CN111019907A - 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺 - Google Patents

一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN111019907A
CN111019907A CN202010164541.3A CN202010164541A CN111019907A CN 111019907 A CN111019907 A CN 111019907A CN 202010164541 A CN202010164541 A CN 202010164541A CN 111019907 A CN111019907 A CN 111019907A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
culture medium
culture
cell
cho
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010164541.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111019907B (zh
Inventor
甘富
韩明娣
桑建彬
杨宋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Four Rings Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Beijing Four Rings Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Four Rings Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Beijing Four Rings Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202010164541.3A priority Critical patent/CN111019907B/zh
Publication of CN111019907A publication Critical patent/CN111019907A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111019907B publication Critical patent/CN111019907B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明提供了一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺，所述细胞株为CHO细胞，所述CHO细胞内包括至少一个表达载体，所述表达载体使所述CHO细胞能够在适宜的培养条件下表达重组人促红素，通过对CHO细胞的驯化，提高单位培养液中的细胞浓度，从而提高EPO的产量。所述生产工艺包括步骤细胞株复苏、反应器培养、蛋白纯化等步骤，通过对培养及纯化工艺的优化，改善了细胞在悬浮培养环境下的生长状态，提高了EPO的表达量及EPO的纯化收率。

Description

一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体的，涉及一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺。
背景技术
促红细胞生成素（促红素，Erythropoietin，EPO）最早于1906年被发现，是一种主要由肾脏产生的糖蛋白，分子量约为35KD，是人体内调节红系造血的主要激素，在红系祖细胞的增殖、分化和成熟中起着重要的调控作用。
在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿液和绵羊血液中提取，理化和生物性质难以测定，得率低且不稳定，使其无法大规模应用。随着技术的发展，目前已经可以应用DNA重组技术将EPO的基因构建到中国仓鼠卵巢细胞中（CHO细胞），形成可以表达重组人促红细胞生成素（rhEPO）基因的CHO细胞。然而在现有技术中，CHO细胞表达rhEPO的效率并不高，造成了EPO的整体产率低，成本高，影响了其在临床上的推广。而其中一个影响rhEPO表达的原因在于，CHO细胞大多采用贴壁培养，造成单位体积内CHO细胞量较少。
因此，本领域亟需一种能够高效表达重组人促红素的细胞株及重组人促红素的生产工艺，以解决上述至少一项技术问题。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺，以解决现有技术中的至少一项技术问题。
具体的，本发明的第一方面，提供了一种高效表达重组人促红素的细胞株，所述细胞株为CHO细胞，所述CHO细胞内包括至少一个表达载体，所述表达载体使所述CHO细胞能够在适宜的培养条件下表达重组人促红素。
采用上述技术方案，将适宜的表达载体转染至CHO细胞内，从而实现CHO细胞对EPO的高效表达。
优选地，所述表达载体包括序列SEQ ID NO.1。
优选地，所述细胞株构建方法包括步骤：
细胞驯化，将CHO细胞驯化筛选，获得能够在合适培养基中以悬浮状态生长的CHO细胞株；
表达载体构建，将EPO编码序列接入到空载体上；
载体转染，将构建的表达载体转染进入到CHO细胞内。
采用上述技术方案，通过对CHO细胞的驯化，提高其在悬浮状态下的生长能力，能够在生产中提高单位培养液中的细胞浓度，从而提高EPO的产量。申请人需要补充的是，在上述技术方案中，对CHO细胞的驯化可以在表达载体转染之前，也可以在表达载体转染之后进行，均可以实现CHO细胞对EPO的高效表达。
优选地，所述细胞驯化包括步骤：
第一轮驯化，使细胞在贴壁状态下培养，并将第一驯化培养基中的血清含量降低至0.8-1.2%，所述第一驯化培养基为能够使CHO细胞在贴壁状态下生长的CHO基础培养基；
第二轮驯化，将细胞接种至含有0.8-1.2%血清的第二驯化培养基中，并悬浮培养，并将第二驯化培养基中的血清含量降低至0.1-0.15%，其中，所述第二驯化培养基中含有2-6mM的L-谷氨酰胺，所述第二驯化培养基为能够使CHO细胞在悬浮状态下生长的CHO基础培养基；
第三轮驯化，通过用无血清培养基替换原培养基的方法，完全去除培养基中的血清。
采用上述技术方案，可以提高CHO细胞的驯化效率，并使驯化后的CHO细胞能够更稳定的在培养基中悬浮培养。
优选地，所述第一轮驯化包括步骤：
细胞培养，将细胞在含有8-12%血清的第一驯化培养基中进行培养；
降血清贴壁培养，收集细胞，并将第一驯化培养基血清浓度降低到0.8-1.2%。
优选地，所述降血清贴壁培养包括步骤：
第一轮降血清贴壁培养，当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含4-6%血清的第一驯化培养基中进行培养；
第二轮降血清贴壁培养，当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含0.8-1.2%血清的第一驯化培养基中进行培养。
采用上述方案，通过逐步降低培养基中的血清浓度，可以提高细胞对低血清培养基的耐受性，提高驯化成功率。
优选地，所述第一轮驯化中的培养条件为37℃，5%CO2静置培养。
优选地，所述第一轮降血清贴壁培养中，当细胞汇合度到70-80%时，胰酶消化后，用完全培养基终止反应并吹打混匀，获得细胞悬液，并按1:4的比例接种。
优选地，所述第二轮降血清贴壁培养中，当细胞汇合度到70-80%时，胰酶消化后，用完全培养基终止反应并吹打混匀，获得细胞悬液，并按1:4的比例接种。
优选地，所述第一驯化培养基可以为Ham’s F-12K培养基。
优选地，所述第二轮驯化包括步骤：
细胞培养，将待驯化细胞在含有0.8-1.2%血清的第一驯化培养基中培养；
脱壁处理，当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化，离心收集从壁上脱落的细胞；
悬浮培养，将细胞接种到含有0.8-1.2%血清的第二驯化培养基中，进行悬浮培养；
降血清悬浮培养，将第二驯化培养基血清浓度降低到0.1-0.15%。
采用上述技术方案，使待驯化细胞在贴壁培养后，进入到与贴壁培养相似的条件中进行悬浮培养，能够提高待驯化细胞在悬浮培养时的适应能力。
优选地，所述脱壁处理步骤中，用胰酶消化20-50秒，加入含10-20%血清的培养基终止消化。
优选地，所述悬浮培养步骤中，培养条件为36-38℃，7-8%CO2，100-150r/min。
优选地，所述悬浮培养步骤中，培养体积为25-40ml，细胞接种后密度为1-8×105个/ml，并按体积比0.25-1%加入抗结团剂（Anti-clumping Agent，ACA）。更优选地，所述悬浮培养步骤中，培养基中包括2-5mM的L-谷氨酰胺。更优选地，所述ACA可以选自硫酸葡聚糖、胰酶、肝素钠中的一种或几种。
优选地，所述细胞接种后密度为2.5-3×105个/ml。
优选地，所述第二驯化培养基可以为CD CHO培养基。
优选地，所述第二轮驯化还包括步骤：
细胞预处理，将脱壁处理步骤中离心收集的细胞，根据悬浮培养步骤中的需要量，用1-10ml含有0.2-2%甘油的第三驯化培养基进行吹打处理，使所述细胞悬浮于第三驯化培养基中，静置1-5min，再次混匀，并将相应量的第三驯化培养基加入至摇瓶中，补足相应的培养基，进行培养。
采用上述技术方案，经过细胞预处理步骤的处理，可以使细胞在进入摇瓶培养后，更容易适应悬浮生长，提高细胞驯化的成功率。
优选地，所述第三驯化培养基为含有0.2-2%甘油的CD CHO培养基。
优选地，所述降血清悬浮培养包括步骤：
完全培养基扩增，待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；
低血清培养基扩增，收集细胞，加入至更低血清浓度的培养基内。
采用上述技术方案，采用完全培养基进行扩增，能够有效增加细胞在进入低血清培养基是的耐受性。
优选地，所述完全培养基扩增步骤中，所述完全培养基预热至30-33℃。
优选地，所述低血清培养基扩增中，更低血清浓度为上一血清浓度的一半，如更低血清浓度未达到0.1-0.15%，则重复操作完全培养基扩增、低血清培养基扩增步骤。
优选地，所述第三轮驯化包括步骤：
制备第一条件培养基，经过第二轮驯化，待所述细胞在含0.1-0.15%血清、0.25-1%的ACA的第二驯化培养基中培养至少1代后，收集上清液，将上清液经过滤，获得第一条件培养基；过滤时，过滤孔径优选0.2-0.4μm；
制备第一混合培养基，将所述第一条件培养基与第二驯化培养基等体积混合，获得第一混合培养基；
第一轮接种培养，将细胞接种到第一混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.25-1%的ACA，于36-38℃、7-8%CO2、100-150r/min的培养条件下培养；
收集菌种，将细胞冻存备用。
优选地，所述制备第一条件培养基步骤中，所述第二驯化培养基中还包括2-5mM的L-谷氨酰胺。
优选地，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.4-0.45mg/L。
申请人意外发现，在第一混合培养基中加入适量D-生物素，能够显著提高细胞在无血清培养基中的耐受性及活力。
优选地，所述第三轮驯化还包括步骤：
制备第二条件培养基，待第一轮接种培养的细胞浓度达到1.5-1.8×106个/ml时，收集上清液，将上清液经过滤，获得第二条件培养基；过滤时，过滤孔径优选0.2-0.4μm；
制备第二混合培养基，将所述第二条件培养基与第二驯化培养基等体积混合，获得第二混合培养基；
第二轮接种培养，将细胞接种到第二混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.25-1%的ACA，于36-38℃、7-8%CO2、100-150r/min的培养条件下培养。
优选地，所述第二混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.4-0.45mg/L。
优选地，所述血清为胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）。
优选地，所述表达载体构建的步骤包括：
载体酶切，酶切表达载体及克隆载体，所述克隆载体酶切后获得目的片段，所述目的片段包括序列SEQ ID NO.1；
目的基因接入，将目的片段接入到酶切后的表达载体上。
优选地，所述表达载体可以为pQkX2、pSV2、pEGFP-N1、pCMVp-NEO-BAN中的一种。
优选地，所述细胞转染的步骤包括：
优选地，所述质粒转染的步骤包括：
重组质粒的线性化，对重组质粒进行酶切，获得线性化重组质粒；
质粒导入，将上述线性化重组质粒导入宿主细胞。
优选地，所述对重组质粒进行酶切可以选用Pvu I酶。
优选地，所述质粒导入采用电转仪进行。
本发明的第二方面，提供了一种重组人促红素的生产工艺，包括步骤：
细胞活化，将能够表达重组人促红素的CHO细胞株复苏；
反应器培养，将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至培养基中进行培养，控制温度在36-38℃，pH在6.8-7.2，溶解氧含量40-60%；
蛋白纯化，对培养液中的EPO进行纯化。
采用上述技术方案，通过对本发明构建的细胞株进行培养，并对其发酵产物进行纯化，从而获得重组人促红素产品。
优选地，所述能够表达重组人促红素的CHO细胞株为如本发明第一方面所述的CHO细胞。
优选地，所述反应器培养步骤中，培养基为OPM-CHO CD07培养基（简称CD07培养基）。
优选地，所述OPM-CHO CD07培养基中含有体积比0.25-1%的ACA。
优选地，所述反应器培养步骤中，当培养基中细胞密度达到4-6×106个/ml后，每隔24h进行1.5-2.5%的OPM-CHO CDF18（简称CDF18）补料。
优选地，所述反应器培养步骤中，当培养基中细胞密度达到8-12×106个/ml后，每隔48h进行0.3-0.5%的OPM-CHO CDF28（简称CDF28）补料。
采用上述技术方案，通过对补料成分及补料时机的控制，可以有效提高EPO的表达量。
优选地，所述反应器培养步骤中，当培养基中细胞密度达到6-8×106个/ml后，将反应器温度降低至32.5-34℃。
采用上述技术方案，通过对反应器合理的控制温度，可以有效提高EPO的表达量。
优选地，所述蛋白纯化包括步骤：
收集上清，采用离心或过滤的方式分离细胞，收集上清液；
亲和层析，采用亲和层析柱对上清液进行上样洗脱；
疏水层析，将亲和层析洗脱液经过疏水层析柱进行洗脱；
阴离子交换层析，将上一步获得的洗脱液经过阴离子交换层析柱进行洗脱。
优选地，所述亲和层析柱选用Blue Sepharose 6 FF（GE） 1.6×2.5cm 5ml。
优选地，所述疏水层析柱选用HiTrap Butyl S FF（GE） 1ml。
优选地，所述疏水层析步骤中，包括步骤：
样品预处理，将亲和洗脱液用4M硫酸铵调节，获得含1.5M硫酸铵的亲和洗脱液，进行疏水层析。
优选地，所述阴离子交换层析柱选用DEAE FF（GE）0.7×2.5cm 1ml。
优选地，所述蛋白纯化还包括步骤：
超滤换液，将亲和层析后的洗脱液，用10KD超滤管进行超滤，并将样品换液至pH7.0的20mM Tris-HCl中，用于阴离子交换层析。
采用上述技术方案，通过在超滤换液过程中，对样品的溶剂进行更换，能够有效提高阴离子交换层析后EPO的收率。
本发明中，所述CD CHO培养基可以选用Gibco公司的CD CHO Medium (目录号：10743-029)；所述Ham’s F-12K培养基可以选用Gibco公司的Ham’s F-12K Medium（目录号：21127-022)。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1. 本发明提供的表达重组人促红素的细胞株，通过对CHO细胞的驯化，提高其在悬浮状态下的生长能力，能够在生产中提高单位培养液中的细胞浓度，从而提高EPO的产量；
2. 本发明提供的表达重组人促红素的细胞株，通过对CHO细胞驯化步骤或驯化方法的优化，增加了细胞对悬浮培养环境的耐受程度，提高了驯化效率；
3. 本发明提供的表达重组人促红素的细胞株，通过对CHO细胞驯化步骤或驯化方法的优化，增加了细胞对悬浮培养环境的耐受程度，增加了细胞在悬浮培养环境下的生长速度和细胞密度；
4.本发明提供的重组人促红素的生产工艺，通过对培养工艺的优化，改善了细胞在悬浮培养环境下的生长状态，提高了EPO的表达量；
5. 本发明提供的重组人促红素的生产工艺，通过对纯化工艺的优化，降低了纯化过程中EPO的损失，从而提高了EPO的纯化收率。
附图说明
图1为实验例1的细胞活率数据；
图2为实验例2的细胞活率数据；
图3为实验例3的细胞活率及EPO活性数据；
图4为实验例4中目的蛋白表达的方案设计；
图5为实验例4中各方案的活细胞密度（VCD）数据；
图6为实验例4中各方案的EPO表达量数据；
图7为实施例14中细胞培养后的EPO活性；
图8为实施例15中蛋白纯化后EPO的纯度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实验例1
样品制备：
从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到方瓶中进行培养，培养基选用含10%FBS的F-12K培养基，并以此培养基中稳定生长的细胞作为本实验例中的样品细胞。
方案1-1
S1：将样品细胞在含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；
S2：当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞；将细胞接种到含有5%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；
S3：待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；收集细胞，将细胞接种到含有2.5%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min。
方案1-2：
S1：将样品细胞在含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有2.5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；
S2：与方案1-1的S2基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有2.5%FBS；
S3：与方案1-1的S3基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有1.25%FBS。
方案1-3：
S1：将样品细胞在含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有1.2%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；
S2：与方案1-1的S2基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有1.2%FBS；
S3：与方案1-1的S3基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有0.6%FBS。
方案1-4：
S1：将样品细胞在含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有0.8%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；
S2：与方案1-1的S2基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有0.8%FBS；
S3：与方案1-1的S3基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有0.4%FBS。
方案1-5：
S1：将样品细胞在含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有0.5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；
S2：与方案1-1的S2基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有0.5%FBS；
S3：与方案1-1的S3基本相同，不同之处在于F-12K培养基、CD CHO培养基中的含有0.25%FBS。
分别对上述方案中，细胞在S2步骤中，在CD CHO培养基中进行悬浮培养24h后的细胞活率（培养后细胞数/接种后细胞数，VIA-1）进行检测；并对细胞在S3步骤中，在更低血清浓度的CD CHO培养基进行悬浮培养24h后的细胞活率（培养后细胞数/接种后细胞数，VIA-2）进行检测；上述培养方案平行做3次，分别对每次试验进行结果检测，检测结果如图1所示。
根据图1的数据可知，在试验中，申请人意外发现，在S1步骤，也即第一轮驯化时，将血清浓度控制的过高（如方案1-1、方案1-2），虽然在接种至摇瓶进行悬浮培养时，细胞活率依然很高，但是在摇瓶中进行降血清培养后，细胞活率显著降低，意味着细胞驯化程度不理想，不适合作为第一轮驯化的血清浓度，也就是说，申请人发现，第一轮驯化时的血清浓度控制可能会影响到悬浮培养的细胞活率；而将血清浓度控制的过低（如方案1-5），则在细胞接种至摇瓶进行悬浮培养后，立即出现了不适应的状态，细胞活率显著降低，同样不太适合作为第一轮驯化的血清浓度；而方案1-3、方案1-4，血清浓度控制在0.8%-1.2%，既能保证细胞初始接种至摇瓶进行悬浮培养时的细胞活率，也能保证在摇瓶中进行降血清培养后的细胞活率，适宜作为第一轮驯化的血清浓度。
实验例2
样品制备：
从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有1%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；并以此培养基中稳定生长的细胞作为本实验例中的样品细胞。
方案2-1
S1：将待驯化细胞在含有1%FBS的F-12K培养基中方瓶培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞；
S3：将细胞接种到含有1%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为7.5-8×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；
S4：待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；收集细胞，将细胞接种到含有0.5%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min。
方案2-2
S1：与方案2-1的S1步骤相同；
S3：与方案2-1的S3步骤基本相同，不同之处在于，细胞接种后的密度为1-1.5×105个/ml；
S4：与方案2-1的S4步骤相同。
方案2-3
S1：与方案2-1的S1步骤相同；
S3：与方案2-1的S3步骤基本相同，不同之处在于，细胞接种后的密度为2.5-3×105个/ml；
S4：与方案2-1的S4步骤相同。
方案2-4
S1：与方案2-1的S1步骤相同；
S2：将S1中收集到的细胞，用8ml含有1%甘油（体积分数，下同）的CD CHO培养基进行吹打处理，使所述细胞悬浮于培养基中，静置3min，再次混匀，用于下一步的接种；
S3：与方案2-1的S3步骤相同；
S4：与方案2-1的S4步骤相同。
方案2-5
S1：与方案2-2的S1步骤相同；
S2：与方案2-4的S2步骤相同；
S3：与方案2-2的S3步骤相同；
S4：与方案2-2的S4步骤相同。
方案2-6
S1：与方案2-3的S1步骤相同；
S2：与方案2-4的S2步骤相同；
S3：与方案2-3的S3步骤相同；
S4：与方案2-3的S4步骤相同。
方案2-7
S1：与方案2-6的S1步骤相同；
S2：与方案2-6的S2步骤基本相同，不同之处在于，所述培养基内不添加甘油；
S3：与方案2-6的S3步骤相同；
S4：与方案2-6的S4步骤相同。
方案2-8
S1：与方案2-6的S1步骤相同；
S2：与方案2-6的S2步骤基本相同，不同之处在于，所述培养基内添加0.2%甘油；
S3：与方案2-6的S3步骤相同；
S4：与方案2-6的S4步骤相同。
方案2-9
S1：与方案2-6的S1步骤相同；
S2：与方案2-6的S2步骤基本相同，不同之处在于，所述培养基内添加2%甘油；
S3：与方案2-6的S3步骤相同；
S4：与方案2-6的S4步骤相同。
方案2-10
S1：与方案2-6的S1步骤相同；
S2：与方案2-6的S2步骤基本相同，不同之处在于，所述培养基内添加1%的生理盐水；
S3：与方案2-6的S3步骤相同；
S4：与方案2-6的S4步骤相同。
分别对上述方案中，细胞在S3步骤中，在CD CHO培养基中进行悬浮培养24h后的细胞活率（培养后细胞数/接种后细胞数，VIA-1）进行检测；并对细胞在S4步骤中，在更低血清浓度（0.5%FBS）的CD CHO培养基进行悬浮培养24h后的细胞活率（培养后细胞数/接种后细胞数，VIA-2）进行检测；上述培养方案平行做3次，分别对每次试验进行结果检测，检测结果如图2所示。
根据图2的数据，申请人发现，在方案2-1~方案2-5中，无论是VIA-1还是VIA-2，其结果均没有显著的区别（p＞0.05）；但是在方案2-6中，其VIA-2的数据明显高于方案2-1~方案2-5，也即，在增加S2步骤后，同时满足S3步骤中接种密度达到2.5-3×105个/ml，可以显著增加细胞在悬浮培养中，降血清后的耐受性或驯化成功率；同时，根据方案2-7~方案2-9的数据可知，当S2步骤中不再添加甘油后，有益效果消失（如方案2-7、方案2-10），甘油浓度在0.2-2.0%之间，均可以有效提高细胞在悬浮培养中，降血清后的耐受性或驯化成功率。
实验例3
本实验例对第三轮驯化中的方法或步骤进行试验。
样品制备：
D1：从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有1%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞；将细胞接种到含有1%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；
D2：待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；收集细胞，将细胞接种到含有0.5%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；
D3：重复步骤D2，并将细胞接种到含有0.25%FBS的CD CHO培养基中；
D4：重复步骤D3，并将细胞接种到含有0.125%FBS的CD CHO培养基中，并以此培养基中稳定生长的细胞作为本实验例中的样品细胞。
方案3-1
S1：待样品中所述细胞在含0.125%FBS、0.5%的ACA的CD CHO培养基中培养至少1代后，收集上清液，将上清液经0.22μm过滤，获得第一条件培养基；
S2：将所述第一条件培养基与CD CHO培养基等体积混合，获得第一混合培养基；
S3：将细胞接种到第一混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.5%的ACA，4mM的L-谷氨酰胺，于37℃、7.5%CO2、130r/min的培养条件下培养。
方案3-2
S1：与方案3-1的S1步骤相同；
S2：与方案3-1的S2步骤基本相同，区别在于，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.4mg/L；
S3：与方案3-1的S3步骤相同。
方案3-3
S1：与方案3-1的S1步骤相同；
S2：与方案3-1的S2步骤基本相同，区别在于，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.45mg/L；
S3：与方案3-1的S3步骤相同。
方案3-4
S1：与方案3-1的S1步骤相同；
S2：与方案3-1的S2步骤基本相同，区别在于，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.45mg/L；
S3：与方案3-1的S3步骤相同；
S4：待步骤S3中培养的细胞浓度达到1.5-1.8×106个/ml时，收集上清液，将上清液经0.22μm过滤，获得第二条件培养基；将所述第一条件培养基与CD CHO培养基等体积混合，获得第一混合培养基；将细胞以4-8×105个/ml、20-40ml的量接种到第二混合培养基中，按体积比加入0.5%的ACA，4mM的L-谷氨酰胺，于37℃、7.5%CO2、130r/min的培养条件下培养。
方案3-5
S1：与方案3-4的S1步骤相同；
S2：与方案3-4的S2步骤相同；
S3：与方案3-4的S3步骤相同；
S4：与方案3-4的S4步骤基本相同，区别在于，待步骤S3中培养的细胞浓度达到0.5-1×106个/ml时，收集上清液。
方案3-6
S1：与方案3-4的S1步骤相同；
S2：与方案3-4的S2步骤相同；
S3：与方案3-4的S3步骤相同；
S4：与方案3-4的S4步骤基本相同，区别在于，待步骤S3中培养的细胞浓度达到2-2.5×106个/ml时，收集上清液。
分别对上述方案中，细胞在S3步骤中，在第一混合培养基培养基中进行悬浮培养24h后的细胞活率（培养后细胞数/接种后细胞数，VIA）进行检测；
分别对上述方案获得的细胞进行冻存，细胞复苏后接种到CD CHO培养基中进行培养，按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养体积60ml，接种后细胞密度0.6×106个/ml，培养温度37℃，130r/min，培养12天收集上清液，并检测EPO活性。
上述培养方案平行做3次，分别对每次试验进行结果检测，检测结果如图3所示。
根据图3的数据，申请人发现，方案3-2~方案3-6的VIA显著高于方案3-1，证明在第一混合培养基中补入D-生物素，可以显著提高细胞在第一混合培养基（也就是无血清培养基）中的生长状态和耐受性；此外，对于方案3-4，在加入步骤S4后，细胞的EPO活性明显高于方案1~方案3（p＜0.01），而对于方案3-5及方案3-6，细胞的EPO活性明显低于方案4，且与方案2及方案3的EPO活性差异不明显（p＞0.05）；因此可以认为，在第三轮驯化中，加入步骤4后，同时需要控制细胞浓度在1.5-1.8×106个/ml时进行收集细胞，才能对收获后细胞的EPO表达量有积极的影响。
实验例4
样品制备：
选用实验例3中，方案3-4中获得的细胞株，进行冻存后，用于本实验例的操作。
D1：复苏上述CHO细胞，置于摇床中，37℃，8%CO2，120rpm培养；待活细胞密度（VCD）达到2-5×106个/ml是，按0.2-0.4×106个/ml密度进行传代；调整活细胞密度至0.5×106个/ml，培养24h后用于转染；
D2：制备含有序列SEQ ID NO.1的克隆载体，并添加相应的酶切位点；准备表达载体pQKX2；以限制性内切酶SapI及EcoRI对克隆载体及表达载体同时进行酶切；克隆载体酶切后产生目的序列，所述目的序列包含序列SEQ ID NO.1；将目的序列接入到酶切后的表达载体上，获得重组表达质粒；
D3：用PvuI酶切重组表达质粒，得到线性化重组质粒，用Bio-Rad电转仪将所述线性化重组质粒转染至D1中的CHO细胞中，获得能够表达重组EPO的CHO细胞，并以此细胞作为样品进行下述实验。
按图4的内容进行方案设计。
根据图4的方案进行试验后，试验数据如图5-6所示。根据图5的结果，在方案1工艺优化策略下，反应器中的细胞密度最高，生长状态优于其他方案。根据图6的结果，在方案1工艺优化策略下，培养13天后细胞的EPO表达量最高。根据实验结果证明，在对上述CHO细胞进行培养时，其温度控制，补料成分，补料策略，均会对细胞生长或EPO的表达产生影响。其中，CD 07培养基、CDF 18、CDF 28，均采购自上海奥浦迈生物科技有限公司。
实施例1
S1：从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化20秒，加入含10%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有0.8%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化20秒，加入含10%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞；
S2：将细胞接种到含有0.8%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为25ml，细胞接种后密度为1-2×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入2mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.25%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7%CO2，100r/min；
S3：待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；收集细胞，将细胞接种到含有0.4%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为25ml，细胞接种后密度为1-2×105个/ml，进行悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7%CO2，100r/min；；
S4：重复步骤S3，直至细胞接种到含有0.1%FBS的CD CHO培养基中；
S5：待样品中所述细胞在含0.1%FBS的CD CHO培养基中培养至少1代后，收集上清液，将上清液经0.22μm过滤，获得第一条件培养基；将所述第一条件培养基与CD CHO培养基等体积混合，获得第一混合培养基；将细胞接种到第一混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.25%的ACA，2mM的L-谷氨酰胺，于37℃、7 %CO2、100r/min的培养条件下培养。
S6：复苏S5中的CHO细胞，置于摇床中，37℃，7%CO2，100rpm培养；待活细胞密度达到2-5×106个/ml是，按0.2-0.4×106个/ml密度进行传代；调整活细胞密度至0.4×106个/ml，培养24h后用于转染；
S7：制备含有序列SEQ ID NO.1的克隆载体，并添加相应的酶切位点；准备表达载体pQKX2；以限制性内切酶SapI及EcoRI对克隆载体及表达载体同时进行酶切；克隆载体酶切后产生目的序列，所述目的序列包含序列SEQ ID NO.1；将目的序列接入到酶切后的表达载体上，获得重组表达质粒；
S8：用PvuI酶切重组表达质粒，得到线性化重组质粒，用Bio-Rad电转仪将所述线性化重组质粒转染至D1中的CHO细胞中，获得能够表达重组EPO的CHO细胞，并以此细胞作为样品进行下述实验。
实施例2
S1：从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有1%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化30秒，加入含15%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞；
S2：将细胞接种到含有1%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比1%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；
S3：待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；收集细胞，将细胞接种到含有0.5%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为4-6×105个/ml，进行悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；；
S4：重复步骤S3，直至细胞接种到含有0.125%FBS的CD CHO培养基中；
S5：待样品中所述细胞在含0.125%FBS的CD CHO培养基中培养至少1代后，收集上清液，将上清液经0.22μm过滤，获得第一条件培养基；将所述第一条件培养基与CD CHO培养基等体积混合，获得第一混合培养基；将细胞接种到第一混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.5%的ACA，4mM的L-谷氨酰胺，于37℃、7.5%CO2、130r/min的培养条件下培养。
S6：复苏S5中的CHO细胞，置于摇床中，37℃、7.5%CO2、130r/min培养；待活细胞密度达到2-5×106个/ml是，按0.2-0.4×106个/ml密度进行传代；调整活细胞密度至0.5×106个/ml，培养24h后用于转染；
S7：制备含有序列SEQ ID NO.1的克隆载体，并添加相应的酶切位点；准备表达载体pQKX2；以限制性内切酶SapI及EcoRI对克隆载体及表达载体同时进行酶切；克隆载体酶切后产生目的序列，所述目的序列包含序列SEQ ID NO.1；将目的序列接入到酶切后的表达载体上，获得重组表达质粒；
S8：用PvuI酶切重组表达质粒，得到线性化重组质粒，用Bio-Rad电转仪将所述线性化重组质粒转染至D1中的CHO细胞中，获得能够表达重组EPO的CHO细胞，并以此细胞作为样品进行下述实验。
实施例3
S1：从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，收集细胞，接种至含有5%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化50秒，加入含20%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞，接种至含有1.2%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化50秒，加入含20%FBS的完全培养基终止消化，离心收集从壁上脱落的细胞；
S2：将细胞接种到含有1.2%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为40ml，细胞接种后密度为7-8×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入5mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比1%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，8%CO2，150r/min；
S3：待细胞在上一血清浓度的培养基中生长到0.9-1.2×106个/ml时，取部分细胞加入至含完全培养基的摇瓶内，使该摇瓶内细胞密度达到5-8×105个/ml，培养至细胞数量增加；收集细胞，将细胞接种到含有0.6%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为40ml，细胞接种后密度为7-8×105个/ml，进行悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，8%CO2，150r/min；
S4：重复步骤S3，直至细胞接种到含有0.15%FBS的CD CHO培养基中；
S5：待样品中所述细胞在含0.125%FBS的CD CHO培养基中培养至少1代后，收集上清液，将上清液经0.22μm过滤，获得第一条件培养基；将所述第一条件培养基与CD CHO培养基等体积混合，获得第一混合培养基；将细胞接种到第一混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入1%的ACA，5mM的L-谷氨酰胺，于37℃，8%CO2，150r/min的培养条件下培养。
S6：复苏S5中的CHO细胞，置于摇床中，37℃，8%CO2，150r/min培养；待活细胞密度达到2-5×106个/ml是，按0.2-0.4×106个/ml密度进行传代；调整活细胞密度至0.6×106个/ml，培养24h后用于转染；
S7：制备含有序列SEQ ID NO.1的克隆载体，并添加相应的酶切位点；准备表达载体pQKX2；以限制性内切酶SapI及EcoRI对克隆载体及表达载体同时进行酶切；克隆载体酶切后产生目的序列，所述目的序列包含序列SEQ ID NO.1；将目的序列接入到酶切后的表达载体上，获得重组表达质粒；
S8：用PvuI酶切重组表达质粒，得到线性化重组质粒，用Bio-Rad电转仪将所述线性化重组质粒转染至D1中的CHO细胞中，获得能够表达重组EPO的CHO细胞，并以此细胞作为样品进行下述实验。
实施例4
本实施例与实施例2的步骤基本相同，不同之处在于，
（1）步骤S1后，还增加有步骤S11，
S11：将脱壁处理步骤中离心收集的细胞，根据悬浮培养步骤中的需要量，用1ml含有0.2%甘油的第三驯化培养基进行吹打处理，使所述细胞悬浮于第三驯化培养基中，静置1min，再次混匀，并将相应量的第三驯化培养基加入至摇瓶中，补足相应的培养基，进行培养。
（2）步骤S2为：
S2：将细胞接种到含有1%FBS的CD CHO培养基中，培养体积为30ml，细胞接种后密度为2.5-3×105个/ml，进行摇瓶悬浮培养，所述CD CHO培养基中加入4mM的L-谷氨酰胺，以及按体积比0.5%加入硫酸葡聚糖，培养条件为37℃，7.5%CO2，130r/min；
实施例5
本实施例与实施例4的步骤基本相同，不同之处在于，
S11：将脱壁处理步骤中离心收集的细胞，根据悬浮培养步骤中的需要量，用5ml含有1%甘油的第三驯化培养基进行吹打处理，使所述细胞悬浮于第三驯化培养基中，静置2min，再次混匀，并将相应量的第三驯化培养基加入至摇瓶中，补足相应的培养基，进行培养。
实施例6
本实施例与实施例4的步骤基本相同，不同之处在于，
S11：将脱壁处理步骤中离心收集的细胞，根据悬浮培养步骤中的需要量，用10ml含有2%甘油的第三驯化培养基进行吹打处理，使所述细胞悬浮于第三驯化培养基中，静置5min，再次混匀，并将相应量的第三驯化培养基加入至摇瓶中，补足相应的培养基，进行培养。
实施例7
本实施例与实施例4的步骤基本相同，不同之处在于，
（1）步骤S5中，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.4mg/L；
（2）步骤S5后，还增加有步骤S51，
制备第二条件培养基，待第一轮接种培养的细胞浓度达到1.5-1.8×106个/ml时，收集上清液，将上清液经过滤，获得第二条件培养基；过滤时，过滤孔径优选0.22μm；
制备第二混合培养基，将所述第二条件培养基与第二驯化培养基等体积混合，获得第二混合培养基；
第二轮接种培养，将细胞接种到第二混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.25%的硫酸葡聚糖，于37℃、7%CO2、100r/min的培养条件下培养。
实施例8
本实施例与实施例7的步骤基本相同，不同之处在于，
（1）步骤S5中，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.42mg/L；
（2）步骤S51：
制备第二条件培养基，待第一轮接种培养的细胞浓度达到1.5-1.8×106个/ml时，收集上清液，将上清液经过滤，获得第二条件培养基；过滤时，过滤孔径优选0.22μm；
制备第二混合培养基，将所述第二条件培养基与第二驯化培养基等体积混合，获得第二混合培养基；
第二轮接种培养，将细胞接种到第二混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.5%的硫酸葡聚糖，于37℃、7.5%CO2、130r/min的培养条件下培养。
实施例9
本实施例与实施例7的步骤基本相同，不同之处在于，
（1）步骤S5中，所述第一混合培养基中加入D-生物素，使其终浓度在0.45mg/L；
（2）步骤S51：
制备第二条件培养基，待第一轮接种培养的细胞浓度达到1.5-1.8×106个/ml时，收集上清液，将上清液经过滤，获得第二条件培养基；过滤时，过滤孔径优选0.22μm；
制备第二混合培养基，将所述第二条件培养基与第二驯化培养基等体积混合，获得第二混合培养基；
第二轮接种培养，将细胞接种到第二混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入1%的硫酸葡聚糖，于37℃、8%CO2、150r/min的培养条件下培养。
实施例10
取实施例8获得的细胞株，进行活化，用于蛋白表达。
将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至CD 07培养基中进行培养，所述CD07培养基中含有体积比0.25%的硫酸葡聚糖。控制温度在36℃，pH在6.8，溶解氧含量40%。
当培养基中细胞密度达到4-6×106个/ml后，每隔24h进行1.5%的CDF18补料。
当培养基中细胞密度达到8-12×106个/ml后，每隔48h进行0.3%的CDF28补料。
当培养基中细胞密度达到6-8×106个/ml后，将反应器温度降低至32.5℃。
实施例11
取实施例8获得的细胞株，进行活化，用于蛋白表达。
将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至CD 07培养基中进行培养，所述CD07培养基中含有体积比0.5%的硫酸葡聚糖。控制温度在37℃，pH在7.0，溶解氧含量50%。
当培养基中细胞密度达到4-6×106个/ml后，每隔24h进行2%的CDF18补料。
当培养基中细胞密度达到8-12×106个/ml后，每隔48h进行0.4%的CDF28补料。
当培养基中细胞密度达到6-8×106个/ml后，将反应器温度降低至33℃。
实施例12
取实施例8获得的细胞株，进行活化，用于蛋白表达。
将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至CD 07培养基中进行培养，所述CD07培养基中含有体积比1%的硫酸葡聚糖。控制温度在38℃，pH在7.2，溶解氧含量60%。
当培养基中细胞密度达到4-6×106个/ml后，每隔24h进行2.5%的CDF18补料。
当培养基中细胞密度达到8-12×106个/ml后，每隔48h进行0.5%的CDF28补料。
当培养基中细胞密度达到6-8×106个/ml后，将反应器温度降低至34℃。
实施例13
取实施例11获得的上清液，进行EPO蛋白纯化。
所述蛋白纯化包括步骤：
S1，亲和层析：
层析柱：Blue Sepharose 6 FF（GE） 1.6×2.5cm 5ml
平衡液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.0
洗脱液：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0
上样洗脱，保留时间在580-620秒。
S2，疏水层析：
层析柱：HiTrap Butyl S FF（GE） 1ml
平衡液：20mM Tris-HCl，1.5M（NH4）2SO4，pH7.0
梯度洗脱液：从20mM Tris-HCl，1.5M（NH4）2SO4，pH7.0至20mM Tris-HCl，pH7.0
上样前，将亲和洗脱液用4M硫酸铵调节，获得含1.5M硫酸铵的亲和洗脱液，保留时间在230-250秒。
S3，超滤换液，将亲和层析后的洗脱液，用10KD超滤管进行超滤，并将样品换液至pH7.0的20mM Tris-HCl中，控制电导小于2ms/cm。
S4，阴离子层析：
层析柱：DEAE FF（GE）0.7×2.5cm 1ml
平衡液：20mM Tris-HCl，pH7.0
梯度洗脱液：从20mM Tris-HCl，pH7.0至20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0
上样洗脱，保留时间在230-250秒。
对比例1
样品制备：
S1：从液氮罐中取出冻存的CHO细胞，所述CHO细胞从ATCC采购，复苏后接种到含有10%FBS的F-12K培养基中进行方瓶培养，培养条件为37℃，5%CO2静置培养；
S2：制备含有序列SEQ ID NO.1的克隆载体，并添加相应的酶切位点；准备表达载体pQKX2；以限制性内切酶SapI及EcoRI对克隆载体及表达载体同时进行酶切；克隆载体酶切后产生目的序列，所述目的序列包含序列SEQ ID NO.1；将目的序列接入到酶切后的表达载体上，获得重组表达质粒；
S3：用PvuI酶切重组表达质粒，得到线性化重组质粒，用Bio-Rad电转仪将所述线性化重组质粒转染至D1中的CHO细胞中，获得能够表达重组EPO的CHO细胞。
将其按如下步骤进行发酵，并检测其在培养13天后的EPO表达量：
将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至CD 07培养基中，在2L反应器中进行培养，所述CD07培养基中含有体积比0.25%的硫酸葡聚糖。控制温度在37℃，pH在7，溶解氧含量50%。
对比例2
按CN102268402A所述的培养方法对实施例8中获得的细胞株进行发酵，并检测其在培养13天后的EPO表达量。
对比例3
将对比例1中的样品按实施例11中的方法进行发酵，并检测其在培养13天后的EPO表达量。
对比例4
按CN101153058A所述的纯化方法对实施例11中获得的上清液进行EPO蛋白纯化。
实施例14
对于实施例1-9所获得的的细胞株，将其按如下步骤进行发酵，并检测其在培养13天后的EPO表达量：
将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至CD 07培养基中，在2L反应器中进行培养，所述CD07培养基中含有体积比0.25%的硫酸葡聚糖。控制温度在37℃，pH在7，溶解氧含量50%。
对于实施例10-12、对比例2，按所述的发酵工艺，在2L反应器中进行培养，并检测其在培养13天后的EPO表达量。
检测结果如图7所示。
根据图7的结果可知，对比例1，也即没有经过悬浮培养驯化的细胞株，其EPO的表达量明显低于其他实施例；而在实施例1-9中，在第三轮驯化中增加第二轮接种培养的实施例（实施例7-9），其EPO表达量高于实施例1-6，证明第二轮接种培养步骤对EPO细胞株的表达有着积极影响；而实施例10-12中，EPO表达量明显高于实施例1-9及对比例2，证明本发明所提供的生产工艺，对EPO的表达有着积极影响；而在对比例3中，其表达量相对于对比例1虽然有所提高，但远不及实施例10-12对于实施例8表达的提高程度，这证明，本发明提供的生产工艺，与本发明所构建的细胞株相配合，能够更大程度的提高EPO的表达量。
实施例15
取实施例11获得的上清液，按实施例13、对比例4的方法进行EPO蛋白纯化，并对EPO纯度进行检测，检测结果如图8所示。
根据图8的结果可知，采用本发明提供的纯化工艺，对上清液的EPO进行纯化后，其纯度明显高于对比例4的纯化方法，因此采用本发明提供的纯化工艺，可以有效提高EPO蛋白的纯化效率。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京四环生物制药有限公司
<120> 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺
<130> 201911738
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 496
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcctccta gactgatctg cgactccaga gtgctggaaa gatacctgct ggaagccaaa 60
gaggccgaga acatcaccac cggctgtgcc gaacactgct ccctgaacga gaatatcacc 120
gtgcctgaca ccaaagtgaa cttctacgcc tggaagcgga tggaagtggg ccagcaggct 180
gtggaagttt ggcaaggact ggccctgctg tctgaggctg ttctgagagg acaggctctg 240
ctggtcaact cctctcagcc ttgggaacct ctgcagctcc atgtggacaa ggctgtgtcc 300
ggcctgagat ccctgaccac actgctgaga gctttgggcg ctcagaaaga ggccatctct 360
ccacctgatg ccgcctctgc tgctcccctg agaaccatca ccgccgacac cttcagaaag 420
ctgttccggg tgtactccaa cttcctgcgg ggcaagctga agctgtatac cggcgaggct 480
tgcagaaccg gcgatt 496

Claims (7)

1.一种高效表达重组人促红素的细胞株，所述细胞株为CHO细胞，其特征在于：所述CHO细胞内包括至少一个表达载体，所述表达载体使所述CHO细胞能够在适宜的培养条件下表达重组人促红素；
所述细胞株构建方法包括步骤：
细胞驯化，将CHO细胞驯化筛选，获得能够在合适培养基中以悬浮状态生长的CHO细胞株；
表达载体构建，将EPO编码序列接入到空载体上；
载体转染，将构建的表达载体转染进入到CHO细胞内;
其中，所述细胞驯化包括步骤：
第一轮驯化，使细胞在贴壁状态下培养，并将第一驯化培养基中的血清含量降低至0.8-1.2%，所述第一驯化培养基为能够使CHO细胞在贴壁状态下生长的培养基；
第二轮驯化，将细胞接种至含有0.8-1.2%血清的第二驯化培养基中，并悬浮培养，并将第二驯化培养基中的血清含量降低至0.1-0.15%，其中，所述第二驯化培养基中含有2-6mM的L-谷氨酰胺，所述第二驯化培养基为能够使CHO细胞在悬浮状态下生长的培养基；
第三轮驯化，通过用无血清培养基替换原培养基的方法，完全去除培养基中的血清。
2.根据权利要求1所述的高效表达重组人促红素的细胞株，其特征在于：所述第一轮驯化包括步骤：
细胞培养，将细胞在含有8-12%血清的第一驯化培养基中进行培养；
降血清贴壁培养，收集细胞，并将第一驯化培养基血清浓度降低到0.8-1.2%。
3.根据权利要求1或2所述的高效表达重组人促红素的细胞株，其特征在于：所述第二轮驯化包括步骤：
细胞培养，将待驯化细胞在含有0.8-1.2%血清的第一驯化培养基中培养；
脱壁处理，当细胞汇合度到70-80%时，用胰酶消化，离心收集从壁上脱落的细胞；
悬浮培养，将细胞接种到含有0.8-1.2%血清的第二驯化培养基中，进行悬浮培养；
降血清悬浮培养，将第二驯化培养基血清浓度降低到0.1-0.15%。
4.根据权利要求3所述的高效表达重组人促红素的细胞株，其特征在于：所述细胞接种后密度为2.5-3×105个/ml。
5.根据权利要求4所述的高效表达重组人促红素的细胞株，其特征在于：所述第二轮驯化还包括步骤：
细胞预处理，将脱壁处理步骤中离心收集的细胞，根据悬浮培养步骤中的需要量，用1-10ml第三驯化培养基进行吹打处理，使所述细胞悬浮于第三驯化培养基中，静置1-5min，再次混匀，并将相应量的第三驯化培养基加入至摇瓶中，补足相应的培养基，进行培养；所述第三驯化培养基为含有0.2-2%甘油的CD CHO培养基。
6.根据权利要求1或5所述的高效表达重组人促红素的细胞株，其特征在于：所述第三轮驯化包括步骤：
制备第一条件培养基，经过第二轮驯化，待所述细胞在含0.1-0.15%血清、0.25-1%的抗结团剂的第二驯化培养基中培养至少1代后，收集上清液，将上清液经过滤，获得第一条件培养基；
制备第一混合培养基，将所述第一条件培养基与第二驯化培养基等体积混合，获得第一混合培养基；
第一轮接种培养，将细胞接种到第一混合培养基中，使细胞密度达到4-8×105个/ml，按体积比加入0.25-1%的抗结团剂，于36-38℃、7-8%CO2、100-150r/min的培养条件下培养；
收集菌种，将细胞冻存备用。
7.一种重组人促红素的生产工艺，其特征在于：包括步骤：
细胞活化，将如权利要求1-6任一项所述的细胞株复苏；
反应器培养，将复苏的细胞以接种密度4-8×105个/ml加入至培养基中进行培养，控制温度在36-38℃，pH在6.8-7.2，溶解氧含量40-60%；
蛋白纯化，对培养液中的EPO进行纯化。
CN202010164541.3A 2020-03-11 2020-03-11 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺 Active CN111019907B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010164541.3A CN111019907B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010164541.3A CN111019907B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111019907A true CN111019907A (zh) 2020-04-17
CN111019907B CN111019907B (zh) 2021-03-16

Family

ID=70199318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010164541.3A Active CN111019907B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111019907B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838664A (zh) * 2016-04-20 2016-08-10 深圳新鹏生物工程有限公司 一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法
CN106282090A (zh) * 2015-06-08 2017-01-04 齐鲁制药有限公司 一种驯化后的cho-s细胞系及其培养方法与应用
WO2018188639A1 (zh) * 2017-04-13 2018-10-18 浙江海隆生物科技有限公司 猪流行性腹泻病毒s蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN109321519A (zh) * 2018-09-11 2019-02-12 上海奥浦迈生物科技有限公司 Cho-k1悬浮驯化培养基及驯化方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282090A (zh) * 2015-06-08 2017-01-04 齐鲁制药有限公司 一种驯化后的cho-s细胞系及其培养方法与应用
CN105838664A (zh) * 2016-04-20 2016-08-10 深圳新鹏生物工程有限公司 一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法
WO2018188639A1 (zh) * 2017-04-13 2018-10-18 浙江海隆生物科技有限公司 猪流行性腹泻病毒s蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN109321519A (zh) * 2018-09-11 2019-02-12 上海奥浦迈生物科技有限公司 Cho-k1悬浮驯化培养基及驯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111019907B (zh) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111549002B (zh) 一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法
EP0485689B1 (en) Cells growing in protein-free medium, and enhancing replication of exogenous genes
CN111019907B (zh) 一种高效表达重组人促红素的细胞株及生产工艺
JPH08511173A (ja) バイオリアクターのための培養培地添加物
CN110551693A (zh) 抗生素筛选hek细胞的方法
CN114015644A (zh) 一种单一病毒收获液的生产方法
CN114350584A (zh) 高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用
CN107523555A (zh) 获得病毒的方法
WO2023116728A1 (zh) 一种双特异性抗体的生产方法
CN108795885A (zh) 生产重组腺病毒的方法
CN115976145B (zh) 一种用于生产pd-1抗体的cho细胞高效灌流补料培养方法
CN111320699B (zh) 从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素融合蛋白的方法
CN112679601A (zh) 一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法
CN107778365A (zh) 一种多点整合的重组蛋白表达方法
CN109852623A (zh) 一种peg修饰的重组人源化尿酸氧化酶的制备方法、纯化方法及其用途
CN110627892B (zh) 一种重组人血小板生成因子原液的制备方法
CN114958627A (zh) 一株高产生育酚的重组裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用
AU758209B2 (en) Preparation of cells for production of biologicals
CN105838664B (zh) 一种细胞悬浮培养生产重组人血小板生成素的方法
CN105950566A (zh) 一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法
CN113667650A (zh) 一种11α-羟化酶突变体及其应用
CN110714036A (zh) 苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的应用
CN114480354A (zh) 一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法
CN101096655A (zh) 微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂tnk突变体的工艺
CN116694580A (zh) 一种生产重组腺病毒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 5 Jian'an street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Patentee after: BEIJING FOUR RINGS BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: No.5 Jian'an street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Tongzhou District, Beijing

Patentee before: BEIJING FOUR RINGS BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

CP02 Change in the address of a patent holder