CN105483092A - 一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列细胞微载体培养和病毒包装实现中试化生产重组腺相关病毒的新技术，包括：（1）细胞培养：将293系列细胞接种到细胞培养袋中微载体上，加入培养基，摇动培养袋；（2）病毒包装：沉降微载体，加入新鲜培养基、转染试剂和病毒包装所用三质粒体系，共转染后继续培养细胞实现病毒包装；（3）病毒分离纯化：培养结束后，离心、抽滤或过滤收集上清，用AKTA蛋白核酸层析系统分离纯化病毒；（4）病毒滴度测定：用Q-PCR仪测定病毒滴度。该技术可实现细胞自动规模化培养、实现细胞转染及病毒包装、实现重组病毒中试化生产，满足更广大科研用户，缓解病毒载体市场供需矛盾，减少人力成本投入。

Description

一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术

技术领域

本发明专利涉及一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术，尤其涉及一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列细胞微载体培养和重组腺相关病毒包装实现病毒中试化生产的技术，属于生物技术领域。

背景技术

腺相关病毒(Adenoassociatedvirus,AAV)是目前世界公认的安全，可靠的基因传递载体，已在众多临床研究和应用中得到进一步的见证，包括帕金森病和阿尔茨海默病在内的一些脑部疾病、血友病、肌肉萎缩、心脏衰竭乳腺癌、肺癌等肿瘤和先天性失明眼疾病中都有很好地治疗。

近两年来国家自然科学基金涉及基因治疗的技术方法中有关AAV的研究比例上升3～5倍之多。以及一些如中国人民解放军总医院、西南医院、云南省肿瘤医院、上海肿瘤医院等大型医院对AAV载体基因治疗临床方案和生产应用均具有强烈的市场需求；同时国内一些药物研发企业已有AAV治疗方案，且已进入大规模动物体内实验阶段或临床前药物阶段。由此看来，未来几年随着全球大型药企的新药逐步大量进入临床阶段而推向市场，以及国内药企的新药研究也将陆续进入大动物(狗和猴)体内给药实验阶段和临床前试验阶段。因此，对AAV基因载体的市场需求将呈爆发式增长。

目前，腺相关病毒载体的生产多是利用转瓶方式进行病毒包装细胞的培养，然后实施手动细胞转染来完成病毒包装。转瓶培养细胞增殖缓慢且生产过程中对细胞的培养条件如pH，通气溶氧、培养液成分等难以监控和适时补给，无法提供细胞最适增殖条件，劳动强度大，自动化程度低；手动细胞转染容易出现转染不稳定，转染效率低等情况易产生认为误差。再加上转瓶培养时培养条件的不可控性，导致批量间细胞活力差异性大、不稳定等，易引起病毒包装生产过程中出现产病毒的滴度低或者不产毒现象。此外，利用转瓶培养和人工手动细胞转染不适合大批量生产病毒载体，如要实现病毒的大量生产只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备、人员的大量投入。而用生物反应器进行病毒包装细胞培养则可以克服上述的不足，同时在生物反应器内实施病毒包装细胞的转染过程，不仅充分提高了生物反应器的利用效率，也增加了设备的生产能力，更加有利于实现病毒载体的中试化生产。

WAVE波浪式生物反应器采用非介入式的波浪混合方式，提供温和低剪切力高溶氧的细胞培养微环境，有利于提高细胞密度、改善细胞状态，易于线性放大。无菌细胞培养袋培养体积灵活、操作简单、有效降低污染风险，从而缩短工艺开发周期，提高产能。

采用WAVE波浪式生物反应器进行重组腺相关病毒包装细胞培养和病毒细胞的转染以实现中试化生产病毒。其中所使用的微载体类型、加入的微载体含量，细胞接种密度，培养袋中培养液的体积以及培养袋的摇动转速等均影响到病毒包装细胞的生理活性，进而影响到后续的病毒产毒能力和产毒效率，在生产实践中需要对上述培养技术和条件进行优化。

发明内容

本发明专利的目的是利用WAVE波浪式生物反应器进行微载体培养293系列病毒包装细胞来中试化生产重组腺相关病毒的技术。该技术通过对所使用的微载体类型、加入的微载体含量，细胞的接种密度，培养袋中培养液的体积以及培养袋摇动的转速等进行优化，有效地保持细胞稳定性，提高病毒的滴度和产毒效率，满足更广大客户需求，节省大量人力资源的消耗。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列病毒包装细胞微载体培养实现重组腺相关病毒中试化生产的新技术，包括：(1)细胞培养：将293系列细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；(2)病毒包装：沉降微载体，加入新鲜细胞培养基、细胞转染试剂和病毒包装所用三质粒体系，进行共转染后继续培养细胞实现病毒包装；(3)病毒分离与纯化：细胞培养结束后，通过离心、抽滤或过滤的形式收集上清，利用AKTA蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化；(4)病毒滴度测定：利用荧光定量实时PCR仪检测病毒的基因组拷贝数来测定病毒滴度。

采用WAVE波浪式生物反应器培养293系列细胞时，培养袋中培养液的装液量影响细胞培养过程中的溶氧；摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有明显的影响，为了确定最适宜的装液量和摇动培养参数，本发明对培养袋中培养液的装液量、摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对细胞生长的影响。通过实验发现，培养液的装液量为50％～65％(v/v)WAVE摆动角度是8～15°，摆动速度是10～15rpm时，细胞生长状态最佳，细胞产量最高。

微载体类型影响细胞与微载体间的吸附作用力，细胞只有被吸附方可实现增殖；同种材料的微载体不同粒径影响微载体的比表面积，影响吸附细胞的数量进而影响细胞的生长特性。Cytodex1适用于通用微载体培养(generalpurposemicrocarrierculture)，尤其适用于大多数已建立的细胞系(establishedcelllines)。Cytodex2适用于病毒，原代细胞或成纤维二倍体细胞的培养；Cytodex3是用于某些难以生长的细胞、分化细胞培养系统、尤其是具有上皮样形态学特征细胞的首选微载体。

在固定每克微载体接种相同细胞数的前提下，本发明考察微载体Cytodex1、Cytodex2和Cytodex3对细胞生长的影响，确定适合的微载体为Cytodex1和Cytodex3。

此外，细胞接种密度与微载体含量对细胞生长也有显著影响，其中重要的是细胞接种密度与微载体的比例关系。本发明考察微载体Cytodex1和Cytodex3,用量均设置为1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，细胞接种密度设置为1×10⁵个/mL，3×10⁵个/mL,5×10⁵个/mL,7×10⁵个/mL,1×10⁶个/mL,3×10⁶个/mL,5×10⁶个/mL,确定细胞接种密度为3×10⁵～1×10⁶个/mL，微载体的用量为2～5g/L时，细胞生长密度较高。

利用实用新型专利(CN201520715680.5)中提到的一种用于实现磷酸钙法快速批量转染细胞的装置，进行细胞转染试剂和病毒包装所用三质粒系统适当比例混合，然后再将混合液泵入WAVE反应器内与所培养的病毒包装细胞混合进行细胞转染和细胞培养，并完成病毒包装，获得高滴度的病毒。

利用AKTApure150蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化，获得高纯度的病毒。

本发明技术优化了重组腺相关病毒中试化生产的工艺参数，提高了293系列病毒包装细胞的培养效率，进行了病毒包装细胞的半自动化批量转染，获得了高滴度、高纯度的重组腺相关病毒，实现了病毒的中试化生产。

附图说明

图1为WAVE反应器微载体培养293系列细胞光学显微镜图(放大倍数为10×10)

图2为293系列包装细胞转染后白光显微镜图(放大倍数为4×10)

图3为293系列包装细胞转染后荧光显微镜图(放大倍数为4×10)

图4重组腺相关病毒AKTA分离纯化图

具体实施方式

结合具体实施方案进一步描述本发明，这些实施例仅为范例性，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员需要理解的是，在不偏离本发明的实质内容范围下，可以对本发明技术方案的细节和实施进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料与仪器

1.1生物反应器：美国GE公司ReadytoProcessWAVE25波浪式生物反应器。

1.2微载体：Cytodex-1,Cytodex-2,Cytodex-3(购自美国GE公司)。

1.3病毒包装细胞：293系列细胞(如293TN，HEK293和293T细胞)。

1.4腺相关病毒包装三质粒系统：辅助质粒Ⅰ，辅助质粒Ⅱ，重组质粒Ⅲ。

1.5细胞转染试剂：0.25mol/L的CaCl₂溶液，2×BBS缓冲液(硼酸缓冲液)

实施例1.利用WAVE波浪式生物反应器进行微载体培养293系列病毒包装细胞中试化生产重组腺相关病毒

1.293TN细胞的培养

1.1微载体预处理：参考GEHealthcare提供的《微载体细胞培养：原理与方法》(18-1140-62)手册，进行微载体预处理。

1.2细胞复苏培养：预热DMEM培养基，从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻移至超净工作台；无菌操作吸出细胞悬液加入3ml培养基中，再加入5ml培养基稀释，轻柔吹散；1000rpm，3min离心收集细胞；适量培养基重悬细胞接种。

1.3微载体培养：用EDTA-胰酶处理的细胞消化液制备接种细胞，细胞计数后按3×10⁵～1×10⁶个/mL密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养袋中微载体浓度为2～5g/L，DO值为30％，温度37℃，摆动角度8～14°，摆动速度是10～15rpm。培养过程中取样观察细胞生长状态并进行细胞计数，当细胞的密度达到4×10⁶个/mL或以上时，流出已培养过细胞的培养基灌注新鲜DMEM培养基。

2.病毒的包装：

2.1细胞转染：利用实用新型专利CN201520715680.5中提及的装置，将细胞转染试剂与病毒包装三质粒系统进行适当比例的混合，混合后利用蠕动泵导入至含有细胞密度为4×10⁶个/mL的WAVE反应器内，转染6～8h。

2.2病毒包装：细胞转染6～8h后，流出培养液加入新鲜DMEM培养基，继续培养72h～120h，培养期间可间隔24h对培养基进行更换，培养结束后收集上清即为重组病毒粗提液。

3.病毒分离纯化：

3.1病毒分离：通过高速离心或直接过滤、抽滤等方式收集重组病毒粗提液。离心转速为3000～5000rpm，离心10～15min。

3.2病毒纯化：将分离收集到的重组病毒粗提液，利用AKTApure150蛋白核酸层析系统进行分离纯化，具体纯化步骤为：1)装柱：选用GE公司生产的编号为28988948的XK26/20层析柱(内径26mm，柱高20cm)，使用的填充料为QsphoraseXP。用蠕动泵以2ml/min的转速，将填充料泵入层析柱，柱床高度填充至100mm。2)柱平衡：以流速为0.2～1ml/min，使用20mMol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲体系进行柱平衡；3)上样：上样流速为0.2～5ml/min。4)洗脱：使用内含终浓度为0.5Mol/LNaCl的20mMol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱流速为0.2～1ml/min。5)收集：依据病毒洗脱出峰位置进行样品收集。

4.病毒滴度测定：取20ul纯化的病毒液，加入1ulRNAse-freeDNAse，混匀，37℃水浴反应30min；4℃，12000rpm/min，离心10min，取10ul上清到另一个无菌的1.5mlEP管中；加入90ulDilutionBuffer(1mMTris-HCl,pH8.0，0.1mMEDTA，150mMNaCl)，混匀，37℃金属浴反应30min；自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h；100℃金属浴反应10min，自然冷却至室温进行Q-PCR检测。

实验例1.适合的微载体筛选实验

在固定接种相同293TN细胞数的前提下,设置三组考察实验，分别考察微载体Cytodex1、Cytodex2和Cytodex3对细胞增殖的影响。每组考察实验设3个平行实验，且每个实验的最初细胞接种密度均为3×10⁵个/mL，以及所加入的微载体Cytodex1、Cytodex2和Cytodex3的用量均为3g/L。

实验结果见表1。由表可看出，经过24h和48h的微载体培养，细胞密度均有所增加。然而，不同微载体培养的293TN细胞，其细胞密度变化存在一定差异性，尤其是利用微载体Cytodex2培养293TN细胞后，细胞的密度增加不显著；而利用微载体Cytodex1和微载体Cytodex3培养293TN细胞时，48h后细胞密度均增加为最初接种时的近7～9倍。因此，本发明确定使用微载体Cytodex1和微载体Cytodex3进行293TN细胞的中试培养。

表1.不同微载体类型对细胞生长的影响

实验例2.微载体用量优化实验

以微载体Cytodex1和微载体Cytodex3为优化对象，其用量设置为1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，细胞初始接种密度为3×10⁵个/mL，培养至48h取样进行细胞计数。

实验结果见表2。由表可看出，随着微载体用量的增加，培养48h的细胞密度逐渐增加，当微载体用量在2g/L～5g/L之间进行细胞培养时，细胞密度增加至最大值1.8×10⁶个/ml～2.7×10⁶个/ml，继续增加微载体的用量，细胞密度则出现下降趋势。因此，本发明确定在固定初始接种细胞密度为3×10⁵个/mL情况下，利用微载体Cytodex1和Cytodex3进行293TN细胞培养的优选用量为2g/L～5g/L。

表2.微载体用量对细胞生长的影响

实验例3.初始接种的细胞密度优化实验

以微载体Cytodex1进行293TN细胞培养，固定微载体用量为3g/L，细胞初始接种密度分别为1×10⁵个/mL，3×10⁵个/mL,5×10⁵个/mL,7×10⁵个/mL,1×10⁶个/mL,3×10⁶个/mL,5×10⁶个/mL，间隔24h取样进行细胞计数，并更换新鲜培养基继续培养，持续至72h。

实验结果见表3。由表可看出，当微载体含量相等，不同的接种细胞密度对293TN细胞生长影响较大。当以较低的细胞密度接种培养时，细胞密度的增长速度相对缓慢。随着接种密度的增加，细胞生长速度变得缓慢，需要较长培养时间才可达到对数期。此外，从表中数据还可知，细胞的接种密度与细胞的生长速度并不呈正相关关系。当以3×10⁵个/mL～1×10⁶个/mL接种培养时，细胞培养1天就达到对数生长期，所得的细胞密度可满足后续病毒包装的细胞用量，为降低细胞培养的成本，同时又不影响病毒包装效率。因此，本发明优选的细胞接种密度为3×10⁵个/mL～1×10⁶个/mL。

表3.微载体用量对细胞生长的影响

实验例4.WAVE反应器摇动条件的优化实验

WAVE反应器摇动条件，即摇动角度和摇动速度，一方面影响到细胞生长的溶氧，另一方面不同的摇动条件对细胞的剪切作用力大小不同，影响细胞的完整性并影响细胞的最终密度。实验以3g/L的含量加入微载体cytodex1，以3.5×10⁵个/mL密度接种293TN细胞，加入细胞DMEM培养基，装液量固定为50％(v/v)，摆动角度分别为8°，10°，12°，15°，16°；摆动速度分别为10rpm，12rpm，15rpm，18rpm，20rpm，间隔24h取样，更换新鲜培养基继续培养至72h，观察微载体上细胞吸附和生长情况并进行细胞计数，考察摇动条件对细胞培养的影响。

实验结果见表4。由表可知，整个培养过程中，摇动条件对细胞密度影响较大。从实验结果可看出，当摇动条件为摆动角度为8～14°，摆动速度是10～15rpm时，细胞生长状态良好，细胞密度成增加趋势，培养48h细胞的最终密度可达10⁶个/mL的数量级，基本可满足后续病毒包装的细胞用量。当转速继续增加时，细胞的终密度下降，培养液变得粘稠，原因可能是转速增加导致细胞破碎引起。因此，本发明优选的摇动条件为摆动角度8～14°，摆动速度是10～15rpm。

表4.摇动条件对细胞生长的影响

实验例5.WAVE反应器装液量的优化实验

WAVE反应器内培养基的装液体积一方面影响到细胞对营养物的需求，另一方面也影响到细胞生长所需的溶氧。实验以3g/L的含量加入微载体cytodex1，以3.5×10⁵个/mL密度接种293TN细胞，加入DMEM培养基，装液量为30％，40％，50％，60％，70％(v/v)，摆动角度分别为10°；摆动速度分别为12rpm，间隔24h取样，并更换新鲜培养基，继续培养至72h结束。观察微载体上细胞吸附和生长情况并进行细胞计数，考察摇动条装液量件对细胞培养的影响。

实验结果见表5。由表可知，在固定摇动条件、固定微载体用量和固定接种的细胞密度进行293TN细胞培养时，装液量对细胞生长的影响不是太显著。从实验结果可看出，当摇动条件为摆动角度为10°，摆动速度是12rpm，接种密度为3.5×10⁵个/mL时，随着装液量的增加，培养过程中细胞密度增加，但增加不显著。而当装液量40％～60％之间培养时，细胞培养48h即可获得10⁶个/mL数量级的细胞密度，可满足后续病毒包装的细胞用量，因此，本发明优化的培养基装液量为40％～60％。

表5.摇动条件对细胞生长的影响

实验例6.利用WAVE反应器在优先条件培养293TN细胞进行腺相关病毒中试化生产

根据以上各优化实验中细胞生长的结果，在优化条件下，WAVE反应器培养293TN细胞进行腺相关病毒中试化生产。WAVE反应器摆动角度为10°，摆动速度是12rpm，微载体用量为3g/L，接种的细胞密度为5×10⁵个/mL，装液量为50％的条件下，培养细胞至48h结束并计数。放出反应器内的培养液，保留细胞，依据所记录的细胞密度，加入新鲜DMEM培养基和适当比例的病毒包装三质粒系统，进行转染6～8h，转染结束后吸取培养基加入新鲜DMEM培养基，继续培养72h～120h，每间隔24h更换一次新鲜培养基；培养结束即完成病毒包装过程，收集上清液进行病毒粗提液的滴度测定。

病毒滴度测定利用Q-PCR仪进行，测定结果如表6所示。

表6不同批次WAVE反应器培养细胞生产出的不同血清型腺相关病毒物理滴度测定结果

批次	不同血清型的AAV	平均滴度(vg/ml)
			1	AAV8	1.06E+13
2	AAV8	1.32E+13
			3	AAV9	1.18E+13
4	AAV9	1.27E+13
			5	AAV9	1.30E+13
6	AAV9	1.04E+13
			7	AAV9	1.82E+13
8	AAV9	1.57E+13
			9	AAV1	7.14E+12
10	AAV1	1.03E+13
			11	AAV2	3.49E+12
12	AAV2	2.58E+12
			13	AAV5	1.81E+13

14

AAV5

1.01E+13

Claims (13)

1.一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列病毒包装细胞微载体培养实现重组腺相关病毒中试化生产的新技术，包括：（1）细胞培养：将293系列细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒包装：沉降微载体，加入新鲜细胞培养基、细胞转染试剂和病毒包装所用三质粒体系，进行共转染后继续培养细胞实现病毒包装；（3）病毒分离与纯化：细胞培养结束后，通过离心、抽滤或过滤的形式收集上清，利用AKTA蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化；（4）病毒滴度测定：利用荧光定量实时PCR仪检测病毒的基因组拷贝数来测定病毒滴度。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装细胞为293系列细胞。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微载体为Cyodex1和Cyodex3。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微载体在细胞培养袋中的含量为3～5g/L。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：培养袋中培养液的装液量为40%～60%（v/v）。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将细胞按照3×10⁵～1×10⁶个/mL的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的细胞培养条件为，WAVE反应器摆动角度是8～15°，摆动速度是10～15rpm。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装为采用细胞与三质粒共转染的方式，三质粒分别为辅助质粒Ⅰ，辅助质粒Ⅱ和重组质粒Ⅲ，且三者使用比例为1:3:1。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装为首先是细胞转染试剂与病毒包装三质粒系统的混合，细胞转染试剂与三质粒系统混合比例为20:1～30:1。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装为三质粒共转染细胞方式，所用转染方法为磷酸钙法，细胞与转染体系（细胞转染试剂与三质粒系统的混合液）的使用比例为4×10⁶个细胞：1ml转染体系。

11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病毒的分离纯化为使用AKTA蛋白核酸层析系统，适合的层析条件为填充料选用Qsphorase,流速为0.2ml/min～100ml/min，平衡上样缓冲体系为20mMol/LpH8.0的Tris-HCl，洗脱体系为内含终浓度为0.5Mol/LNaCl的20mMol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液。

12.由权利要求1-10任何一项所述方法可实现腺相关病毒的中试化生产。

13.权利要求11所述的中试化生产的重组腺相关病毒可用于基因治疗遗传缺陷性疾病包括乳腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤、先天性视神经疾病、遗传性心肌等疾病。