CN112852749A - 高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株c68及利用生物反应器对其进行生产的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68，其保藏编号为：CGMCC No.21903；步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养或批次培养。本发明通过对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，筛选出一株能够高效分泌抗体的细胞株，并通过生物反应器进行放大培养，收获的半成品抗体含量高、质量稳定可控，减少了下游浓缩等耗时的步骤。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及利用生物反应器生产该抗体的方法。
背景技术
犬细小病毒病（CPVD）是由犬细小病毒引起的一种高度接触性传染病。该病可引起犬的急性肠炎及心肌炎，各年龄段犬均可感染，幼犬更易感染，且病死率高。该病不仅使犬主人经济受到损失同时还给心灵带来创伤，目前该病是养犬业重要的传染病之一。预防犬细小病毒病的方法主要是接种疫苗，对于患病犬的治疗方法主要是给发病早期的犬注射抗犬细小病毒血清或者注射抗犬细小病毒单克隆抗体，同时配合输液及注射犬的免疫球蛋白或者白蛋白等等，可有效降低该病的病死率。目前，治疗犬细小病毒病所用抗CPV免疫血清是由犬或者异源动物所制备，其质量不稳定，生产成本高，并且有携带外源病毒的风险，可引起严重的生物安全问题；而应用单克隆抗体治疗犬细小病毒病，不但能降低上述风险，并且治疗效果更佳，但现有的抗CPV单克隆抗体中和效价（抗病毒活性）低，半成品需要进行多倍浓缩后才能制成品，生产成本高、效率低。
发明内容
为了克服犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌抗体水平低、产品质量不稳定、生产效率低、生产成本高等问题，本发明提供了一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法。本发明通过对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，筛选出一株能够高效分泌抗体的细胞株，并通过生物反应器进行放大培养，收获的半成品抗体含量高、质量稳定可控，减少了下游浓缩等耗时的步骤。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68，其分类命名为杂交瘤细胞（hybridoma），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.21903，保藏日期为2021年2月25日。
一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，包括如下步骤：
步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；
步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68，其效价为1:2560；
步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养，培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70 rpm，溶氧为40%，pH为6.85，每日收获抗体2L，可连续收获100天以上，收获的抗体效价为1:2560；或者细胞株C68在生物反应器中进行批次培养，批次培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70 rpm，溶氧为40%，pH为6.85，在流加第6~7天可全部收获，收获的抗体效价为1:2560。
本发明中，所述连续培养和批次培养均包括细胞生长阶段（即：培养细胞增殖）和抗体分泌阶段两个阶段，具体培养要求如下：
连续培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始进行流加培养，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），开始收获细胞悬液，此时开启反应器的出液管道，将流速设置为每24小时收获2L，同时进行同流速补液，补液的成分为（基础培养基：流加培养基=3:1)；
批次培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），即可全部收获）。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
（1）本发明从建立的130株分泌CPV单克隆抗体杂交瘤细胞株中筛选到一株分泌抗体水平最高的细胞株，命名为C68，该细胞株分泌的抗体经血凝抑制检测，效价可达到1：2560。与现有技术相比，细胞株C68分泌抗体水平更高，减少了下游浓缩的繁杂工艺，提高了产品纯度和稳定性。
（2）本发明提供了一种对筛选到的细胞株C68在生物反应器中放大培养的方法，该方法在培养过程中不添加血清，避免了异源血清残留带来的负面影响，通过此方法生产的半成品成分明确、质量稳定。
本发明提供的在生物反应器中培养分为细胞生长和抗体分泌两个阶段，可在反应器中持续分泌抗体100天以上，抗体分泌时间长且分泌抗体水平高是本发明的显著优势。
（3）与现有技术相比，细胞株C68分泌抗体水平高，在生物反应器中持续分泌时间长，且培养基不含血清，成分安全，产品批间差小，是生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的有效方法。
保藏信息：
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；
保藏日期：2021年2月25日；
保藏编号：CGMCC No.21903。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，所述方法包括如下步骤：
1、阳性杂交瘤细胞的亚克隆：
（1）细胞复苏：取一只犬细小病毒杂交瘤细胞1D3株（北京世纪元亨）进行复苏，用含10%新生牛血清（山西润生大业生物材料有限公司）的DMEM培养基培养，37℃，培养48小时。
（2）将复苏的1D3细胞进行亚克隆：对培养48小时后的1D3细胞进行台盼蓝染色计数，通过有限稀释法将细胞稀释成6个/ml后铺96孔板，每孔100μL，置于37℃，含5% CO2的温箱培养2日后，记录下有单细胞生长的孔，待培养7~9日后，将有单细胞生长的孔中的细胞上清液取出，通过血凝抑制试验检测每株单细胞的抗体效价，经过10次的亚克隆筛选鉴定，最终筛选到产抗体水平最高的杂交瘤细胞命名为C68，对细胞株C68进行扩大培养并进行液氮冻存。
通过对细胞株C68进行流加培养，其抗体水平可在流加后第五天达到高峰，其抗体血凝抑制效价可达到1：2560。
对细胞株C68进行抗体分泌稳定性检测，经试验验证该细胞株在连续传代70次后，其抗体分泌仍稳定不降。
每升基础培养基中的成分为：HCl 10 mmol/L 1 ml、胰岛素10 mg、NaOH 0.25 g、NaHCO3 2g、DrinvingM SF2001 23.91 g（上海倍谙基生物科技有限公司）、H2O 1000 g；
每升基础流加培养基的成分为：HCl 10 mmol/L 5 ml、NaOH 0.4 g、NaHCO3 1.9 g、DrinvingM SF2001 123.18 g（上海倍谙基生物科技有限公司）、H2O 1000 g。
（下文中所涉及的基础培养基和流加培养基均与这两配方一致）。
2、细胞株C68在生物反应器中悬浮培养：
（1）种细胞制备：从液氮中取出细胞株C68，置于37℃水浴锅中迅速融化后接种至含无血清培养基的摇瓶中，置于含5% CO2的恒温摇床中，温度设定为37℃，摇床转数为130rpm，培养48小时后进行传代，传代密度为1.0*106个/ml，当种细胞扩大至2L，细胞密度为6.0*106个/ml时，接种至生物反应器。
（2）生物反应器的准备：将10L搅拌式生物反应器进行彻底清洗，校正温度和溶氧电极后，进行高压灭菌，灭菌结束后，向反应器中注入5L基础培养基进行无菌检验，培养参数设置为：温度为37℃，搅拌转速为70 rpm，溶氧为40%，pH为6.85，培养24小时以上，溶氧曲线始终水平且反应器内培养液澄清，说明反应器内为无菌环境，可接种种细胞。
（3）生物反应器的扩大培养阶段：将经摇瓶生产的2L种细胞接种至生物反应器中，补基础培养基至8L，培养参数设置为：温度为37℃，搅拌转速为70 rpm，溶氧为40%，pH为6.85。
（4）生物反应器内抗体分泌及收获阶段：
抗体收获有两种方案可供选择：一种是连续培养；另一种为批次培养。
（a）连续培养方案：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始进行流加培养，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），开始收获细胞悬液，此时开启反应器的出液管道，将流速设置为每24小时收获2L，同时进行同流速补液，补液的成分为（基础培养基：流加培养基=3:1)，对每日收获的细胞悬液进行抗体效价检测，经试验验证，连续收获100天，抗体水平仍未下降。
（b）批次培养方案：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），即可全部收获，检测结果见表1。
表1 C68细胞株分泌抗体的血凝抑制(HI)检测结果
Claims (5)
1.一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68，保藏编号为：CGMCCNo.21903。
2.一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；
步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68；
步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养或批次培养。
3.根据权利要求2所述的利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述步骤三中，连续培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85。
4.根据权利要求2所述的利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述步骤三中，批次培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85。
5.根据权利要求2所述的利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，其特征在于所述步骤三中，连续培养和批次培养均包括细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段，具体培养要求如下：
连续培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度为2.5*106个/ml时，开始进行流加培养，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时，开始收获细胞悬液，此时开启反应器的出液管道，将流速设置为每24小时收获2L，同时进行同流速补液；
批次培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时，即可全部收获。
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