CN111034712A - 一种大熊猫乳汁保存方法 - Google Patents

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刘玉良
蔡志刚
安俊辉
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张皓
陈敏
李媛
何平
张瑛
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    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time

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Abstract

本发明公开了一种大熊猫乳汁保存方法，是将大熊猫乳汁在‑80℃放置24h，然后放入液氮中保存。本发明提供的保存方法，可以长期保存大熊猫乳汁，而且经过分析，使用本发明的方法保存的大熊猫乳汁，可以有效地提高大熊猫乳汁内的细胞活率，比常规储存方式更加有利于大熊猫幼仔的健康生长和发育。

Description

一种大熊猫乳汁保存方法
技术领域
本发明涉及一种动物乳汁的保存方法，具体涉及大熊猫乳汁的保存方法。
背景技术
大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)为我国特有的珍稀动物，提高大熊猫繁殖与育幼成功率一直是圈养大熊猫保护工作的重点，也是研究的难点。大熊猫幼仔均为早产出生，其后期发育完全依赖于母乳喂养，大熊猫幼仔的母乳喂养，对于大熊猫幼仔的成活率、健康成长都有着非常重要的作用。由于大熊猫母乳成分复杂多样，生物学功能较多，不仅为幼仔的生长发育提供营养物质还具有免疫保护功能。之前已有一些研究对圈养大熊猫母乳中的部分营养成分进行了分析，但是关于大熊猫乳汁中细胞成分的研究尚未见报道。而且目前很难通过配方奶替代大熊猫母乳。
大熊猫会有较大的概率生产双胞胎，但其产后泌乳量难以满足2仔的快速生长发育需要，多数母兽只能养好1仔，个别母兽甚至1仔也不喂养，这种情况需要进行人工辅助育幼。因此，现实中经常需要保存部分大熊猫乳汁，以备不时之需。而如何保存大熊猫乳汁尽可能维持乳汁品质对于人工育幼至关重要。
目前，常规的乳汁保存方法包括冷藏和冷冻保存，但是常规的这些保存方法在保存大熊猫乳汁时存在一些问题。比如4℃冷藏保存，虽然可以较好的保存乳汁的主要营养，但是保存时间短，一般仅能保存约3天，适合短期保存；而直接冷冻保存，比如-20℃、-80℃或-196℃冷冻，可以保存较长时间，但是这种保存仅能够保存乳汁中的营养成分，而乳汁中的细胞活率则不具有优势。
而经过研究表明，在母乳喂养期间，来源于母乳的免疫细胞群可进入到婴儿肠道，通过肠黏膜吸收作用进入血液循环，进而到达机体不同的组织器官。通过母乳喂养，母体可将HBSC(human breast stem cell，即：人乳腺干细胞)及其携带的所有遗传物质和相关成分传递给婴儿并促进其早期发育，这种现象称为微嵌合。母胎微嵌合是微嵌合中最早发现的一种，它是指母体与胎儿在子宫中通过胎盘进行干细胞交换，交换的干细胞可在后代体内存活数年。胎儿时期的细胞交换可以增强婴儿的免疫耐受性，母乳喂养过程中，婴儿每天可从母乳中获得数千到数百万个HBSC。
研究发现HBSC不仅可以分化成表达β-III标记的微管蛋白和Nestin标记的神经元细胞，还可以分化成表达s100b标记的神经胶质样细胞。神经元构成神经结构与功能的基本单位，承担了神经系统的功能活动。神经胶质细胞则起辅助作用，并能产生神经营养因子，运输营养物质及排除代谢产物，还可以修复再生损伤组织、参与血脑屏障的形成，在免疫应答中也起到作用。由此HBSC可促进神经系统发育、稳定及再生，从而促进婴儿大脑发育，提高学习及记忆能力。
可以看出，乳汁中的细胞对于幼儿的健康生长有着重要的作用。在发明人前期对大熊猫乳汁的研究中，已经成功分离并培养出乳汁细胞。而目前尚没有关于母乳冷冻保存对乳汁中细胞影响的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既能够保存大熊猫乳汁中的营养成分，又能够提高大熊猫乳汁中的细胞活率，同时还能够长期保存的大熊猫乳汁的保存方法。
本发明具体是这样实现的：
一种大熊猫乳汁保存方法，是将大熊猫乳汁在-80℃放置24h，然后放入液氮中保存。
其中，大熊猫乳汁在冷冻前，先装入冻存管内，然后将冻存管放置在处于室温的程序降温盒中。
更进一步的方案是：
所述程序降温盒的降温速率为-1℃/min。
更进一步的方案是：
将大熊猫乳汁在-80℃放置24h后，取出程序降温盒后立刻放入液氮中保存。
更进一步的方案是：
将大熊猫乳汁0.5-2ml，加入到2ml的冻存管内。
更进一步的方案是：
所述程序降温盒内装入至少一根冻存管，具体冻存管数量根据实际大熊猫乳汁的量、以及每批大熊猫乳汁的保存时间确定。
本发明提供的保存方法，可以长期保存大熊猫乳汁，而且经过分析，使用本发明的方法保存的大熊猫乳汁，可以有效地提高大熊猫乳汁内的细胞活率，比常规储存方式更加有利于大熊猫幼仔的健康生长和发育。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种大熊猫乳汁保存方法，分别取0.5ml的大熊猫乳汁，分别装入2ml规格的冻存管内，然后将冻存管放置在处于室温的程序降温盒中，然后将大熊猫乳汁在-80℃放置24h，取出程序降温盒后立刻放入液氮中保存。
其中，所用的程序降温盒为
Figure BDA0002331547160000031
LX冷冻盒，其降温速率为-1℃/min。
实施例2
一种大熊猫乳汁保存方法，分别取1ml的大熊猫乳汁，分别装入2ml规格的冻存管内，然后将冻存管放置在处于室温的程序降温盒中，然后将大熊猫乳汁在-80℃放置24h，取出程序降温盒后立刻放入液氮中保存。其中，所用的程序降温盒为
Figure BDA0002331547160000032
LX冷冻盒，其降温速率为-1℃/min。
对比例1
取大熊猫乳汁0.5mL装入2mL体积的冻存管中，直接将冻存管快速投入液氮中保存。
对比例2
取大熊猫乳汁1mL装入2mL体积的冻存管中，直接将冻存管快速投入液氮中保存。
将实施例和对比例的方案，在保存1个月后，解冻，解冻方法是将保存的大熊猫乳汁从液氮中取出后，快速放入37℃水浴2分钟待乳汁融化后即可。解冻后测定细胞活率，如下表所示：
分组 细胞活率(％)
实施例1 45.00±2.96<sup>a</sup>
实施例2 56.29±3.21<sup>b</sup>
对比例1 2.17±0.04<sup>c</sup>
对比例2 6.58±0.24<sup>d</sup>
数据以平均值±标准差表示，没有相同上角标的两组数字之间有统计学差异，P<0.001。
其中，细胞活率检测是通过如下方法实现的：
乳汁解冻后，加入细胞完全培养基5ml，800g，离心5分钟，弃上清液，加入1ml培养基重悬细胞沉淀。取10μl细胞悬液和10μl AO/PI染液充分混匀后，加到Countstar专用细胞计数板中，用细胞计数仪(
Figure BDA0002331547160000033
Smart Cell Analysis)AO/PI模式下检测细胞活率，平行重复三次。
AO/PI染液由可以发出绿色荧光的DNA结合染料吖啶橙(AcridineOrange，简称AO)和可以发出红色荧光的DNA结合染料碘化丙啶(Propidiumiodide，简称PI)组成。其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。
可以看出，采用本发明实施例的方法保存的大熊猫乳汁，冻后细胞活率远远高于对比例。同时，实施例2的细胞活率又显著高于实施例1，发明人分析可能原因是：乳汁本身含有较多的乳蛋白以及脂类成分，其作用类似冷冻保护剂对细胞有一定的保护作用，冷冻体系大一些可能会使细胞冷冻速率降低，减少细胞内冰晶的形成。由于实验奶量有限，没有再检测更大冷冻体系，有可能随着体系增加冷冻效果会有提升，但是对于实际生产需要而言，由于大熊猫乳汁较少，而大熊猫幼仔单次对于乳汁的需求量也不高，因此冷冻较大体积也不是最佳选择，冷冻较大体积解冻后如果有剩余也是不可取的，所以多冻存小包装更有利于乳汁的充分利用。结合实际情况，分析认为单次最高冷冻2ml以内是最合理的。
而进一步对上述实施例和对比例保存1个月后的乳汁解冻后的营养成分进行分析，发现乳汁中总蛋白含量、脂肪含量、乳铁蛋白、IgA和渗透压未发生明显变化，表明不同冷冻保存方式不会对乳汁中的营养成分和免疫活性成分造成重大影响。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (6)

1.一种大熊猫乳汁保存方法，其特征在于：是将大熊猫乳汁在-80℃放置24h，然后放入液氮中保存。
2.根据权利要求1所述大熊猫乳汁保存方法，其特征在于：大熊猫乳汁在冷冻前，先装入冻存管内，然后将冻存管放置在处于室温的程序降温盒中。
3.根据权利要求2所述大熊猫乳汁保存方法，其特征在于：所述程序降温盒的降温速率为-1℃/min。
4.根据权利要求2或3所述大熊猫乳汁保存方法，其特征在于：将大熊猫乳汁在-80℃放置24h后，取出程序降温盒后立刻放入液氮中保存。
5.根据权利要求2或3所述大熊猫乳汁保存方法，其特征在于：将大熊猫乳汁0.5-2ml，加入到2ml的冻存管内。
6.根据权利要求5所述大熊猫乳汁保存方法，其特征在于：所述程序降温盒内装入至少一根冻存管。
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