CN101096655A - 微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂tnk突变体的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种采用Cytopore多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的新生产工艺，将TNK-tPA基因工程CHO细胞株加培养基重新悬浮后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌器培养后，转移到Celligen反应器中，培养温度为37℃；pH＝7.1±0.1；溶氧为30～60％范围内；转速：起始转速为20rpm，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。用Cytopore多孔微载体培养TNK-tPA基因工程细胞生产TNK-tPA，具有细胞密度大、成本低、表达水平高、表达产物比活高的特点，且操作简单，适合于大规模培养及产业化生产。

Description

微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺

技术领域

本发明涉及重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(rhTNK-tPA)的生产新工艺，尤其是公开一种采用Cytopore多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，以生产rhTNK-tPA，属于细胞培养生产工艺方法技术领域。

背景技术

本发明涉及的rhTNK-tPA可在临床上用于心肌梗死、脑血栓等血栓性疾病的抢救与治疗，是此类疾病抢救与治疗的最新一代特效药物，具有疗效好、安全性高、使用方便及便于抢救等众多优点。由于rhTNK-tPA在临床上用量很大，一般为30-40mg/剂，因此，如工程细胞株的大规模培养技术不能高效表达生产rhTNK-tPA，则rhTNK-tPA产业化将无法进行，使rhTNK-tPA这种优良的药物应用于临床也就没有可能。

目前，rhTNK-tPA在全球只有美国Genentech公司一家生产，其中的工程细胞培养的工艺技术是采用发酵罐悬浮性、批次性的培养法，其缺点是成本很高、工艺操作复杂，且不易扩大生产规模。

发明内容

本发明提供一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，克服了现有发酵罐悬浮性、批次性  培养法，成本很高、工艺操作复杂等缺欠，适合于大规模培养及产业化生产。

本发明的技术方案是：

在10L celligen灌注培养系统中采用Cytopore多孔微载体培养rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞，以生产rhTNK-tPA。

A、设计和合成基因

将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177位AAC/Asn变为CAA/Gln(N117Q)，再将天然型tPA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR(296-299)AAAA]。

根据天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、N、K突变位点的tPA突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入Xho I和XbaI限制性内切酶位点。基因全长1.7kb。采用全基因人工合成的方法获得基因。

B、构建TNK-tPA真核表达质粒

将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的基因的1.7kb的DNA片段，与以Xho I/Xba I双酶切的哺乳动物细胞表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coli JM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA。

C、转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆，构建工程细胞株，建立工程细胞库。

D、rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞的培养发酵

将冻存的TNK-tPA基因工程CHO细胞株，置水浴中快速融解，将细胞加入培养液，混匀离心，弃上清；细胞沉淀加培养基重新悬浮后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌器培养14-18天，达到2×10⁷/mL后，直接转移到Celligen反应器中，采用Cytopore多孔微载体进行培养。培养温度为37℃；pH＝7.1±0.1；溶氧为30～60％范围内；转速：起始转速为20rpm，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。

本发明的有益效果在于：采用Cytopore多孔微载体培养TNK-tPA基因工程细胞以生产TNK-tPA，具有细胞密度大、成本低、表达水平高、表达产物比活高的特点，且操作简单，适合于大规模培养及产业化生产。该法细胞密度达到3×10⁷/mL以上，rhTNK-tPA表达水平可达55mg/L以上，培养液的比活可达3.8万IU/mL以上，其纯化物的比活可达50万IU/mg以上。

具体实施方式

实施例

1、材料

1.1多孔微载体

Cytopore微载体为Pharmacia公司产品，基质是纤维素，直径200μm，孔径30μm，膨胀体积为40mL/g。

用前用0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡4h后，倾去PBS，再用PBS洗涤3次。121℃高压灭菌30min后，吸出PBS，用DMEN培养基洗两次。

1.2细胞

生产rhTNK-tPA的工程细胞为含有TNK-tPA cDNA和dhfr基因的CHO细胞系。

1.3培养基

培养基为DMEN，其中含5％胎牛血清(FBS)。培养基和FBS均为GIBCO公司产品，

1.4试剂

CHO-S-S II，GIBCO公司产品

MTX，SIGAN公司产品

庆大霉素，国产药用级

0.25％胰酶，国产分析纯产品

其它试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.5培养容器及仪器

首先用Wheaton公司生产的搅拌器(1000mL)培养，搅拌转速20～40r/min，之后转入Celligen 10L旋转生物反应器(NBS公司产品)灌注培养。

旋转生物反应器(即发酵罐)系统能自动控制温度、pH、转速、溶氧含量。通过气体混合器改变氮气、氧气、空气和二氧化碳的流量来控制溶解氧和pH，采用硅胶管无泡气体交换系统，孔径75μm的不锈钢旋转滤器通过截流微载体而截留生长在微载体内的细胞，脱落细胞可进入旋转滤器内随培养上清流出反应器，避免堵塞。

1.6细胞计数

柠檬酸结晶紫法，保温时间延长至4小时，并不时振摇。

1.7 rhTNK-tPA含量测定

采用tPA-ELISA检测盒(Pharmacia公司产品)，按检测盒的操作步骤进行，以标准品绘制标准曲线，然后计算出样品含量。

1.8 rhTNK-tPA活性测定

采用发泡法进行，具体操作方法见《中华人民共和国药典》第二部。

1.9葡萄糖、乳酸和氨的测定

使用血糖检测盒(北京百泰生物技术公司产品)测定样品中的葡萄糖含量。使用乳酸和氨检测盒(德国Centronic公司产品)分别测定样品中乳酸和氨的含量。

1.10其它仪器或器材

二氧化碳培养箱、倒置光学显微镜、生物安全柜、T-25、T-75、T-150细胞培养瓶等。

2方法

2.1工程细胞株的构建

设计和合成基因：

将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177位AAC/Asn变为CAA/Gln(N117Q)，再将天然型tPA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR(296-299)AAAA]。

根据野天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、N、K突变位点的tPA突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入Xho I和XbaI限制性内切酶位点。基因全长1.7kb。采用全基因人工合成的方法获得基因。

构建TNK-tPA真核表达质粒：

将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的基因的1.7kb的DNA片段，与以Xho I/Xba I双酶切的哺乳动物细胞表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.cdi JM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA。

转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆：

以TNK-tPA表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO(DHFR-)细胞，以含双抗的选择性培养液培养，每隔二～三天换一次培养液，直到大部分细胞死亡并从培养板上脱落，少数整合外源基因的细胞克隆在选择性培养液上存活下来，并不断分裂形成细胞集落(克隆)。当细胞数目增加到一定程度时，收集各孔培养上清，检测表达产物。选取表达量高的克隆，以胰酶消化，重新分入细胞培养板中，换用含MTX的选择培养液进行培养，在培养过程中，大部分细胞死亡，又有少数细胞形成新的克隆。重复上述操作，将MTX浓度提高一个水平。在克隆的筛选过程中，MTX浓度从4×10^-8M逐步提高到1.5×10^-6M，同时tPA的表达水平也逐步提高。将获得的阳性细胞克隆进行鉴定，符合要要求后，建立工程细胞库。

2.2细胞复苏

从细胞种子库中取出冻存的细胞株，立即置37℃水浴中快速融解，将细胞加入10mL IMDM培养液(含10％FBS、2×10^-8M MTX、100IU/庆大霉素)，混匀，800～1000mrp离心15分钟，弃上清。细胞沉淀重新悬浮10毫升上述培养基中，转移至T25细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养。次日换液。一般2-3天细胞形成致密单层细胞。

2.3细胞扩增

上述单层细胞转入Wheaton搅拌器培养。由于Cytopore微载体是多孔性的，非常有利于细胞的贴附，当培养基中微载体膨胀体积/培养体积为1/10时(2.5mg/mL)，细胞经14～18天培养，即可达到2×10⁷/mL，此时细胞已完全长满微载体。在培养过程中，随着细胞浓度的升高，换液频率由隔天一次逐渐增加到一天两次。

2.4旋转生物反应器(发酵罐)培养

2.4.1准备

将罐体清洗干净后用加入PBS缓冲液(一般为罐体积的2/3)，120℃ 2小时灭菌。

次日补加PBS，安装并校正PH电极、溶氧电极、液位电极等，120℃ 2小时灭菌。

2.4.2培养

a、参数设定

冷却后的培养装置工作参数设定：

PH      7.1±0.1

DO      30-60％

温度37℃

起始转速20～100rpm

12小时后，排空PBS缓冲液，加入等体积用IMDM培养液(含5％FBS、2×10^-8M MTX、100IU/ml庆大霉素)悬浮经湿热灭菌的微载体(5g/L)。

b、接种

将在搅拌器中生长达到2×10⁷/mL的细胞直接转移到Celligen反应器中，并补充培养液及新鲜微载体(5mg/mL)，接种细胞量为1∶10。细胞能够在微载体珠间自动转移，新鲜微载体逐渐长满细胞。7天后，新鲜微载体上长有细胞。经20天左右的培养，细胞浓度可达到3×10⁷/mL。

c、培养过程控制

培养基流加：流加IMDM培养液(10％FBS、2×10^-8M MTX)，使培养体系中葡萄糖的含量维持在10mmol/L水平以上，每天耗糖在5g/L以上时，细胞密度达到1～2×10¹⁰个细胞/L。

流加CHO-S-S II培养液(含葡萄糖4克/L、2×10^-8M MTX)4个培养体积后，流加含抑肽酶的CHO-S-S II培养液(含葡萄糖4克/L、2×10^-8MMTX)，并单独收获该培养物质，用于纯化生产TNK-tPA蛋白质。

d、注意

细胞培养达到较高密度时，产酸增加，培养体系酸化较快，系统自动根据PH变化，自动流加7.5％NaHCO3，pH值控制在7.1±0.1范围内。

乳酸和氨在培养液中的浓度分别不超过2g/L和3.6mmol/L。

温度：因TNK-tPA-CHO细胞的最适生长温度为37℃，故培养温度为37℃。

溶氧：设定在30～60％范围内。

转速：起始速为20rpm，以利于细胞黏附在微载体上，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm。

3  结果

细胞密度达到3×10⁷/mL以上，rhTNK-tPA表达水平可达55mg/L以上，培养液的比活可达3.8万IU/mL以上，其纯化物的比活可达50万IU/mg以上。

Claims (2)

1、一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，在10L celligen灌注培养系统中采用Cytopore多孔微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的基因工程CHO细胞。

2、一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，包括以下步骤：

A、设计和合成基因

将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177位AAC/Asn变为CAA/Gln(N117Q)，再将天然型tPA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR(296-299)AAAA]；

根据天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、N、K突变位点的tPA突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入Xho I和Xba I限制性内切酶位点，基因全长1.7kb；

B、构建TNK-tPA真核表达质粒

将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的基因的1.7kb的DNA片段，与以Xho I/Xba I双酶切的哺乳动物细胞表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coLi JM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA；

C、转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆，构建工程细胞株，建立工程细胞库；

D、rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞的培养发酵

将冻存的TNK-tPA基因工程CHO细胞株，置水浴中快速融解，将细胞加入培养液，混匀离心，弃上清；细胞沉淀加培养基重新悬浮后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌器培养14-18天，达到2×10⁷/mL后，直接转移到Celligen反应器中，采用Cytopore多孔微载体进行培养；培养温度为37℃；pH＝7.1±0.1；溶氧为30～60％范围内；转速：起始转速为20rpm，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。