RU2818068C1

RU2818068C1 - Способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

Info

Publication number: RU2818068C1
Application number: RU2023127549A
Authority: RU
Inventors: Михаил Васильевич Светлик; Татьяна Александровна Томова; Марина Вячеславовна Мошкина; Василий Александрович Хоменко; Светлана Владимировна Бородина
Filing date: 2023-10-26
Publication date: 2024-04-23

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Предложен способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, включающий транспортировку яичников коров с бойни в физиологическом растворе, содержащем гепарин, гентамицин и бычий сывороточный альбумин, извлечение ооцитов из яичников при помощи аспиратора с сосудом-ловушкой FTA-2i с иглой 18 G в среду ЭКО1 «Аспирационная», содержащую антибиотики и феноловый красный, затем ооцит-кумулюсные комплексы промывают в среде ЭКО1 "Универсальная", содержащей антибиотики и феноловый красный, и культивируют в среде ЭКО1 "Универсальная" 21-24 ч в инкубаторе при 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом. Криоконсервированную сперму оттаивают в воде при 37°C, затем проводят градиентное фракционирование эякулята с использованием готовых растворов «Перселект» 90% и «Перселект» 45%. Сокультивирование созревших ооцитов и сперматозоидов проводят в четырехлуночных планшетах в среде ЭКО1 «Универсальная» в течение 16-20 ч в инкубаторе при 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом; оплодотворенные яйцеклетки культивируют в среде ЭКО ПРО "Дробление", содержащей антибиотики и феноловый красный без покрытия маслом; на стадии 4-8 бластомеров для последующего культивирования эмбрионы переносят в среду ЭКО ПРО "Бластная", содержащую антибиотики и феноловый красный без покрытия маслом, и инкубируют при 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом до стадии бластоцисты. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro вне организма животного в условиях непрофильной лаборатории, не требующих приготовления рабочих растворов для каждого этапа культивирования, для научно-исследовательских целей и племенного животноводства. 1 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарии, животноводства, биотехнологии, в частности к способу получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, и может быть использовано для культивирования ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота вне организма животного в условиях непрофильной лаборатории, что в свою очередь способствует получению эмбрионов крупного рогатого скота в условиях лабораторного и образовательного пространства для развития, как научно-исследовательских целей, так и племенного животноводства.

Известен способ повышения доли выхода ооцитов овец, достигших метафазы II, оплодотворенных ооцитов, достигших эмбрионального развития до стадии морулы/бластоцисты in vitro (Патент на изобретение RU 2525714 C1, 20.08.2014. МПК A01K 67/02, A61D 19/04. Способ получения эмбрионов овец in vitro. Заявка № 2013121616/10 от 07.05.2013). Технический результат изобретения достигается с помощью способа получения эмбрионов овец in vitro, включающего извлечение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников, культивирование их до стадии метафазы II, совместное культивирование ооцитов и сперматозоидов, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, причем в него дополнительно вводят фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, эстрадиол, гепарин, кофеин и антибиотик, а культивирование проводят на базовой среде, при этом извлечение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников получают от живых овец под наркозом путем пунктирования фолликулов яичников при проведении лапаротомии, причем предварительно производят стимуляцию суперовуляции, получают ооцит-кумулюсные комплексы, а в среду созревания добавляют фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон в виде комбинированного препарата рекомбинантных человеческих гипофизарных гормонов Менопур, причем концентрация обоих компонентов составляет 0,075 МЕ/мл, а эстрадиол добавляют в среду созревания в концентрации 10 мкг/мл, при этом для оплодотворения используют свежеполученную сперму баранов, для капацитации спермиев барана в состав среды оплодотворения добавляют комбинацию гепарина в количестве 5 ЕД/мл и кофеина в количестве 0,2 мг/мл, а культивирование и оплодотворение осуществляют в четырехлуночных чашках Петри в 500 мкл питательной среды под 200 мкл парафинового масла. Технический результат достигается с помощью способа, в котором в качестве антибиотика используют гентамицин. В способе используется один базовый раствор для основы всех питательных сред, в который добавляют раствор глюкозы, раствор пирувата, раствор гидрокарбоната, раствор лактата, раствор глютамина, сыворотку плода коровы, бычий сывороточный альбумин, незаменимые аминокислоты, заменимые аминокислоты, гепарин, кофеин, деионизированную воду, фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны, эстрадиол и соляную кислоту.

Недостатками способа является использование одной основы для всех питательных сред, применения добавок и предварительное приготовление рабочих растворов для каждого этапа культивирования, а также трудоемкость, связанная с извлечением ооцит-кумулюсных комплексов из яичников живых овец под наркозом путем пунктирования фолликулов яичников при проведении лапаротомии на фоне предварительной стимуляции суперовуляции.

Известен также способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium. / T. Oyamada, H. Iwayama, Y. Fukui. // Zygote. - 2004. - V.12, №02. - P.143-150), включающий использование одной основы для всех питательных сред = SOF, состоящей из 117,7 мМоль NaCl, 7,16 мМоль KCl, 1,19 мМоль KH2PO4 , 0,49 мМоль MgCl2 , 0,33 мМоль пирувата натрия, 0,75 мг/мл канамицина сульфата, причем яичники забирают на бойне, помещают в физиологический раствор и транспортируют при 20°C в лабораторию в течение 1 дня. Фолликулы диаметром 2-8 мм пунктируют шприцем на 5 мл с иглой 18 G. Ооцит-кумулюсные комплексы промывают в среде SOF с добавлением HEPES и помещают для созревания по 5-6 штук в капли среды объемом 50 мкл или 1 в каплю объемом 10 мкл. Среда созревания состоит из SOF с добавлением 0,02 ЕД/мл свиного гипофизарного фолликулостимулирующего гормона и 1 мг/мл эстрадиола. Культивируют в течение 22-24 часов при 39°C, 5% СО₂, 95% влажности. Для оплодотворения используют оттаянную сперму быка, которую выдерживают в среде SOF без глюкозы с добавлением поливинилалкоголя (1 мг/мл), HEPES, 20 мкМоль пеницилламина, 10 мкМоль гипотаурина, 2 мкМоль эпинефрина в течение 1 часа, после чего 3 раза центрифугируют и промывают. Для оплодотворения ооциты по 5-6 штук помещают в капли среды объемом 46 мкл с добавлением 4 мкл суспензии спермиев (конечная концентрация 1000000 в мл) или 1 в каплю объемом 8 мкл с 2 мкл суспензии спермиев под парафиновым маслом. Среда оплодотворения готовится на основе SOF без глюкозы с добавлением поливинилалкоголя (1 мг/мл), хлорида кальция 1,71 мМоль, 1% раствора незаменимых аминокислот, 5 ЕД/мл гепарина, 20 мкМоль пеницилламина, 10 мкМоль гипотаурина, 2 мкМоль эпинефрина. Инкубируют в течение 22-24 часов при температуре 39°C в атмосфере 5% CO₂ и 95% влажности. После оплодотворения зиготы инкубируют в каплях среды, состоящей из SOF с добавлением 1 мг/мл поливинилалкоголя, 1,5 мМоль глюкозы, 1 мМоль глютамина, 1,71 мМоль хлорида кальция, 2% заменимых и 1% незаменимых аминокислот, 0,34 мМоль цитрата натрия, 2,77 мМоль миоинозитола, 100 мг/мл аскорбиновой кислоты. Инкубируют в течение 8 суток при температуре 39°C в атмосфере 5% CO₂ , 5% O2 и 95% влажности.

Недостатками способа является использование одной основы для всех питательных сред - SOF, применения добавок и предварительное приготовление рабочих растворов для каждого этапа культивирования, а также то, что питательная среда - SOF является импортной (Германия). Использование в данном способе неестественных метаболитов HEPES и поливинилалкоголь может снижать выживаемость бластоцист. Так же, фолликулы пунктируют шприцем на 5 мл с иглой 18 G, что увеличивает время аспирации яичников и повышает трудоемкость.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ обеспечения созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота (A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. / A.P. Gandhi, M. Lane, D.K. Gardner, R.L. Krisher. // Human Reproduction. - 2000. - Vol.15, №2. - P.395-401), включающий использование одной основы для всех питательных сред - SOF, состоящей из 99,7 мМоль NaCl, 7,16 мМоль KCl, 1,19 мМоль KH₂PO₄, 0,49 мМоль MgCl₂*6H₂O, 3,3 ммоль/л натриевой соли молочной кислоты, 25,07 ммоль/л гидрокарбоната натрия, 1,71 ммоль/л хлорида кальция, причем яичники забирают на бойне, помещают в физиологический раствор и транспортируют при температуре 27-31°C в лабораторию. Фолликулы пунктируют вакуумной системой с иглой 18 G. Ооцит-кумулюсные комплексы промывают в среде SOF с добавлением HEPES и помещают для созревания по 10 штук в капли среды объемом 50 мкл или 1 в каплю объемом 10 мкл. Среда созревания состоит из SOF с добавлением 0,33 мМоль пирувата натрия, 1,5 мМоль глюкозы, 1,0 мМоль глютамина, по 1% заменимых и незаменимых аминокислот, 10% сыворотки плода коровы, 0,01 ЕД/мл бычьего гипофизарного фолликулостимулирующего гормона, 0,01 ЕД/мл бычьего гипофизарного лютеинизирующего гормона, 50 нг/мл эпидермального фактора роста, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина. Культивируют в течение 22-24 часов при температуре 38,7°C, 5% CO₂, 95% влажности. Для оплодотворения используют оттаянную сперму быка, которую выдерживают в среде SOF без глюкозы с HEPES, лактатом натрия, 0,33 мМоль пирувата натрия, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа, после чего 3 раза центрифугируют и промывают. Для оплодотворения ооциты помещают в капли среды объемом 44 мкл с добавлением суспензии спермиев (конечная концентрация 1000000 в мл) под парафиновым маслом. Среду оплодотворения готовят на основе SOF без глюкозы с добавлением 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1,0 мМоль пирувата, 2% раствора незаменимых аминокислот, 2 мкг/мл гепарина, 20 мкМоль пеницилламина, 10 мкМоль гипотаурина, 2 мкМоль эпинефрина. Инкубируют в течение 22-24 часов при температуре 38,7°C в атмосфере 5% CO₂. После оплодотворения зиготы инкубируют по 10 штук в каплях среды 50 мкл под парафиновым маслом, состоящей из SOF с 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, добавлением 1,5 мМоль глюкозы, 1 мМоль глютамина, 1% заменимых и 1% незаменимых аминокислот, 0,1 мМоль ЭДТА, 0,1 мМоль таурина. Инкубируют в течение 3 суток при температуре 38,7°C в атмосфере 5% CO₂. На 4 сутки эмбрионы переносят в среду с 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, содержание глюкозы 3,0 мМоль, 1,0 мМоль глютамина, 1% заменимых и 1% незаменимых аминокислот, 1% витаминов и инкубируют еще 96 часов. Данный способ выбран в качестве прототипа.

Недостатками прототипа является использование одной основы для всех питательных сред - SOF, применения добавок и предварительное приготовление рабочих растворов для каждого этапа культивирования, а также то, что питательная среда - SOF является импортной (Германия). Использование минерального масла при культивировании ооцитов также является нежелательным, так как оно адсорбирует стероидные гормоны, секретируемые клетками кумулюса, и в некоторых условиях могут выделять токсины, понижая качество яйцеклеток (Shimada M., Kawano N., Terada T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 2002. 124: 557-564).

Технической задачей заявляемого изобретения является разработка способа получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, который предусматривает получение эмбрионов, достигших эмбрионального развития до стадии бластоцисты, в условиях непрофильной лаборатории, характеризующегося большей доступностью для непрофильных лабораторий и снижением экономических затрат.

Технический результат изобретения заключается в создании условий для получения ооцит-кумулюсных комплексов при аспирации яичников забитого крупного рогатого скота, создании условий для повышения качества яйцеклеток и получения эмбрионов крупного рогатого скота, достигших эмбрионального развития до стадии бластоцисты in vitro, исключении этапов приготовления рабочих растворов.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, включающий транспортировку яичников коров с бойни в физиологическом растворе, извлечение ооцитов из яичников с получением ооцит-кумулюсных комплексов, культивирование ооцитов, оттаивание криоконсервированной спермы и выделение сперматозоидов из эякулята методом градиентного фракционирования, оплодотворение ооцитов, сокультивирование созревших ооцитов и сперматозоидов, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, отличающийся тем, что в 500 мл физиологического раствора добавляют 0,5 мл гепарина, 0,2 мл гентамицина и 90 мг бычьего сывороточного альбумина, транспортировку осуществляют при температуре 25-35°C в течение не более 3 часов, ооцит-кумулюсные комплексы получают с помощью аспиратора с сосудом-ловушкой FTA-2i и содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО1 «Аспирационная», ооцит-кумулюсные комплексы промывают в 2 каплях по 50 мкл каждая содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО1 "Универсальная", помещают в каплю 600 мкл среды ЭКО1 "Универсальная" и культивируют ооциты в течение 21-24 часов в инкубаторе при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом, криоконсервированную сперму оттаивают в течение 30 секунд в воде температурой 37°C, градиентное фракционирование спермы проводят с использованием готовых растворов «Перселект» 90% и «Перселект» 45%, проводят сокультивирование созревших ооцитов и сперматозоидов в четырехлуночных планшетах содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО1 «Универсальная» объемом 600 мкл в течение 16-20 часов в инкубаторе при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом, оплодотворенные яйцеклетки культивируют в капле 600 мкл содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО ПРО "Дробление" без покрытия маслом и на стадии 4-8 бластомеров для последующего культивирования эмбрионы переносят в каплю 600 мкл содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО ПРО "Бластная" без покрытия маслом и инкубируют при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом до стадии бластоцисты.

Пример осуществления способа получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

Яичники коров после убоя транспортировали в течение не более 3 часов в лабораторию в термосе при температуре 25-35°C в 500 мл стерильного физиологического раствора, в который добавляли 0,5 мл гепарина, 0,2 мл гентамицина и 90 мг бычьего сывороточного альбумина. В лаборатории яичники освобождали от близлежащих тканей, промывали в растворе фурацилина и помещали в чашку Петри, где ооцит-кумулюсные комплексы получали путем аспирации фолликулов, используя аспиратор с сосудом ловушкой FTA-2i с иглой 18 G и среду ЭКО1 «Аспирационная». Использование аспиратора позволило значительно ускорить процесс аспирации и сократить время пребывания ооцит-кумулюсных комплексов в аспирационной среде на воздухе при содержании кислорода 21%, который способствует окислению и уменьшению рН раствора, что пагубно влияет на ооцит-кумулюсные комплексы. Основой среды ЭКО1 «Аспирационная» является вода очищенная, соли Эрла, глюкоза. Среда ЭКО1 «Аспирационная» стабилизирована HEPES, содержит гепарин, антибиотики, краситель феноловый красный и не содержит альбумин. Полученные ооцит-кумулюсные комплексы промывали в 2х каплях среды (по 50 мкл каждая капля) ЭКО1 "Универсальная". Затем ооцит-кумулюсные комплексы помещали для созревания в четырехлуночные планшеты в капли среды ЭКО1 "Универсальная" объемом 600 мкл без покрытия маслом, исключая фактор - масло, понижающий качество яйцеклеток и инкубировали в течение 21-24 часов в инкубаторе при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности. Использовали инкубатор с системой FPI-сенсора и контролем RD4 (Binder GmbH) и по рекомендации производителя в инкубатор устанавливали контейнер с водой из расчета объема инкубатора (воды в контейнере 2,5 л), инструментальный контроль влажности не проводили. Температурный и газовый диапазоны были подобраны методом градиентного спуска, соответственно, основываясь на температуре тела коровы, которая колеблется в пределах 37,5-39,5°C и на замещении кислорода углекислым газом при использовании подачи СО₂ вместо рекомендуемых СО₂+N₂. Среда ЭКО1 "Универсальная" приготовлена на основе бикарбонатного буфера. В состав среды входит вода очищенная, соли Эрла, глюкоза, лактат, пируват, аминокислоты, человеческий сывороточный альбумин, с добавлением антибиотиков и красителя фенолового красного.

Для оплодотворения использовали криоконсервированную сперму быка: соломинку со спермой объемом 0,25 мкл оттаивали в течение 30 секунд в воде при 37°C и затем отмывали с использованием двуступенчатого градиента. Последовательно аккуратно в пробирку наслаивали 0,25 мкл среды «Перселект» 90%, 0,25 мкл «Перселект» 45% и 0,25 мкл спермы, что соответствовало соотношению 1:1:1. Градиент центрифугировали при ускорении 1500 об/мин в течение 20 минут при комнатной температуре. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 2 мл среды ЭКО1 «Спермопреп» или в ЭКО1 «Универсальная» и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Процедуру отмывки повторяли. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в соответствующем объеме среды ЭКО1 «Спермопреп» или в ЭКО1 «Универсальная». Готовая к применению среда «Перселект» представляет собой смесь коллоидных кремниевых частиц с силановым покрытием на основе Percoll PLUS, содержит соли, аминокислоты, углеводы, антибиотик - гентамицина сульфат, альбумин человека. ЭКО1 «Спермопреп». В состав среды ЭКО1 «Спермопреп» входит вода очищенная, соли Эрла, глюкоза, лактат, пируват, приготовлена на основе бикарбонатного буфера, она стабилизирована HEPES, в состав входит человеческий сывороточный альбумин, добавлены антибиотики и феноловый красный.

Созревшие ооциты помещали в четырехлуночные планшеты в капли среды ЭКО1 «Универсальная» объемом 600 мкл с добавлением спермиев без покрытия маслом и инкубировали в течение 16-20 часов при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂6,2-6,8% и неконтролируемой влажности.

На стадии 2х бластомеров эмбрионы помещали в каплю 600 мкл среды ЭКО ПРО "Дробление" без покрытия маслом и на стадии 4-8 бластомеров для последующего культивирования эмбрионы переносили в ЭКО ПРО "Бластная" (600 мкл) без покрытия маслом и инкубировали в течение 16-20 часов при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂6,2-6,8% и неконтролируемой влажности до стадии бластоцисты (7-8 день от момента оплодотворения) (таблица 1). Среда ЭКО ПРО «Дробление» приготовлена на основе бикарбонатного буфера, входит вода очищенная, минеральные соли, углеводы, аминокислоты, витамины, человеческий сывороточный альбумин, антибиотики и феноловый красный. Среда ЭКО ПРО "Бластная" приготовлена на основе бикарбонатного буфера, в состав среды входит вода очищенная, минеральные соли, углеводы, аминокислоты, витамины, человеческий сывороточный альбумин, антибиотики и феноловый красный.

Таблица 1 - Результаты аспирации, оплодотворения созревших ооцитов и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro
Общее количество полученных ОКК	Достигло стадии 2-4 клеток	Достигло стадии морулы (5день)	Достигло стадии бластоцисты (7-8 день)
138	23	10	7

В процессе получения эмбрионов in vitro огромную роль играют культуральные среды. Надежность культуральных сред, снижение риска загрязнения патогенами и стандартизацию растворов обеспечивают приготовление этих сред в условиях производства. Все среды, используемые сегодня в технологии получения эмбрионов животных это среды зарубежных производителей (Германия, Британия, Бразилия и т.п.), в России нет производств культуральных сред для животных. Единственное предприятие в России по производству культуральных сред это Научно-производственного предприятие "ПанЭко", которое производит культуральные среды для получения эмбрионов in vitro для человека и имеет регистрационное удостоверение на медицинское изделие. Таким образом, технический результат достигается тем, что применяют готовые к использованию культуральные среды Научно-производственного предприятия "ПанЭко" (Россия), содержащих человеческий сывороточный альбумин, не требующие приготовления рабочих растворов для каждого этапа культивирования, которые проводят в инкубаторе без покрытия маслом, при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂6,2-6,8% и неконтролируемой влажности.

Список использованных источников

1. Патент на изобретение RU 2525714 C1, 20.08.2014. МПК A01K 67/02, A61D 19/04. Способ получения эмбрионов овец in vitro. Заявка № 2013121616/10 от 07.05.2013

2. Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium. / T. Oyamada, H. Iwayama, Y. Fukui. // Zygote. - 2004. - V.12, №02. - P.143-150.

3. A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. / A.P. Gandhi, M. Lane, D.K. Gardner, R.L. Krisher. // Human Reproduction. - 2000. - Vol.15, №2. - P.395-401.

4. Shimada M., Kawano N., Terada T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 2002. 124: 557-564.

Claims

Способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, включающий транспортировку яичников коров с бойни в физиологическом растворе, извлечение ооцитов из яичников при помощи иглы 18 G с получением ооцит-кумулюсных комплексов, промывание ооцит-кумулюсных комплексов, культивирование ооцитов, оттаивание криоконсервированной спермы и выделение сперматозоидов из эякулята методом градиентного фракционирования, оплодотворение ооцитов, сокультивирование созревших ооцитов и сперматозоидов, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, отличающийся тем, что в 500 мл физиологического раствора добавляют 0,5 мл гепарина, 0,2 мл гентамицина и 90 мг бычьего сывороточного альбумина, транспортировку осуществляют при температуре 25-35°C в течение не более 3 ч, ооцит-кумулюсные комплексы получают с помощью аспиратора с сосудом-ловушкой FTA-2i и содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО1 «Аспирационная», ооцит-кумулюсные комплексы промывают в 2 каплях по 50 мкл каждая содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО1 "Универсальная", помещают в каплю 600 мкл среды ЭКО1 "Универсальная" и культивируют ооциты в течение 21-24 ч в инкубаторе при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом, криоконсервированную сперму оттаивают в течение 30 с в воде температурой 37°C, градиентное фракционирование эякулята проводят с использованием готовых растворов «Перселект» 90% и «Перселект» 45%, проводят сокультивирование созревших ооцитов и сперматозоидов в четырехлуночных планшетах содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО1 «Универсальная» объемом 600 мкл в течение 16-20 ч в инкубаторе при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом, оплодотворенные яйцеклетки культивируют в капле 600 мкл содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО ПРО "Дробление" без покрытия маслом, и на стадии 4-8 бластомеров для последующего культивирования эмбрионы переносят в каплю 600 мкл содержащей антибиотики и феноловый красный среды ЭКО ПРО "Бластная" без покрытия маслом и инкубируют при температуре 38,6-38,9°C, содержании СО₂ 6,2-6,8% и неконтролируемой влажности без покрытия маслом до стадии бластоцисты.