CN105838664A - 一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)驯化携带有编码人血小板生成素基因序列的CHO细胞株适应化学限定培养基，筛选获得高表达重组人血小板生成素的单克隆细胞株，并建立原始细胞库、主细胞库和工作细胞库；(2)工程细胞的悬浮培养，包括种子复苏、细胞扩增、细胞接种以及悬浮流加培养，然后收获上清液；悬浮流加培养包括添加物的优化、流加补料的筛选以及流加方法的优化。本发明培养出的细胞密度高、容易放大、生产周期短、表达量高，收获生产重组人血小板生成素发酵液。

Description

一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法。
背景技术
CHO细胞系贴壁依赖性细胞，由于受细胞贴附面积的限制，极大的限制了细胞的产能。随着生物技术的发展，细胞悬浮培养技术的优势显现。细胞悬浮培养具有生长均一性，传质效率高，规模易放大，培养过程易控制等优点。哺乳动物细胞的悬浮培养已成为动物细胞表达重组蛋白、单克隆抗体等的工业化生产的首要选择。目前,在培养基应用方面,重组人血小板生成素生产细胞株主要在含有10％牛血清的培养基中进行扩増培养，细胞扩增到一定量后换为无血清培养基进行培养。其中血清的成份复杂，对下游产品纯化造成很大困难，而且血清中存在潜在的病毒，对人体可能带来危害。血清都是批量生产,各批量之间的差异，影响产品质量的一致性和生物学活性。化学限定培养基中各组分含量明确，质量稳定可控，提高生产工艺的可重复性和样品质量的稳定性，避免了潜在的病毒污染，在提高产品的表达水平的同时更有利于表达产物的纯化。
人血小板生成素(thromobopoietin，TPO)基因位于染色体3q26-q27上,人TPO cDNA含有1059个核苷酸的开放阅读框，一级翻译产物含有353个氨基酸，其中含有21个氨基酸信号肽，成熟人血小板生成素为332个氨基酸组成的单链多肽。
血小板生成素是一种糖蛋白，分子量为70-100kD。它是一种特异性的巨核细胞生长发育因子，可以刺激巨核细胞前体细胞的增值、分化，还可以促进巨核细胞的成熟，从而升高血小板数目。
专利ZL01126803.4公开了一种重组人血小板生成因子cDNA序列及其用途，该序列前N-39个氨基酸密码子根据密码子偏爱性进行了突变，从而有效提高重组人血小板生成因子的表达。该专利中重组CHO细胞为贴壁培养，培养基为15％胎牛血清+RPM1640/DMEM。
专利ZL00109612.5公开了一种重组人血小板生成素制剂的制备生产方法，该专利所采用的培养工艺为纤维载体片(Disc)贴壁灌流培养。细胞生长阶段采用含5％胎牛血清的培养基，蛋白表达阶段更换为无蛋白的合成培养基。
专利ZL201310491722.7公开了一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂，该专利中培养基采用无蛋白培养基，主要阐述了蛋白的纯化方法和制剂配方的筛选。
综上所述，目前仍需在培养方法的选择、培养工艺的摸索与建立等方面进行深入的研究，从而获得低成本、短周期、高密度、高活性的重组人血小板生成素。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其培养出的细胞密度高、容易放大、生产周期短、表达量高，收获生产重组人血小板生成素发酵液。
所采用的技术方案为：
一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，包括以下步骤：
(1)驯化携带有编码人血小板生成素基因序列的CHO细胞株适应化学限定培养基，筛选获得高表达重组人血小板生成素的单克隆细胞株，并建立原始细胞库、主细胞库和工作细胞库；
(2)工程细胞的悬浮培养，包括种子复苏、细胞扩增、细胞接种、悬浮流加培养，收获上清液；悬浮流加培养包括添加物的优化、流加补料的筛选以及流加方法的优化。
优选地，步骤(1)中，化学限定培养基是添加有4-8mmol/L的L-谷氨酰胺的CD OptiCHOTM Medium、CD CHO Medium、CD DG44Medium或CDM4CHO Medium。
优选地，步骤(2)中，添加物的优化为：
该添加物含有无水碳酸氢钠：2.0-4.0g/L、D-葡萄糖：1.5-4.0g/L、D-半乳糖：0.1-0.5g/L、D-甘露糖：0.2-0.6g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.1-0.5g/L和正丁酸钠：0.5-2.0mmol/L。
优选地，步骤(2)中，流加补料的筛选为：
选择流加补料为CHO CD EfficientFeedTM A和所述的添加物；或者选择流加补料为CHO CD EfficientFeedTM B和所述的添加物；或者选择流加补料为CHOCD EfficientFeedTM A和EfficientFeedTM B的混合物和所述的添加物。
优选地，步骤(2)中，流加方法的优化为：
在培养的第2天、第4天、第6天、第8天、第10天以及第12天分别添加体积比10％的流加补料；或者在第3天、第6天、第8天、第10天以及第12天分别添加体积比10％的流加补料。
优选地，步骤(2)中，悬浮流加培养的工艺条件为：
采用搅拌式生物反应器进行悬浮流加培养，pH：6.9-7.4、温度：35℃-37℃、溶氧20％-60％、渗透压280-500mOSM、葡萄糖浓度大于1.0g/L、乳酸小于5.0g/L、氨浓度小于10.0mmol/L。
优选地，步骤(2)中，流加方法在培养的第10天降低培养温度及降低pH，将温度控制在36℃-36.5℃，pH控制在6.8-7.0。
本发明的有益效果在于：
本培养方法使用化学限定培养基，培养基成分明确，质量稳定可控，能够提高细胞的表达效率和产品质量稳定性；使用悬浮培养方法，细胞密度远远高于贴壁培养，重组人血小板生成素表达量高，容易放大，降低了生产成本，极大的提高了重组人血小板生成素的产量。
附图说明
下面结合附图进一步阐述本发明。
图1为细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法的实验结果图，图中横坐标表示时间(天)，左边纵坐标为细胞密度，右边纵坐标为重组人血小板生成素表达量；图中曲线表示细胞密度随时间的变化，柱状表示重组人血小板生成素在第13天的表达量。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性的实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，包括以下步骤：
(1)驯化携带有编码人血小板生成素基因序列的CHO细胞株适应化学限定培养基，筛选获得高表达重组人血小板生成素的单克隆细胞株，并建立原始细胞库、主细胞库和工作细胞库；
具体的，1.1建立原始细胞库如下：
取一支重组人血小板生成素细胞株，37℃水浴，用DMEM培养基加10％胎牛血清传代两次，当细胞处在对数生长期时,用胰蛋白酶消化，使用含血清的DMEM培养基吹打，1000rmp，5分钟，离心去上清，加入CD OptiCHOTM Medium，制成细胞悬液。然后将细胞株以3×105cells/ml的细胞密度接种于125ml摇瓶中，培养基体积为40ml，120rpm，37℃、5％CO2摇床上培养；当细胞密度达到1.0-1.5×106cells/ml时，将细胞传代。每48-96h将细胞传代一次，传代5-6次时，以1.0×107cells/ml的细胞密度，每支1ml，冻存8支细胞，此为原始细胞库。
1.2建立主细胞库和工作细胞库如下：
从原始细胞库中取一支细胞复苏，接种于125ml摇瓶中，使用40ml CDOptiCHOTM Medium，120rpm，37℃、5％CO2在摇床上进行培养。恢复传代一次后，转入150ml CD OptiCHOTM Medium(500ml摇瓶)中培养。然后在转入400ml CDOptiCHOTM Medium(1000ml摇瓶)中培养。冻存40支，此为主细胞库。
从主细胞库中取一支细胞复苏，按上述方法进行培养，冻存细胞，即为工作细胞库。
上述中，CD OptiCHOTM Medium均是添加有4-8mmol/L的L-谷氨酰胺的化学限定培养基。
(2)工程细胞的悬浮培养，包括种子复苏、细胞扩增、细胞接种以及悬浮流加培养，然后收获上清液；悬浮流加培养包括添加物的优化、流加补料的筛选以及流加方法的优化。
具体的，2.1种子复苏、细胞扩增
从工作细胞库中取一支冻存的细胞复苏，接种于125ml摇瓶中，使用40mlCD OptiCHOTM Medium，120rpm，37℃、5％CO2在摇床上进行培养。当细胞密度达到1.0-1.5×106cells/ml时，将细胞转入两个150ml CD OptiCHOTM Medium(500ml摇瓶)中培养。当细胞密度达到1.5×106cells/ml时，将细胞转入两个400mlCD OptiCHOTM Medium(1000ml摇瓶)中培养。每天进行细胞密度和细胞活性的监测。当细胞总数达到1×109个时，转移到5L发酵罐(工作体积为3.5L)中继续进行种子细胞培养扩增。当5L发酵罐中细胞总数达到1×1010个时，即可做为20L发酵罐的种子细胞。
2.2细胞接种
将5L发酵罐与20L发酵罐的接种口相连，通过空气正压将种子液压入20L发酵罐中。
2.3悬浮流加培养
根据CHO细胞的生长特性，选择培养温度为37℃；pH选择与CO2和1mol/LNaOH偶联，pH设置为7.2；溶氧控制采用3-gas控制模式，设置溶氧为40％；搅拌转速为75rpm，发酵过程中渗透压维持在280-500mOSM的范围内，乳酸浓度小于5g/L，氨浓度小于10mmol/L，葡萄糖糖含量大于1g/L。
流加补料选择CHO CD EfficientFeedTM A和添加物。
该添加物含有无水碳酸氢钠：2.0-4.0g/L、D-葡萄糖：1.5-4.0g/L、D-半乳糖：0.1-0.5g/L、D-甘露糖：0.2-0.6g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.1-0.5g/L和正丁酸钠：0.5-2.0mmol/L。
其中碳酸氢钠与二氧化碳形成缓冲体系,调节、维持培养基的pH值,同时为细胞提供代谢功能必不可少的碳酸盐离子；TPO是一个糖蛋白，在蛋白的C末端有6个为N糖基化位点，糖基化修饰对蛋白的稳定性和体内生物学活性非常重要。D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖参与糖基化修饰反应。而适当浓度的正丁酸钠可以增加目的蛋白的表达。
流加方法为：
在培养的第2天，第4天，第6天，第8天，第10天，第12天分别添加体积比10％的流加补料(即CHO CD EfficientFeedTM A和添加物)。当细胞生长至平台期(培养第10天)，将培养温度调为36.5℃；pH设定为7.0。
2.4收获上清液
培养7-9天后，细胞密度可以达到1-3×107cells/ml，继续培养6-8天后收获上清液，重组人血小板生成素表达量达到126mg/L,而贴壁培养表达量约为40mg/L，实验结果可参见图1所示。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)驯化携带有编码人血小板生成素基因序列的CHO细胞株适应化学限定培养基，筛选获得高表达重组人血小板生成素的单克隆细胞株，并建立原始细胞库、主细胞库和工作细胞库；
(2)工程细胞的悬浮培养，包括种子复苏、细胞扩增、细胞接种以及悬浮流加培养，然后收获上清液；悬浮流加培养包括添加物的优化、流加补料的筛选以及流加方法的优化。
2.根据权利要求1所述的细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，步骤(1)中，化学限定培养基是添加有4-8mmol/L的L-谷氨酰胺的CD OptiCHOTM Medium、CD CHO Medium、CD DG44Medium或CDM4CHO Medium。
3.根据权利要求2所述的细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，步骤(2)中，添加物的优化为：
该添加物含有无水碳酸氢钠：2.0-4.0g/L、D-葡萄糖：1.5-4.0g/L、D-半乳糖：0.1-0.5g/L、D-甘露糖：0.2-0.6g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.1-0.5g/L和正丁酸钠：0.5-2.0mmol/L。
4.根据权利要求3所述的细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，步骤(2)中，流加补料的筛选为：
选择流加补料为CHO CD EfficientFeedTM A和所述的添加物；或者选择流加补料为CHO CD EfficientFeedTM B和所述的添加物；或者选择流加补料为CHOCD EfficientFeedTM A和EfficientFeedTM B的混合物和所述的添加物。
5.根据权利要求4所述的细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，步骤(2)中，流加方法的优化为：
在培养的第2天、第4天、第6天、第8天、第10天以及第12天分别添加体积比10％的流加补料；或者在第3天、第6天、第8天、第10天以及第12天分别添加体积比10％的流加补料。
6.根据权利要求5所述的细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，步骤(2)中，悬浮流加培养的工艺条件为：
采用搅拌式生物反应器进行悬浮流加培养，pH：6.9-7.4、温度：35℃-37℃、溶氧20％-60％、渗透压280-500mOSM、葡萄糖浓度大于1.0g/L、乳酸小于5.0g/L、氨浓度小于10.0mmol/L。
7.根据权利要求6所述的细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法，其特征在于，步骤(2)中，流加方法在培养的第10天降低培养温度及降低pH，将温度控制在36℃-36.5℃，pH控制在6.8-7.0。
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