ＦＰＣＲ３組換え体がｃｒ３遺伝子を含んでいるかどうかを調べるためにＰＣＲ分析を行った。組換えＦＰＶをＣＥＦ中で６日間増殖させ、次いで、この細胞を収集してペレットにした。このペレットを懸濁させ、１．２５ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫを含む２００μｌの抽出緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノール）中５５℃で２時間インキュベートした。次いで、そのＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。それぞれｃｒ３遺伝子の５’側及び３’側の配列に相補的な下記プライマーを用いたＰＣＲにより各ウイルスのＤＮＡを試験した。使用したＰＣＲ条件は、９４℃で５分、その後９４℃１分、４５℃１分３０秒、及び７２℃１分３０秒を２５サイクル、最後の伸長が７２℃で１０分であった。これらのプライマーの配列は次の通りであった：
プライマー７７５、５’ ＴＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＧＴＡＧ ３’
プライマー７７６、５’ ＧＡＡＧＴＡＧＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＡＣ ３’
【００５１】
３種の別個のＣＲ３組換えウイルス（ＦＰＣＲ３．１；ＦＰＣＲ３．２；ＦＰＣＲ３．３）では、ＰＣＲ反応後に、予期した１．３ｋｂバンドが出現した。このバンドは親ウイルスＦＰＬ２９には存在しなかった（図３Ａ）。
【００５２】
実施例６．ＦＰＳＣＲ３ＧＰＴのＰＣＲ分析
ＦＰＳＣＲ３ＧＰＴ組換え体がｃｒ３遺伝子を含んでいるかどうかを調べるためにＰＣＲ分析を行った。組換えＦＰＶをＣＥＦ中で６日間増殖させ、次いで、この細胞を収集してペレットにした。このペレットを懸濁させ、１．２５ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫを含む２００μｌの抽出緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノール）中５５℃で２時間インキュベートした。次いで、そのＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。それぞれｃｒ３遺伝子の５’側及び３’側の配列に相補的な下記プライマーを用いたＰＣＲにより各ウイルスのＤＮＡを試験した。使用したＰＣＲ条件は、９４℃で５分、その後９４℃１分、４５℃１分３０秒、及び７２℃１分３０秒を２５サイクル、最後の伸長が７２℃で１０分であった。これらのプライマーの配列は次の通りであった：
プライマー２６６０、（２５７〜２７９）５’ ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧ ３’
プライマー２６６３、（１０２９〜１０５９）５’ ＣＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＧＣＴＴＧ ３’
【００５３】
３種の別個の組換えウイルス（ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔ．１；ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔ．２；ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔ．３）では、ＰＣＲ反応後に、予期した８００ｐｂバンドが出現した。このバンドは親ウイルスＦＰＬ２９には存在しなかった（図４Ａ）。
【００５４】
実施例７．ＦＰＣＲ３に感染したＣＥＦによるＣＲ３発現の評価
ＦＰＣＲ３によりＣＲ３が発現するかどうかを、ウェスタンブロットにより確認した。６０ｍｍのペトリ皿中のコンフルエントなＣＥＦを、組換えＦＰＶを用いて０．５ｐｆｕ／細胞で感染させた。２４時間後、この細胞を収集し、ペレットにし、１×ＳＤＳゲル添加緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）中に懸濁させた。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により１５％ゲル上でタンパク質を分画した。次いで、標準の手順に従って、それらをニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）上に写し取った（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）。写し取った後、このメンブレンを、ホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ：２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄）中の５％脱脂粉乳中に終夜封じ込めた。次いでそれを、１％粉乳を含有したＰＢＳ中に希釈した１０ｕｇ／ｍｌのモノクローナル抗体６．２と共に、室温で２時間インキュベートした。このモノクローナル抗体は、ＣＲ３で免疫したマウス中で産生させたものであった（Ｉｇｌｅｓｉａｓ Ｅ、Ｒｕｉｚ Ｍ、Ｃａｒｒａｚａｎａ Ｙ、Ｃｒｕｚ ＬＪ、Ａｇｕｉｌａｒ Ａ、Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｖ、Ｃａｒｐｉｏ Ｅ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｍ、Ｐｅｒｅｚ Ｍ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｃ、Ｃｒｕｚ Ｏ、Ｍａｒｔｉｎ Ａ、Ｄｕａｒｔｅ Ｃ、ＨＩＶ−１エピトープを含むキメラタンパク質（Chimeric proteins containing HIV-1 epitopes）、生化学ジャーナル、分子生物学と生物物理学（Journal Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics）、２００１、５：１０９〜２０）。次いで、このメンブレンを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）と複合化させたヒツジ抗マウス抗体（１：２０００）と共にインキュベートした。数回洗浄後、ＥＣＬウェスタンブロット検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を用いて製造者の指示に従い免疫ブロットを行った。５０〜６４ｋＤａの分子量を有する特異的バンドが、ＦＰＣＲ３に感染した培養物で検出された。親ＦＰ９ウイルスに感染したＣＥＦ中にはタンパク質は検出されなかった（図３Ｂ）。
【００５５】
実施例８．ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔに感染したＣＥＦによるＣＲ３発現の評価
ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔによりＣＲ３が発現するかどうかを、前記実施例に記載の操作に類似した操作に続いて、ウェスタンブロットにより確認した。５０〜６４ｋＤａの分子量を有する特異的バンドが、ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔに感染した培養物でも検出されたが、親ＦＰ９ウイルスに感染したＣＥＦ中にはタンパク質は検出されなかった（図４Ｂ）。
【００５６】
実施例９．ＦＰＣＲ３及びＦＰＳＣＲ３ｇｐｔの精製、及びマウスの免疫化
特定の無菌群の卵から得たＣＥＦで、多量の組換えＦＰＶストックを増殖させた。２５％（ｗ／ｖ）スクロース緩衝剤を用いてＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ロータ中２９０００ｒｐｍで２時間細胞質抽出物を遠心してＦＰＶを精製した。次いで、ＣＥＦ単層のプラークアッセイによりウイルス力価を測定した。図５から、培養物をスケールアップした後もＣＲ３発現が変わらなかったことがわかる。
【００５７】
（英国コンプトンの英国家畜衛生研究所（Institute for Animal Health）、又はキューバの国立実験動物生産センター（Centro Nacional de Produccion de Animales de Laboratorio）（ＣＥＮＰＡＬＡＢ）のＳＰＦ繁殖コロニーから得た）若年成体（５〜８週齢）のメスのＢａｌｂ／ｃマウスに、静脈内（ｉ．ｖ）、腹腔内（ｉ．ｐ）、又は皮下（ｓ．ｃ）経路で、２００μｌ無菌ＰＢＳ中２．５〜５×１０⁷ｐｆｕのＦＰＣＲ３、ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔ、又はネガティブコントロールウイルスの初回抗原刺激を与えた。２〜４週後、マウスに同一ルートで２００μｌ無菌ＰＢＳ中の同一ウイルス２．５〜９×１０⁷ｐｆｕの２回目の投与を行って、追加免疫した。
【００５８】
実施例１０．ＣＲ３に対するＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴＬ応答の検出
抗原特異的ＩＦＮ−γ放出細胞を検出する酵素結合イムノスポット（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを、既報の方法（Ｔａｎｇｕａｙ Ｓ及びＪＪ Ｋｉｌｌｉｏｎ、個々のサイトカイン分泌細胞を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡに基づくアッセイの直接比較（Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells）、１９９４、リンホカインサイトカイン研究（Lymphokine Cytokine Res）、１３：２５９〜２６３）に基づく方法を使用して実施した。端的に述べると、イモビロン−Ｐメンブレン９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス国）に、５μｇ／ｍｌネズミＩＦＮ−γ特異的モノクローナル抗体Ｒ４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を１００μｌ／ウェルで塗布して４℃で１晩置き、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３７℃で１時間ブロックした。次いで、試験細胞を添加した：これらは、ＦＰＣＲ３又はＦＰＳＣＲ３ｇｐｔのいずれかで初回抗原刺激し、追加免疫したマウス由来の（上述と同様に調製した）生体外脾細胞懸濁液であった。１ウェル当たり１０⁶、２×１０⁵、及び４×１０⁴の異なる個数の試験細胞を添加した。合成ペプチド１μＭと共にインキュベートしたＰ８１５細胞、或いはＣＲ３、Ｇａｇ、又はＮｅｆのＶＶ組換え体を５ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで感染させたＰ８１５細胞を添加して、細胞を刺激した。ペプチドのないＰ８１５細胞、又はコントロールのワクシニアウイルス（ｖＳＣ８又は野生型ワクシニア株ＷＲ）で感染させたＰ８１５細胞を含めて、ＩＦＮ−γ産生細胞のバックグラウンド数を明確にした。各ウェルの最終容量はＲ１０培地及びｈＩＬ−２で２００μｌであった。すべてのアッセイ変数を２回調べた。１晩（少なくとも１７時間）インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄し、次いでビオチン複合二次抗体ＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を０．５μｇ／ｍｌで添加し、室温で２時間反応させた。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＣＡ、米国）をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で１／１０００に希釈して室温で１時間添加した。ウェルを再度ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回、ＰＢＳで３回洗浄し、ＡＰ活性キット（Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｒａｄ、ＣＡ、米国）を用いてスポットを発生させた。１５分後、ウェルを水道水で洗浄し、乾燥させ、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、スイス国）下でスポットを数えた。或いは、幾つかのアッセイでは、本発明者等はＨＲＰＯで標識したストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を使用し、１／８００に希釈した；次いで、トリス−ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％過酸化水素中で、０．１％３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、米国）を用いてスポットを発生させた。結果は、１０⁶個の脾細胞又は分画細胞当たりのスポット形成細胞（ｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ−ｃｅｌｌｓ）（ＳＦＣ）数として表した。各グループのネガティブコントロール（ペプチドを含まないＰ８１５又はコントロールＶＶに感染させたＰ８１５）の２倍を超える値を陽性とみなした。
【００５９】
２つの別個のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を図６に示す。ネガティブなウイルスではなくＦＰＣＲ３で免疫したＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞のかなりの部分が、ＶＶＣＲ３、ＶＶｇａｇ、又はＶＶｎｅｆのいずれかで感染させたＰ８１５、或いはＶ３ ＭＮペプチド（ＬＫＫＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＥＲＹ）で初回抗原刺激したＰ８１５に対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴで陽性であった。
【００６０】
別の実験では、上述したようにＦＰＣＲ３又はＦＰＳＣＲ３ｇｐｔでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ｃｒ３を安定にトランスフェクトしたＰ８１５（Ｐ８１５ｃｒ３）を用いてＣＴＬが誘導されるかどうかを測定した。この実験の結果を図７に示す。両方の組換えＦＰＶが、かなりの割合のＣＲ３特異的ＩＦＢγ分泌細胞を誘導した。
【００６１】
実施例１１．ＡＩＤＳ患者由来のリンパ球によるＣＲ３エピトープのプロセシングと認識
ＨＩＶ感染患者由来の自己Ｂ細胞を、ＥＢＶで形質転換させ、ＣＲ３のＶＶ組換え体（ＶＶＣＲ３）で感染させた。これらの標的細胞を、ＨＩＶ患者由来の末梢血リンパ球と共にインキュベートし、ＩＦＮγ分泌脾細胞数をＥＬＩＳＰＯＴで計算した。この実験により、ポックスウイルスによって発現されるｃｒ３遺伝子が、ＨＩＶ感染患者由来のＣＴＬリンパ球に対するエピトープを効率良く提示できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＢａｍＨＩ ６Ｋｂ末端領域由来のＯＲＦ−１を挿入部位として用いた、鶏痘中での相同組換え用プラスミドｐＥＦＬ−ｃｒ３。遺伝子ｃｒ３はＶＶ ｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にあり、レポーター遺伝子ＬａｃＺはＦＰＶ ４ｂプロモーターの制御下にある。
【図２】 １１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ断片由来のＯＲＦ−６とＯＲＦ−７の間のＤＮＡ領域を挿入部位として用いた、ＦＰＶ中での相同組換え用プラスミドｐＦＰ６７ｘｇｐｔ。遺伝子ｃｒ３は合成プロモーターＥ／Ｌの制御下にあり、Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子はＶＶ７．５Ｋプロモーターの制御下にある。
【図３】 ３種の別個のｃｒ３組換えＦＰＶの（Ａ）ＰＣＲおよび（Ｂ）ウエスタンブロット：（１）ＦＰＣＲ３．１；（２）ＦＰＣＲ３．２；（３）ＦＰＣＲ３．３；（４）ＦＰＬ２９；（５）ＤＮＡ分子量マーカー。
【図４】 ３種の別個のｃｒ３組換えＦＰＶの（Ａ）ｃｒ３内部オリゴヌクレオチドのＰＣＲおよび（Ｂ）ウエスタンブロット：（１）ＦＰＳＣＲ３ＧＰＴ．１；（２）ＦＰＳＣＲ３ＧＰＴ．２；（３）ＦＰＳＣＲ３ＧＰＴ．３；（４）親ウイルス；（５）分子量マーカー。
【図５】 ウェスタンブロットで評価したＣＲ３の発現安定性。各レーンは、ウイルスストック由来のＦＰＳＣＲ３ＧＰＴで感染させたＦＰＶの３種の別個の試料（１、２、３）又はスクロース緩衝剤（ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｕｓｈｉｏｎ）により精製したＦＰＶの３種の別個の試料（４、５、６）である。レーン７は、親ウイルスで感染させたＣＲＦである。
【図６】 ＦＰＳＣＲ３ｇｐｔと、ペプチド３２を加えたＰ８１５細胞又はＣＲ３、Ｇａｇ、ＮｅｆのＶＶ組換え体で感染させたＰ８１５細胞とで免疫したマウスから採取した脾細胞を用いた、２通りの別個のＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果。結果を、１０⁶個の脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞数として表す。対応するネガティブコントロール（Ｐ８１５単体又はＶＶ ＷＲ感染体）の値を差し引いてある。
【図７】 ＦＰＣＲ３又はＦＰＳＣＲ３ｇｐｔとｃｒ３遺伝子を安定にトランスフェクトしたＰ８１５とを用いて免疫したマウスから採取した脾細胞を使用したＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ実験。結果を、１０⁶個の脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞数として表す。ネガティブコントロール（親Ｐ８１５）の値を差し引いてある。
【図８】 ＶＶＣＲ３感染自己Ｂ細胞の、ＡＩＤＳ患者由来Ｔリンパ球による認識。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴの結果を、１０⁶個の末梢血単核細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞数として表す。

Claims (20)

1. 内部に保存されたタンパク質とウイルスの生活環の初期に発現される調節タンパク質から選択される細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープリッチ領域、ＨＩＶ由来のＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ、及びモノクローナル抗体の標的となる少なくとも１種のＢ細胞エピトープをコードする断片を含む種々のＨＩＶ−１遺伝子由来の断片を含む、配列番号１の核酸配列又はその変異型によって特徴付けられるキメラｃｒ３遺伝子であって、キメラタンパク質は、ＨＩＶ−１タンパク質逆転写酵素と、Ｐ２４とＮｅｆ、ｇｐ１２０、ｇｐ４１及びｖｐｒ由来のＴｈエピトープと、ｇｐ１２０由来のＢ細胞エピトープの各断片を含み、
   以下の表に示す、逆転写酵素由来の３６〜１９２と、Ｐ２４由来の８７〜１７５と、Ｎｅｆ．由来の４３〜１５０と、ｇｐ１２０由来のＴ１及びＴ２、ｇｐ４１由来の５８０〜５９４、及びｖｐｒ由来の６６〜８０のＴｈ細胞エピトープの各断片と、Ｍａｂ ２Ｃ４によって認識されるＶ３領域ＭＮ株由来のＢ細胞エピトープとしてＬＫＫＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＥＲＹのアミノ酸配列を有するＶ３ ＭＮペプチドを含むキメラタンパク質をコードする、上記キメラｃｒ３遺伝子。
   

   

   

   
2. アミノ酸配列が配列番号２のタンパク質ＣＲ３の配列に相当する請求項１記載のキメラタンパク質。
3. 異種遺伝子が、請求項２記載の配列番号２のキメラタンパク質をコードする組換えウイルス。
4. 異種遺伝子のＤＮＡ配列が配列番号１のｃｒ３に相当する請求項３記載の組換えウイルス。
5. このウイルスがポックスウイルスである請求項４記載のウイルス。
6. このウイルスがアビポックスウイルスである請求項５記載のウイルス。
7. このウイルスが鶏痘ウイルスである請求項６記載のウイルス。
8. このウイルスがＦＰＣＲ３である請求項７記載のウイルス。
9. このウイルスがＦＰＳＣＲ３ｇｐｔである請求項８記載のウイルス。
10. 請求項４〜９のいずれか一項に記載の組換えウイルスと薬剤的に許容される賦形剤とを含むワクチン製剤。
11. ＡＩＤＳ患者又は非感染者のＨＩＶに対する免疫応答を誘導するための薬剤の製造のための、請求項４〜９のいずれか一項に記載の組換えウイルスの使用。
12. 請求項１０記載のワクチン製剤及び免疫増強物質で構成される予防又は治療用組合せ。
13. 免疫増強物質がサイトカインである請求項１２記載の予防又は治療用組合せ。
14. そのようなサイトカインがＩＬ２である請求項１３記載の予防又は治療用組合せ。
15. 哺乳動物細胞プロモーターの制御下にある請求項１記載のキメラ遺伝子を含むプラスミドベクター。
16. 請求項１５記載の組換えプラスミドベクターと薬剤的に許容される賦形剤とを含むワクチン製剤。
17. ＡＩＤＳ患者又は非感染者のＨＩＶの種々のタンパク質に対する免疫応答を誘導するための薬剤の製造のための、請求項１５記載のプラスミドベクターの使用。
18. 請求項１６記載のワクチン製剤及び免疫増強物質で構成される予防又は治療用組合せ。
19. 免疫増強物質がサイトカインである請求項１８記載の予防又は治療用組合せ。
20. そのようなサイトカインがＩＬ２である請求項１９記載の予防又は治療用組合せ。

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