CN116103226B - 一种胚胎体外培养液及其在提高胚胎耐热性方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胚胎体外培养液及其在提高胚胎耐热性方面的应用，属于细胞培养技术、胚胎工程与发育生物学领域。其技术方案包括以常规培养液为基质，还包括橄榄苦苷和丹酚酸B；所述常规培养液选自CZB培养液或人工合成输卵管液；所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为50‑100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为100‑300μg/mL。本发明应用于胚胎体外培养方面，解决当温度升高时，使用传统的培养液培养胚胎，其发育率以及囊胚孵出率均会随温度升高而降低的缺陷，可有效提高胚胎耐热性。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术、胚胎工程与发育生物学领域，尤其涉及一种胚胎体外培养液及其在提高胚胎耐热性方面的应用。
背景技术
随着全球变暖，温度升高，高温对人类和动物的影响越发明显，夏季高温以及某些热性(使体温升高的)疾病，都会使动物产生热应激，导致孕畜胚胎死亡，使其繁殖力降低，甚至是不孕，给畜牧业生产造成很大损失。传统的培养液是模拟胚胎在输卵管发育时的离子环境配制的，在温度适宜的条件下进行胚胎体外培养，效果良好。但热应激条件下，用传统的培养液培养胚胎，其发育率会随着培养温度升高而显著降低，因为当温度升高时，培养液中的某些成分会发生变化，可能会影响胚胎的生长；另外，当培养的温度升高时，胚胎本身代谢会发生变化、对营养的需求也会增加，因此，传统的培养液不能满足高温时胚胎良好的发育。
胚胎正常的培养温度为：牛胚胎38-39℃、小鼠胚胎37℃。在正常培养温度下牛胚胎发育至囊胚的百分率是16.88±5.41，孵出率是4.32±3.48；小鼠胚胎发育至囊胚的百分率是81.35±1.07，孵出率是61.88±0.72。目前，提高小鼠胚胎耐热性的培养液有TCZB，其优点是可以提高小鼠早期胚胎在41℃热应激条件下的发育率，用TCZB培养的胚胎，其囊胚发育率及孵出率(81.3±4.5和76.5±7.6)显著高于CZB组(80.2±5.4和73.4±6.2)，提高小鼠胚胎的热耐受性。
然而，TCZB并不能提高39℃培养小鼠胚胎发育至囊胚率及囊胚孵出率，此外，TCZB培养液需要利用原核表达法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体—Tat-Hsp70，此法技术要求高，操作复杂，且不易成功。
发明内容
针对现有技术存在的不足之处，本发明所要解决的技术问题是克服当温度升高时，使用传统的培养液培养胚胎，其发育率以及囊胚孵出率均会随温度升高而降低的缺陷，提出一种可有效提高胚胎耐热性的胚胎体外培养液及其在提高胚胎耐热性方面的应用。
为解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明一方面提供一种胚胎体外培养液，用于胚胎体外培养，以常规培养液为基质，还包括橄榄苦苷和丹酚酸B；所述常规培养液选自CZB培养液或人工合成输卵管液；所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为50-100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为100-300μg/mL。
优选的，所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为300μg/mL。
优选的，所述胚胎体外培养液通过提高胚胎的抗氧化水平来提高胚胎的耐热性。
优选的，所述胚胎为小鼠胚胎或牛胚胎；当所述胚胎为小鼠胚胎时，所述常规培养液选自CZB培养液；当所述胚胎为牛胚胎时，所述常规培养液选自人工合成输卵管液。
优选的，所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取的胚胎；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得。
本发明另一方面还提供上述任一技术方案所述的胚胎体外培养液在提高胚胎耐热性方面的应用。
优选的，所述胚胎体外培养液通过提高胚胎的抗氧化水平来提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，从而提高胚胎的耐热性。
优选的，采用所述胚胎体外培养液对所述胚胎进行体外培养时，所述橄榄苦苷和所述丹酚酸B通过促进胚胎产生更多的SOD且减少MDA来提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，从而提高胚胎的耐热性。
优选的，当所述胚胎为小鼠胚胎时，包括以下步骤：
以CZB培养液为基础培养液，向基础培养液中添加橄榄苦苷和丹酚酸B，得到小鼠胚胎体外培养液，将上述小鼠胚胎体外培养液在培养皿中做60μl/滴的培养微滴，覆盖矿物油后置39℃含有5％CO2饱和湿度的培养箱平衡4h以上；获取小鼠胚胎，除去胚胎周围颗粒细胞后放入培养微滴中，在39℃含5％CO2的CO2培养箱中培养，在胚胎发育至4细胞时移入含有1％葡萄糖的培养液中，每24h换液一次，直至胚胎发育至囊胚期。
优选的，当所述胚胎为牛胚胎时，包括以下步骤：
以SOF培养液为基础培养液，向基础培养液中添加橄榄苦苷和丹酚酸B，得到牛胚胎体外培养液，于培养前2h，在培养皿中，用上述牛胚胎体外培养液做成60μL的培养微滴，覆盖矿物油后置41℃含有5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中平衡，将体外受精获得的早期牛胚胎移入含有200μL培养液的1.5mL离心管中，震荡45s，去除颗粒细胞，再用牛胚胎体外培养液充分洗涤，之后进行培养，向每个培养微滴中移入25个早期胚胎，将培养皿置于41℃含5％CO2的CO2培养箱中培养，每隔48h半量更换牛胚胎体外培养液。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供一种胚胎体外培养液，该胚胎体外培养液中添加的橄榄苦苷和丹酚酸B发挥协同作用，通过提高胚胎的抗氧化水平来大幅度提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，具有经济成本低、配制方法简单方便的特点。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的小鼠囊胚氧化损伤指标变化图；
图2为本发明实施例所提供的另一小鼠囊胚氧化损伤指标变化图；
图3为本发明实施例所提供的牛囊胚氧化损伤指标变化图；
图4为本发明实施例所提供的另一牛囊胚氧化损伤指标变化图。
具体实施方式
下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行详细、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明总的技术方案的部分具体实施方式，而非全部的实施方式。基于本发明的总的构思，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都落于本发明保护的范围。
本发明一方面提供一种胚胎体外培养液，用于胚胎体外培养，以常规培养液为基质，还包括橄榄苦苷和丹酚酸B；所述常规培养液选自CZB培养液或人工合成输卵管液；所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为50-100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为100-300μg/mL。在一优选实施例中，所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为300μg/mL。所述胚胎体外培养液通过提高胚胎的抗氧化水平来提高胚胎的耐热性。需要说明的是，橄榄苦苷(oleuropein)是从天然橄榄油或橄榄叶中提取分离出来的一种裂环烯醚萜苷类苯酚化合物，具有多种药理活性(如抗氧化、降血糖、降血压、降脂、抗炎、抗骨质疏松、抗乳腺癌、抗前列腺癌、抗甲状腺癌等作用)。中国专利CN106046078A、CN109021042A、CN107652333A、CN109021041A等公开了橄榄苦苷的提取、纯化方法；中国专利CN 107028963A、CN101247816A、CN109731006A等公开了橄榄苦苷用作药物的用途，但到目前为止，尚未见有关橄榄苦苷用于家畜繁殖技术领域，特别是用于提高胚胎体外培养耐热性的的报道。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是从丹参的根茎中提取出来的一种水溶性成分—丹酚酸类物质中活性最强、含量最高的成分，具有多种药理作用(抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制细胞凋亡)，其抗氧化能力优于丹参素，丹酚酸B具有调节细胞氧化应激，改善组织细胞损伤作用，其中，中国专利CN107652333A、CN109810082A、CN108530406A公开了丹酚酸B的提取、纯化及制备方法，中国专利CN102716111A、CN108142524A、CN101496798A、CN1408353A、CN104546821A、CN1872043A、CN102961372A、CN1768738A、CN101530409A公开了丹酚酸B用作药物的用途，但到目前为止尚未见有关丹酚酸用于提高胚胎体外培养耐热性的报道。本发明提供的胚胎体外培养液，并在培养液中添加的橄榄苦苷和丹酚酸B，两者发挥协同作用，通过提高胚胎的抗氧化水平来大幅度提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，具有经济成本低、配制方法简单方便的特点，另外，其不但可以提高高温条件下体外培养胚胎的发育率，而且可以为生产中预防因热应激造成的妊娠动物早期胚胎死亡提供思路。橄榄苦苷和丹酚酸B能够降低MDA含量并增加SOD活性，在抗氧化方面具有协同作用，大大提高了单独用其中一种组分所产生的耐热效果。
在一优选实施例中，所述胚胎为小鼠胚胎或牛胚胎；当所述胚胎为小鼠胚胎时，所述常规培养液选自CZB培养液；当所述胚胎为牛胚胎时，所述常规培养液选自人工合成输卵管液；所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取的胚胎；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得。
本发明另一方面还提供上述任一技术方案所述的胚胎体外培养液在提高胚胎耐热性方面的应用。具体的，所述胚胎体外培养液通过提高胚胎的抗氧化水平来提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，从而提高胚胎的耐热性。进一步的，采用所述胚胎体外培养液对所述胚胎进行体外培养时，所述橄榄苦苷和所述丹酚酸B通过促进胚胎产生更多的SOD且减少MDA来提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，从而提高胚胎的耐热性。
在一优选实施例中，当所述胚胎为小鼠胚胎时，包括以下步骤：
以CZB培养液为基础培养液，向基础培养液中添加橄榄苦苷和丹酚酸B，得到小鼠胚胎体外培养液，将上述小鼠胚胎体外培养液在培养皿中做60μl/滴的培养微滴，覆盖矿物油后置39℃含有5％CO2饱和湿度的培养箱平衡4h以上；获取小鼠胚胎，除去胚胎周围颗粒细胞后放入培养微滴中，在39℃含5％CO2的CO2培养箱中培养，在胚胎发育至4细胞时移入含有1％葡萄糖的培养液中，每24h换液一次，直至胚胎发育至囊胚期。
在一优选实施例中，当所述胚胎为牛胚胎时，包括以下步骤：
以SOF培养液为基础培养液，向基础培养液中添加橄榄苦苷和丹酚酸B，得到牛胚胎体外培养液，于培养前2h，在培养皿中，用上述牛胚胎体外培养液做成60μL的培养微滴，覆盖矿物油后置41℃含有5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中平衡，将体外受精获得的早期牛胚胎移入含有200μL培养液的1.5mL离心管中，震荡45s，去除颗粒细胞，再用牛胚胎体外培养液充分洗涤，之后进行培养，向每个培养微滴中移入25个早期胚胎，将培养皿置于41℃含5％CO2的CO2培养箱中培养，每隔48h半量更换牛胚胎体外培养液。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的胚胎体外培养液及其在提高胚胎耐热性方面的应用，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
(1)制备含橄榄苦苷和丹酚酸B的小鼠胚胎体外培养液：首先制备常规CZB培养液，量取要制备培养液终体积90％的超纯水，加到灭菌烧杯中，准确称量表1中各种成分，加入到含超纯水的烧杯中，每加入一种成分后都用磁力搅拌器搅动、摇匀，直至完全溶解，再加入下一种物质。每加完一种成分后立即将烧杯口盖严，以减少液体与空气接触时间，避免使配制溶液的PH值升高。加BSA时，将BSA放在培养液表面，使其缓慢、逐渐混合，避免摇晃培养液，防止产生气泡，使蛋白质变性。待BSA完全溶解后定容，测PH值。其次准确称取橄榄苦苷50、100、150mg，先用10mL的常规CZB培养液溶解，取1ml该溶液再加入常规CZB培养液至100ml，然后向培养液中加入的10、30、50g的丹酚酸B，轻微搅拌均匀。0.22μm滤器过滤除菌，分装后在4℃下保存备用，长时间不用需保存在-20℃条件下。
表1小鼠胚胎常规CZB培养液组成成分
(2)培养微滴的制作：于培养前24h，在60mm培养皿中，用上述含橄榄苦苷和丹酚酸B的培养液做成60μL的培养微滴，覆盖矿物油后置39℃含5％CO2的CO2培养箱中平衡。
(3)小鼠胚胎培养：用人工注射激素方法使小鼠超数排卵，首先腹腔注射PMSG(10IU/只)，48h后注射相同剂量的hCG，然后合笼，第二天检查阴栓。见栓小鼠当天晚上杀死，用眼科剪和眼科镊迅速剖开小鼠腹腔，找到其子宫及卵巢。用镊子挑起子宫及卵巢，剔除周围的系膜与脂肪，在靠近卵巢部位的子宫体处剪断，放入预先准备好的Hepes-CZB液滴中。在体视显微镜下找到输卵管壶腹部，用1ml注射器针头挑破管壶腹部输卵管，可见胚胎成团或单个跑出。如胚胎带有颗粒细胞，则首先把胚胎用吸胚管转移至透明质酸酶中消化，消化后再放Hepes-CZB液滴中清洗4-5次。将已平衡好的胚胎培养液平皿取出，把清洗好的胚胎用吸胚管转移至胚胎培养液中，每个培养滴放置约25枚胚胎。将培养皿置于39℃含5％CO2饱和湿度CO2培养箱中培养，在胚胎发育至4细胞时移入含有葡萄糖的培养液中，每24h换液一次，记录每一阶段胚胎发育率，直至胚胎发育至囊胚期，结果如表2所示。对最有效浓度的培养基组囊胚使用南京建成微量丙二酸测定试剂盒在酶标仪上进行测定MDA及总超氧化物歧化酶试剂盒使用分光光度计上进行测定SOD，结果如图1、2所示。
(4)结果
与常规CZB培养液相比，在39℃热应激条件下，用本发明添加100μg/mL橄榄苦苷和300mg/ml丹酚酸B培养液培养的胚胎2细胞、4细胞、桑椹胚、早期囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚发育率分别为100％、95.7％、92.9％、88.6％、78.5％和68.5％。该新发明的培养液相比常规胚胎培养液和其他剂量培养液，其体外胚胎的桑葚胚、囊胚和孵化囊胚都有显著地提高。试验结果显示，衡量氧化损伤的脂质过氧化最终产物MDA相对于常规培养液组含量降低，而作为胚胎中具有代表性的抗氧化酶之一的SOD相对于常规培养液组含量升高，这说明，本发明培养液能够通过提高小鼠胚胎抗氧化水平来提高胚胎耐热性。
表2 39℃小鼠胚胎发育情况
以上，1组采用常规培养液，2组培养液中含有50μg/mL橄榄苦苷和100mg/ml丹酚酸B，3组培养液中含有100μg/mL橄榄苦苷和300mg/ml丹酚酸B，4组培养液中含有150μg/mL橄榄苦苷和500mg/ml丹酚酸B，5组培养液中含有100μg/mL橄榄苦苷，6组培养液中含有300mg/ml丹酚酸B；
T％是指小鼠胚胎培养至2细胞时期的存活率，F％是指小鼠胚胎培养至4细胞时期的存活率，M％是指小鼠胚胎培养至桑椹胚时期的存活率，B％是指小鼠胚胎培养至早期囊胚时期的存活率，XB％是指小鼠胚胎培养至扩张囊胚时期的存活率，HB％是指小鼠胚胎培养至孵化囊胚时期的存活率。
实施例2
(1)制备含橄榄苦苷和丹酚酸B的牛胚胎体外培养液：准确称取橄榄苦苷50、100、150mg，先用10mL的常规SOF培养液溶解，取1ml该溶液再加入常规SOF培养液至100ml，然后向培养液中加入10、30、50g的丹酚酸B，轻微搅拌均匀。0.22μm滤器过滤除菌，在4℃下储存，备用。
(2)培养微滴的制作：于培养前2h，根据受精卵数量的多少，在60mm培养皿中，用上述含黄芩苷和谷氨酰胺的胚胎体外培养液做成60μL的培养微滴，覆盖矿物油后置41℃含5％ CO2的CO2培养箱中平衡。
(3)奶牛卵母细胞的培养及体外受精
所述牛卵母细胞体外培养方法如下：从屠宰场获取奶牛卵巢，用手术刀刺破卵巢的卵泡，以此获取奶牛卵母细胞，用成熟培养液在38.5℃、5％CO2的环境内培养18h，获得成熟的牛卵母细胞。所述成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有100IU/mL的青链霉素及体积百分含量15％的血清，所述常规培养液为DMEM。牛卵母细胞体外受精方法如下：将牛卵母细胞培养成熟后，与精子一同放入受精培养液中，在38.5℃含5％CO2的CO2培养箱中培养18h，使精卵结合(受精)，以此获得牛早期胚胎。所述受精培养液为含10mg/mL肝素的BO液。
(4)奶牛胚胎培养
受精结束后，将受精卵移入含有200μL培养液的1.5mL离心管中，震荡40s，以去除颗粒细胞，受精卵用含有橄榄苦苷和丹酚酸B的胚胎培养液充分洗涤3次后进行培养，将受精卵移入已平衡2h以上，且覆盖矿物油的60μL胚胎培养微滴中进行培养，每个微滴中移入25枚胚胎，将培养皿置于40℃、41℃、42℃含5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，每隔48h半量更换培养液。受精后48h统计卵裂率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养至8d，定期观察早期胚胎发育情况、囊胚率和孵化囊胚率，结果如表3所示。对最有效浓度的培养基组囊胚使用南京建成微量丙二酸测定试剂盒在酶标仪上进行测定MDA及总超氧化物歧化酶试剂盒使用分光光度计上进行测定SOD，结果如图3、4所示。
(5)结果
与常规SOF培养液相比，在41℃热应激条件下，用本发明培养液添加100μg/mL橄榄苦苷和300mg/ml丹酚酸B培养的胚胎卵裂率、桑椹胚、和孵化囊胚发育率分别为81.3％、67.5％、21.3％、7.5％。该新发明的培养液相比常规胚胎培养液和低高剂量培养液，其体外胚胎的桑葚胚、囊胚和孵化囊胚率都有显著地提高。试验结果显示，衡量氧化损伤的脂质过氧化最终产物MDA相对于常规培养液组含量降低，而作为胚胎中具有代表性的抗氧化酶之一的SOD相对于常规培养液组含量升高，这说明，本发明培养液能够通过提高牛胚胎抗氧化水平来提高胚胎耐热性。
表3在温度为41℃条件下不同培养液培养的牛早期胚胎不同时期的发育率
常规牛胚胎培养液及小鼠培养液组成如表4、5所示。
表4牛胚胎常规培养液组成成分
| 成分 | mg/100ml |
| NaCl | 629 |
| KCl | 53 |
| CaCl2·2H2O | 25 |
| MgCl2·6H2O | 10 |
| KH2PO4 | 16 |
| NaHCO3 | 211 |
| 乳酸钠 | 60ul |
| 丙删酸钠 | 3.6 |
| 葡萄糖 | 2.7 |
| phenol red | 0.02ml |
| PVA | 1mg/ml |
表5小鼠胚胎常规培养液组成成分
Claims (9)
1.一种胚胎体外培养液，用于胚胎体外培养，以常规培养液为基质，其特征在于，还包括橄榄苦苷和丹酚酸B；所述常规培养液选自CZB培养液或人工合成输卵管液；所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为50-100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为100-300μg/mL；
所述胚胎为小鼠胚胎或牛胚胎；当所述胚胎为小鼠胚胎时，所述常规培养液选自CZB培养液；当所述胚胎为牛胚胎时，所述常规培养液选自人工合成输卵管液。
2.根据权利要求1所述的胚胎体外培养液，其特征在于，所述基质中的所述橄榄苦苷的含量为100μg/mL；所述基质中的所述丹酚酸B的含量为300μg/mL。
3.根据权利要求1所述的胚胎体外培养液，其特征在于，所述胚胎体外培养液通过提高胚胎的抗氧化水平来提高胚胎的耐热性。
4.根据权利要求3所述的胚胎体外培养液，其特征在于，所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取的胚胎；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得。
5.权利要求1-4任一项所述的胚胎体外培养液在制备提高胚胎耐热性产品中的应用，所述胚胎为小鼠胚胎或牛胚胎。
6.根据权利要求5所述的胚胎体外培养液在制备提高胚胎耐热性产品中的应用，其特征在于，所述胚胎体外培养液通过提高胚胎的抗氧化水平来提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，从而提高胚胎的耐热性。
7.根据权利要求6所述的胚胎体外培养液在制备提高胚胎耐热性产品中的应用，其特征在于，采用所述胚胎体外培养液对所述胚胎进行体外培养时，所述橄榄苦苷和所述丹酚酸B通过提高胚胎内SOD活性且减少MDA含量来提升胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率，从而提高胚胎的耐热性。
8.根据权利要求5所述的胚胎体外培养液在制备提高胚胎耐热性产品中的应用，其特征在于，当所述胚胎为小鼠胚胎时，包括以下步骤：
以CZB培养液为基础培养液，向基础培养液中添加橄榄苦苷和丹酚酸B，得到小鼠胚胎体外培养液，将上述小鼠胚胎体外培养液在培养皿中做60μl/滴的培养微滴，覆盖矿物油后置39℃含有5%CO2饱和湿度的培养箱平衡4 h以上；获取小鼠胚胎，除去胚胎周围颗粒细胞后放入培养微滴中，在39℃含5%CO2的CO2培养箱中培养，在胚胎发育至4细胞时移入含有1%葡萄糖的培养液中，每24 h换液一次，直至胚胎发育至囊胚期。
9.根据权利要求5所述的胚胎体外培养液在制备提高胚胎耐热性产品中的应用，其特征在于，当所述胚胎为牛胚胎时，包括以下步骤：
以SOF培养液为基础培养液，向基础培养液中添加橄榄苦苷和丹酚酸B，得到牛胚胎体外培养液，于培养前2 h，在培养皿中，用上述牛胚胎体外培养液做成60 μL的培养微滴，覆盖矿物油后置41℃含有5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中平衡，将体外受精获得的早期牛胚胎移入含有200 μL培养液的1.5 mL离心管中，震荡45 s，去除颗粒细胞，再用牛胚胎体外培养液充分洗涤，之后进行培养，向每个培养微滴中移入25个早期胚胎，将培养皿置于41℃含5%CO2的CO2培养箱中培养，每隔48 h半量更换牛胚胎体外培养液。
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