CN107365739B - 一种哺乳动物胚胎细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种哺乳动物胚胎细胞的培养方法，其在培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且将培养分为两个阶段，两个阶段的培养时间及其培养基配方不同。本发明的培养方法适用于多种哺乳动物的胚胎细胞培养，且均具有较高的卵裂率、融合率和囊胚率。本发明的培养方法得到的胚胎，进行直接移植后，出生率高。

Description

一种哺乳动物胚胎细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种哺乳动物胚胎细胞的培养方法。
背景技术
随着胚胎工程技术的发展，胚胎培养液的研究变得日益重要。目前，在动物胚胎培养中，已有的合成培养液(如TCM199或mTCM199)中含有高浓度的葡萄糖，其对于早期胚胎具有一定的毒性。因此，许多研究者采用添加血清、氨基酸、生长因子的方式对培养液进行改良。
在小鼠胚胎培养方面，较为成熟的是KSOM培养液，其获得了相对较高的囊胚形成率和卵裂球数。
不过，人们发现，单一的培养液并不能获得令人十分满意的效果。因此，针对体外培养胚胎在不同发育阶段对不同物质需求和代谢的不同而分阶段进行培养，成为一个研究热点。对此，Gardner在其论文“Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluidand their effects on embryo development and metabolism in vitro”和“Cultureand transfer of human blastocysts increases implantation rates and reducesthe need for multiple embryo transfers”进行过有益的尝试。
中国专利CN 103333855 A也在这个方向进行了研究，其通过在培养液中加入孕期子宫胎液，并进行三个阶段的培养，获得了较好的羊胚胎培养效果。不过，该方法依赖于孕期子宫胎液的提取，这在控制成本上是不利的，而且子宫胎液在提取过程中受多种因素干扰，难以保证获得的子宫胎液品质的稳定性。
然而，从目前的研究来看，已有的胚胎培养液及其培养方法的适用范围是及其有限的。通过对CN 103333855 A中的培养方法进行研究，其在其它哺乳动物(如狗和牛)的胚胎细胞的培养上的效果较差。可能的原因在于，虽然孕期子宫胎液的加入在一定程度上提高了培养效果，但培养液中的其它物质才是决定最终培养效果的关键，而针对于不同的胚胎细胞而言，所需的培养液成分的差异可能是巨大的。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种哺乳动物胚胎细胞的培养方法，其在培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5～6小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4～0.6份、乳酸钠3.0～3.3份、磷酸二氢钾0.10～0.12份、碳酸氢钠1.9～2.2份、透明质酸糖胺多糖3.2～3.3份、柠檬酸钙0.8～0.9份、IGFⅡ0.1～0.2份、牛磺酸0.3～0.9份、二水氯化钙0.2～0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.0～3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4～0.6份、乳酸钠3.0～3.3份、磷酸二氢钾0.10～0.12份、碳酸氢钠1.9～2.2份、丙氨酰谷氨酰胺1.9～2.5份、丙酮酸0.1～0.3份、EGF 0.1～0.2份、胰岛素0.01～0.05份，牛磺酸0.3～0.9份、二水氯化钙0.2～0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为牛、羊、狗中的一种。
优选的，第一培养基的配方，按重量份计为：葡萄糖0.5份、乳酸钠3.2份、磷酸二氢钾0.11份、碳酸氢钠2.0份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.6份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
优选的，第二培养基的配方，按重量份计为：葡萄糖0.5份、乳酸钠3.1份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠2.0份、丙氨酰谷氨酰胺2.2份、丙酮酸0.2份、EGF 0.2份、胰岛素0.03份，牛磺酸0.8份、二水氯化钙0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
优选的，第一阶段的培养时间为5.5小时，第二阶段的培养时间为3.5小时。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明的培养方法适用于多种哺乳动物的胚胎细胞培养，且均具有较高的卵裂率、融合率和囊胚率；
2、本发明的培养方法得到的胚胎，进行移植至子宫后，出生率高。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
所述方法在培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养6小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4份、乳酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.10份、碳酸氢钠2.2份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.1份、牛磺酸0.9份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.6份、乳酸钠3.0份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠1.9份、丙氨酰谷氨酰胺1.9份、丙酮酸0.1份、EGF 0.2份、胰岛素0.05份，牛磺酸0.3份、二水氯化钙～0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为羊。
实施例2
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.6份、乳酸钠3.0份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠1.9份、透明质酸糖胺多糖3.2份、柠檬酸钙0.9份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.3份、二水氯化钙0.2份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.0小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4份、乳酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.10份、碳酸氢钠2.2份、丙氨酰谷氨酰胺2.5份、丙酮酸0.3份、EGF 0.1份、胰岛素0.01份，牛磺酸0.9份、二水氯化钙0.2份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为羊。
实施例3
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5.5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.5份、乳酸钠3.2份、磷酸二氢钾0.11份、碳酸氢钠2.0份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.6份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.5份、乳酸钠3.1份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠2.0份、丙氨酰谷氨酰胺2.2份、丙酮酸0.2份、EGF 0.2份、胰岛素0.03份，牛磺酸0.8份、二水氯化钙0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为羊。
实施例4
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
所述方法在培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养6小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4份、乳酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.10份、碳酸氢钠2.2份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.1份、牛磺酸0.9份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.6份、乳酸钠3.0份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠1.9份、丙氨酰谷氨酰胺1.9份、丙酮酸0.1份、EGF 0.2份、胰岛素0.05份，牛磺酸0.3份、二水氯化钙～0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为狗。
实施例5
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.6份、乳酸钠3.0份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠1.9份、透明质酸糖胺多糖3.2份、柠檬酸钙0.9份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.3份、二水氯化钙0.2份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.0小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4份、乳酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.10份、碳酸氢钠2.2份、丙氨酰谷氨酰胺2.5份、丙酮酸0.3份、EGF 0.1份、胰岛素0.01份，牛磺酸0.9份、二水氯化钙0.2份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为狗。
实施例6
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5.5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.5份、乳酸钠3.2份、磷酸二氢钾0.11份、碳酸氢钠2.0份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.6份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.5份、乳酸钠3.1份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠2.0份、丙氨酰谷氨酰胺2.2份、丙酮酸0.2份、EGF 0.2份、胰岛素0.03份，牛磺酸0.8份、二水氯化钙0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为狗。
实施例7
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
所述方法在培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养6小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4份、乳酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.10份、碳酸氢钠2.2份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.1份、牛磺酸0.9份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.6份、乳酸钠3.0份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠1.9份、丙氨酰谷氨酰胺1.9份、丙酮酸0.1份、EGF 0.2份、胰岛素0.05份，牛磺酸0.3份、二水氯化钙～0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为牛。
实施例8
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.6份、乳酸钠3.0份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠1.9份、透明质酸糖胺多糖3.2份、柠檬酸钙0.9份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.3份、二水氯化钙0.2份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.0小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4份、乳酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.10份、碳酸氢钠2.2份、丙氨酰谷氨酰胺2.5份、丙酮酸0.3份、EGF 0.1份、胰岛素0.01份，牛磺酸0.9份、二水氯化钙0.2份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为牛。
实施例9
对哺乳动物胚胎细胞进行培养：
培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5.5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.5份、乳酸钠3.2份、磷酸二氢钾0.11份、碳酸氢钠2.0份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGFⅡ0.2份、牛磺酸0.6份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.5份、乳酸钠3.1份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠2.0份、丙氨酰谷氨酰胺2.2份、丙酮酸0.2份、EGF 0.2份、胰岛素0.03份，牛磺酸0.8份、二水氯化钙0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为牛。
实验例1
对实施例1～9进行培养效果实验，实验的内容包括如下方面：体外培养的融合率、卵裂率、体内暂培养的囊胚率、体内暂培养的出生率和将培养后的胚胎直接移植至哺乳动物各自的子宫之后的出生率。实验中，涉及到的重构胚数均为300，每组实验的次数为6次。
在实验过程中，用利用M199培养液进行常规培养的方法作为对照组，记为“对照M199”。在对于牛胚胎细胞和狗胚胎细胞培养时，利用CN 103333855 A中的处理组1作为另一个对照，记为“对照2”。
实验的结果如表1所示：
表1
Figure GDA0002861373750000131
Figure GDA0002861373750000141

Claims (3)

1.一种哺乳动物胚胎细胞的培养方法，其特征在于，所述方法在培养时，不加入哺乳动物自身的孕期子宫胎液，且培养分为两个阶段，第一阶段为：
将哺乳动物胚胎细胞置于第一培养基中进行培养5.5小时；第一培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4～0.6份、乳酸钠3.0～3.3份、磷酸二氢钾0.10～0.12份、碳酸氢钠1.9～2.2份、透明质酸糖胺多糖3.2～3.3份、柠檬酸钙0.8～0.9份、IGF Ⅱ0.1～0.2份、牛磺酸0.3～0.9份、二水氯化钙0.2～0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份；
第二阶段为：
第一阶段结束后，移除第一培养基，转至第二培养基中培养3.5小时；第二培养基的配方，按重量份计为：
葡萄糖0.4～0.6份、乳酸钠3.0～3.3份、磷酸二氢钾0.10～0.12份、碳酸氢钠1.9～2.2份、丙氨酰谷氨酰胺1.9～2.5份、丙酮酸0.1～0.3份、EGF 0.1～0.2份、胰岛素0.01～0.05份，牛磺酸0.3～0.9份、二水氯化钙0.2～0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
所述哺乳动物为牛、羊、狗中的一种。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第一培养基的配方，按重量份计为：葡萄糖0.5份、乳酸钠3.2份、磷酸二氢钾0.11份、碳酸氢钠2.0份、透明质酸糖胺多糖3.3份、柠檬酸钙0.8份、IGF Ⅱ0.2份、牛磺酸0.6份、二水氯化钙0.3份；
所述第一培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，第二培养基的配方，按重量份计为：葡萄糖0.5份、乳酸钠3.1份、磷酸二氢钾0.12份、碳酸氢钠2.0份、丙氨酰谷氨酰胺2.2份、丙酮酸0.2份、EGF 0.2份、胰岛素0.03份，牛磺酸0.8份、二水氯化钙0.3份；
所述第二培养基在配制时，除上述成分外，加入水将重量份补足至100份。
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