CN106754678A - 一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基及其制备方法。本发明适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶3‑5mg/L，辅酶Q10 0.2‑0.4μM，亚麻酸7‑9μM，血小板衍生生长因子1‑3μg/L，葫芦素B0.2‑0.6mg/L，硫辛酸0.12‑0.15mg/L，叶酸12‑15μM，羧甲基壳聚糖0.5‑1g/L，表皮生长因子8‑10μg/L，牛磺酸7‑10mg/L和贴壁材料22‑30μg/L。本发明提供的培养基安全性高，价格较低，能够显著提高牙髓干细胞的扩增速度。

Description

一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基及其制备方法。
背景技术
由于各种原因导致的牙体缺损和牙齿缺失，已成为危害口腔乃至人体健康的主要疾病，其发病率逐年增加。目前，主要是借助于各种牙科材料充填来应对牙齿缺损疾病，虽然在一定程度上能阻止病变的继续发展，但却不能解决根本问题。对于牙齿缺失尽管解决途径很多，但最有效和最根本的办法还是牙齿生物性再生。
随着组织再生医学的快速发展，为牙体缺损和牙齿缺失的有效治疗带来了希望。目前，已有许多研究利用牙源性上皮和牙源性间充质的相互作用，再生出了牙齿组织。常用的牙源性间充质包括牙乳头细胞和牙髓组织细胞。由于牙乳头细胞在临床上难以获得，因此，目前用于牙体及牙齿再生的种子细胞首选是牙髓组织来源的细胞，其中最重要的是牙髓干细胞。
中国专利申请CN106011053A公开了一种新型牙髓干细胞培养基，每1L牙髓干细胞培养基中由以下成分组成：100-150mL的胎牛血清、10-15mL的青链霉素双抗、1-5ngTGF-R，1-5mM L-谷氨酰胺，1640培养基余量。
中国专利申请CN104711219A公开了一种牙髓干细胞培养基，基础培养基为IMDM，1L培养基中含有SITE100*，抗坏血酸200-400mM，SITE为细胞生长必需的组份，抗坏血酸和纤连蛋白有助于牙髓干细胞形成细胞外基质，利于牙髓干细胞生长，含有PDGF1-10ug，氢化可的松1-10μg，EGF1-5ng，b-FGF1-5ng，PTH50-200ng，地塞米松1-20mM。
临床使用牙髓干细胞的前提是对牙髓干细胞进行大量的扩增，现有的扩增方法最常规的是使用添加10％胎牛血清的培养基，临床使用含动物源的培养基不仅会引起免疫排斥反应，异源病毒感染，而且采用这种培养基培养的牙髓干细胞，生长比较缓慢，在传代超过5次之后其分化功能细胞的潜能会大大降低。虽然已经研发出不含血清的牙髓干细胞培养基，但是价格昂贵。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基及其制备方法。本发明提供的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基成分明确且价格较低，不含有胎牛血清，不含任何动物来源成份，安全性高，能够显著提高牙髓细胞的扩增速度，且不影响牙髓干细胞的多向分化能力。
本发明的技术方案是：
一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶3-5mg/L，辅酶Q10 0.2-0.4μM，亚麻酸7-9μM，血小板衍生生长因子1-3μg/L，葫芦素B0.2-0.6mg/L，硫辛酸0.12-0.15mg/L，叶酸12-15μM，羧甲基壳聚糖0.5-1g/L，表皮生长因子8-10μg/L，牛磺酸7-10mg/L和贴壁材料22-30μg/L。
进一步地，所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶4mg/L，辅酶Q10 0.3μM，亚麻酸8μM，血小板衍生生长因子2μg/L，葫芦素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，叶酸13μM，羧甲基壳聚糖0.8g/L，表皮生长因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和贴壁材料27μg/L。
进一步地，所述基础培养基为MEM或M199培养基。
进一步地，所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比5-7∶9-12组成。
进一步地，所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比6∶11组成。
另外，本发明还提供了所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1向基础培养基中加入亚麻酸、血小板衍生生长因子、硫辛酸、叶酸、表皮生长因子、牛磺酸和贴壁材料，搅拌15-22分钟，加入葫芦素B和羧甲基壳聚糖，继续搅拌28-36分钟，静置2-4小时，加入过氧化氢酶和辅酶Q10，搅拌25分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9-7.2，用0.2-0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌18分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌32分钟。
优选地，所述步骤S1静置3小时。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.0。
优选地，所述步骤S2用0.24微米滤膜过滤除菌。
本发明适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括过氧化氢酶、辅酶Q10、亚麻酸、血小板衍生生长因和葫芦素B等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供牙髓干细胞的生存和最低的生理活动。在本发明中，过氧化氢酶能够清除自由基，保护牙髓干细胞免受超氧自由基损害等。在本发明中，辅酶Q10主要用作抗氧化剂和细胞代谢激活剂。在本发明中，亚麻酸能够提供细胞膜合成所需的脂质，并且与本发明中的其他原料协同作用，能够促进细胞增殖，提高细胞产率。在本发明中，血小板衍生生长因子和表皮生长因子主要作为维持牙髓细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子。在本发明中，硫辛酸与本发明所用其他原料协同作用，明显促进牙髓干细胞的增殖，另外，硫辛酸还起到抗氧化的作用。在本发明中，叶酸参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步合成DNA和RNA，并且还起到抗氧化的作用。在本发明中，牛磺酸能够促进牙髓干细胞的增殖，与本发明所用其他原料协同作用，能够显著提高牙髓干细胞的扩增效果。在本发明中，贴壁材料能够促进牙髓干细胞的粘附，及其贴壁生长。
研究发现，在培养基中加入羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖能够与其他成分间协同作用，提高牙髓干细胞的扩增速度，另外，在本发明培养基中羧甲基壳聚糖还作为稳定剂。在培养基中加入葫芦素B，能够进一步促进牙髓干细胞的生长增殖。本发明适用于牙髓干细胞体外培养的培养基中各成分协同作用，能够显著提高牙髓细胞的扩增速度，且不影响牙髓干细胞的多向分化能力。
与现有技术相比，本发明提供的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基安全性高，不含有胎牛血清，不含任何动物来源成份。
(2)本发明提供的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基成分明确且价格较低。
(3)本发明提供的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基能够显著提高牙髓细胞的扩增速度，且不影响牙髓干细胞的多向分化能力。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明所用羧甲基壳聚糖可购自浙江澳兴生物科技有限公司，MEM培养基可购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，M199培养基可购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。
实施例1、一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基
所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶3mg/L，辅酶Q10 0.2μM，亚麻酸7μM，血小板衍生生长因子1μg/L，葫芦素B0.2mg/L，硫辛酸0.12mg/L，叶酸12μM，羧甲基壳聚糖0.5g/L，表皮生长因子8μg/L，牛磺酸7mg/L和贴壁材料22μg/L。
所述基础培养基为MEM培养基。
所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比5∶12组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入亚麻酸、血小板衍生生长因子、硫辛酸、叶酸、表皮生长因子、牛磺酸和贴壁材料，搅拌15分钟，加入葫芦素B和羧甲基壳聚糖，继续搅拌28分钟，静置2小时，加入过氧化氢酶和辅酶Q10，搅拌25分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例2、一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基
所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶5mg/L，辅酶Q10 0.4μM，亚麻酸9μM，血小板衍生生长因子3μg/L，葫芦素B0.6mg/L，硫辛酸0.15mg/L，叶酸15μM，羧甲基壳聚糖1g/L，表皮生长因子10μg/L，牛磺酸10mg/L和贴壁材料30μg/L。
所述基础培养基为M199培养基。
所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比7∶9组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入亚麻酸、血小板衍生生长因子、硫辛酸、叶酸、表皮生长因子、牛磺酸和贴壁材料，搅拌22分钟，加入葫芦素B和羧甲基壳聚糖，继续搅拌36分钟，静置4小时，加入过氧化氢酶和辅酶Q10，搅拌25分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.2，用0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例3、一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基
所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶4mg/L，辅酶Q10 0.3μM，亚麻酸8μM，血小板衍生生长因子2μg/L，葫芦素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，叶酸13μM，羧甲基壳聚糖0.8g/L，表皮生长因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和贴壁材料27μg/L。
所述基础培养基为M199培养基。
所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比6∶11组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入亚麻酸、血小板衍生生长因子、硫辛酸、叶酸、表皮生长因子、牛磺酸和贴壁材料，搅拌18分钟，加入葫芦素B和羧甲基壳聚糖，继续搅拌32分钟，静置3小时，加入过氧化氢酶和辅酶Q10，搅拌25分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.0，用0.24微米滤膜过滤除菌，即得。
对比例1、一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基
所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶4mg/L，辅酶Q10 0.3μM，亚麻酸8μM，血小板衍生生长因子2μg/L，薯蓣皂苷元0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，叶酸13μM，羧甲基壳聚糖0.8g/L，表皮生长因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和贴壁材料27μg/L。
所述基础培养基为M199培养基。
所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比6：11组成。
与实施例3的区别在于，将葫芦素B替换为薯蓣皂苷元。
对比例2、一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基
所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶4mg/L，辅酶Q10 0.3μM，亚麻酸8μM，血小板衍生生长因子2μg/L，葫芦素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，叶酸13μM，羧甲基壳聚糖0.8g/L，表皮生长因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和贴壁材料27μg/L。
所述基础培养基为M199培养基。
所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比1∶1组成。
与实施例3的区别在于，所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比1∶1组成。
对比例3、一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基
所述适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶4mg/L，辅酶Q10 0.3μM，亚麻酸8μM，血小板衍生生长因子2μg/L，葫芦素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，叶酸13μM，水溶性壳聚糖0.8g/L，表皮生长因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和贴壁材料27μg/L。
所述基础培养基为M199培养基。
所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比6∶11组成。
与实施例3的区别在于，将羧甲基壳聚糖替换为水溶性壳聚糖。
试验例一、本发明适用于牙髓干细胞体外培养的培养基对牙髓干细胞培养效果
1、受试培养基：本发明实施例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，以及对比例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基。
2、培养干细胞来源：来源于牙髓的牙髓干细胞。
3、体外细胞培养实验
用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部1mm的牙髓组织；用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm3，置于50mL离心管中，加入13mL的组织消化液，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200rpm消化15min；加入等体积的培养基反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，2000rpm离心3min；利用PBS清洗1～2次，沉淀用培养基重悬，以5×103个/mL接种培养皿中，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每隔24小时，用血球计数板测一次细胞数量。
4、实验结果
用本发明实施例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，以及对比例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基对牙髓干细胞进行培养，培养开始时以及培养1天、2天、3天、4天和5天的细胞数量如表1所示。
表1：不同培养基对牙髓干细胞培养后细胞数量
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基中牙髓干细胞的细胞数量，明显大于生长在对比例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基中牙髓干细胞的细胞数量。这说明，本发明适用于牙髓干细胞体外培养的培养基可以明显促进牙髓干细胞的增殖，本发明适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的扩增效果好。
试验例二、对增殖后的牙髓干细胞体外分化为成骨细胞，成软骨细胞，成脂肪细胞的潜能分析影响实验
1、受试培养基：本发明实施例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，以及对比例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基。
2、培养干细胞来源：来源于牙髓的牙髓干细胞。
3、体外细胞分化实验
将细胞传代扩增至P10代，使用LONZA的成脂，成骨，成软骨检测试剂盒对P10代牙髓干细胞进行分化检测。
4、实验结果
检测结果表明，经本发明实施例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基培养过的牙髓干细胞分化成脂肪细胞，成软骨细胞，成骨细胞的比率在85％以上。而经对比例1-3所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基培养过的牙髓干细胞分化成脂肪细胞，成软骨细胞，成骨细胞的比率在65％。因此，本发明所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基可以有效的保持牙髓干细胞的多向分化能力。

Claims (10)

1.一种适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶3-5mg/L，辅酶Q10 0.2-0.4μM，亚麻酸7-9μM，血小板衍生生长因子1-3μg/L，葫芦素B0.2-0.6mg/L，硫辛酸0.12-0.15mg/L，叶酸12-15μM，羧甲基壳聚糖0.5-1g/L，表皮生长因子8-10μg/L，牛磺酸7-10mg/L和贴壁材料22-30μg/L。
2.如权利要求1所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：过氧化氢酶4mg/L，辅酶Q10 0.3μM，亚麻酸8μM，血小板衍生生长因子2μg/L，葫芦素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，叶酸13μM，羧甲基壳聚糖0.8g/L，表皮生长因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和贴壁材料27μg/L。
3.如权利要求1或2所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，其特征在于，所述基础培养基为MEM或M199培养基。
4.如权利要求1或2所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，其特征在于，所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比5-7∶9-12组成。
5.如权利要求4所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基，其特征在于，所述贴壁材料由玻表粘连蛋白和纤粘连蛋白按重量比6∶11组成。
6.如权利要求1-5任一所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1向基础培养基中加入亚麻酸、血小板衍生生长因子、硫辛酸、叶酸、表皮生长因子、牛磺酸和贴壁材料，搅拌15-22分钟，加入葫芦素B和羧甲基壳聚糖，继续搅拌28-36分钟，静置2-4小时，加入过氧化氢酶和辅酶Q10，搅拌25分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9-7.2，用0.2-0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
7.如权利要求6所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1搅拌18分钟。
8.如权利要求6所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1继续搅拌32分钟。
9.如权利要求6所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1静置3小时。
10.如权利要求6所述的适用于牙髓干细胞体外培养的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.0。
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