CN114561345B - 可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法。本发明主要是在间充质干细胞的体外大规模扩增过程中加入牛磺酸，同时密切观察细胞的融合率以控制细胞密度，抑制细胞在大规模培养过程中形成大量细胞外基质，避免细胞成模或者细胞团块，从而提高间充质干细胞在动物中应用的安全性，适用于细胞工厂培养向临床转化应用。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，广泛存在于脐带、骨髓、牙髓、脂肪或胎盘组织中，具有易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点。
细胞工厂培养技术在国外已有三十多年的应用历史，近十来年在中国开始逐渐普及。细胞工厂(Cell Factory)是一种设计精巧的细胞培养装置，在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间，无需进行任何厂房改造即可实现扩大产能的目的。可用于间充质干细胞的规模化培养，特别适合于贴壁细胞，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，使扩大培养变得简单易行，低污染风险，节省空间，能有效的保证操作的无菌性，最大限度降低批间差异，实现操作规程化，从而大大地减低劳动强度和密集度，实现大规模的细胞培养。
牛磺酸的化学结构式为H2N-CH2-CH2-SO3H，化学名称为β-氨基乙磺酸或2-氨基乙磺酸，相对分子质量为125.15，单斜棱形棒状白色晶体，熔点305.11℃，无毒、无臭、味微酸、对热稳定。
目前间充质干细胞的培养多采用胎牛血清加基础培养液，有部分采用无血清培养基进行培养，但是间充质干细胞在培养过程中在局部密度过高，从而出现细胞粘连，粘连的细胞注射入体内容易引起栓塞，降低了间充质干细胞的安全性，严重阻碍了间充质干细胞的临床转化。
目前在行业中一般采用过筛的方式除去粘连的细胞，但此类操作会浪费大量的细胞，不利于细胞产业的发展。
发明内容
针对现有间充质干细胞在细胞工厂中培养密度一高就容易出现细胞成模和团块的情况，本申请提出一种能够减少或者避免细胞粘连及团块形成的方法，从而建立一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法。
本发明的目的是提供一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，在间充质干细胞大规模培养过程中，向培养液中添加牛磺酸。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，所述间充质干细胞为P1-P5代细胞。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，每代间充质干细胞的培养时间为3天。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，培养液中牛磺酸的添加浓度为10mmol/L-20mmol/L。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，P1-P3代间充质干细胞培养时，培养液中牛磺酸的添加浓度为10mmol/L。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，P4-P5代间充质干细胞培养时，培养液中牛磺酸的添加浓度为20mmol/L。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，还包括在细胞大规模培养过程中观察细胞融合度的步骤。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，细胞融合度为80-85％。
优选的，上述可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，间充质干细胞大规模培养所用培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明主要是在间充质干细胞的体外大规模扩增过程中加入牛磺酸，同时密切观察细胞的融合率以控制细胞密度，抑制细胞在大规模培养过程中形成大量细胞外基质，避免细胞成模或者细胞团块，从而提高间充质干细胞在动物中应用的安全性。这种方法，简单经济，易于产业化操作，适用于细胞工厂培养易于向临床转化应用。
2、本发明通过在细胞大规模扩增的P1-P5代间充质干细胞的培养过程中的培养液中添加牛磺酸，提高细胞的干性及减少细胞分泌细胞外基质的量，从而减少细胞粘连。
3、本发明通过在细胞大规模扩增的P1-P5代间充质干细胞的培养过程中观察细胞的融合率，控制合理的细胞密度，避免细胞成模，避免细胞团块的产生。
附图说明
图1为正常组的间充质干细胞的形态学照片；
图2为处理组的间充质干细胞的形态学照片；
图3为正常组的间充质干细胞的悬浮状态照片；
图4为处理组的间充质干细胞的悬浮状态照片。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。下述所有实验所有的细胞培养均在10层细胞工厂中进行扩增培养。
实施例1(处理组)
一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1，采用37℃水浴锅，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；
本步骤所述细胞培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液(gibco)，细胞培养液中含牛磺酸浓度为20mmol/L；
S2，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；本步骤所用细胞培养液参照S1；
S3，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；本步骤所用细胞培养液参照S1；
S4，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；本步骤所用细胞培养液参照S1；
S5，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，观察细胞形态，结果参照图2。
实施例2
一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1，采用37℃水浴锅，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；
本步骤所述细胞培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液，细胞培养液中含牛磺酸浓度为10mmol/L；
S2，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，观察细胞形态。
实施例3
一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1，采用37℃水浴锅，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；
本步骤所述细胞培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液，细胞培养液中含牛磺酸浓度为10mmol/L；
S2，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；本步骤所用细胞培养液参照S1；
S3，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；本步骤所用细胞培养液参照S1；
S4，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；
本步骤所用细胞培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液，细胞培养液中含牛磺酸浓度为20mmol/L；
S5，培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；培养3天后待细胞生长至融合度达到85％时，消化细胞，观察细胞形态。
本步骤所用细胞培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液，细胞培养液中含牛磺酸浓度为20mmol/L。
实验例(正常组)
一种可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，与实施例1的操作基本相同，区别在于，所述细胞培养液为含有体积分数10％胎牛血清的a-MEM培养液，不添加牛磺酸。
比较实施例1与实验例的细胞形态，结果参见图1-4，如图1，正常组的细胞成长梭形，贴壁生长，符合间充质干细胞的基本形态；如图2，处理组的细胞成长梭形，贴壁生长，符合间充质干细胞的基本形态。消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞，如图3图所示，正常组的细胞悬浮状态呈圆形分散状态，偶有细胞团块存在，如图4图所示，处理组的细胞悬浮状态呈圆形分散状态，镜下无明显团块存在。
采用流式检测法进行细胞的鉴定，结果如表1，处理前后的间充质干细胞表面分子检测结果均符合国际细胞治疗协会的要求，CD73，CD90，CD105均高于95％(比例)，CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR的均低于2％，说明处理后支持细胞的表面分子表达。
上述结果显示，本发明的方法可以克服间充质干细胞培养过程中的粘连、团块等问题，提高其临床应用安全性。
表1细胞表面分子检测结果
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (4)
1.可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，在间充质干细胞大规模培养过程中，向细胞培养液中添加牛磺酸；
大规模培养间充质干细胞的方法为：
S1，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；所述细胞培养液为含有体积分数10%胎牛血清的a-MEM培养液，细胞培养液中牛磺酸的添加浓度为10mmol/L-20 mmol/L；
S2，在细胞大规模培养过程中观察细胞融合度，当细胞融合度为80-85%时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，然后加入所述细胞培养液，摇匀后置于细胞培养箱中培养；
S3，重复S2，获得P3-P5代间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，每代间充质干细胞的培养时间为3天。
3.根据权利要求1所述的可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，P1-P3代间充质干细胞培养时，细胞培养液中牛磺酸的添加浓度为10 mmol/L。
4.根据权利要求1所述的可提高大规模培养安全性的间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，P4-P5代间充质干细胞培养时，细胞培养液中牛磺酸的添加浓度为20mmol/L。
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