CN104845931A - 人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法，主要步骤包括：成人乳汁的采集；获取和分离人乳干细胞；培养人乳干细胞；检测、冻存人乳干细胞；建库。利用本发明的获取人乳干细胞的方法，可有效的分离、纯化、扩增人乳干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立长期储存人乳干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量的干细胞资源。根据本发明的方法获取的人乳干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，该库为健康成人储存人乳干细胞，为其本人在患病需要采用干细胞治疗时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的人乳干细胞用于干细胞制剂的生产。

Description

人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法

本发明涉及干细胞获取方法及其干细胞库构建的方法，尤其涉及一种人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法。

背景技术

干细胞研究是近年来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。近几年研究表明，成体干细胞的分化能力远超过传统观点所局限的范围。因此目前干细胞的应用已经不再局限于利用胚胎干细胞的全能性去研究组织细胞再生，也不再局限于只用组织本身的起始干细胞做细胞治疗研究，而是趋于寻找更多的干细胞来源，通过研究他们的分化潜能，体外扩增能力，分化后的细胞功能以及取材是否安全方便等问题，选择最合适的干细胞来源来进行未来的细胞治疗应用。

最新研究发现，在人类母乳中包含有丰富的干细胞，这些干细胞可以分化为身体的其他细胞，比如骨骼细胞、脂肪细胞、肝脏细胞和脑细胞等。许多研究表明，从人类乳汁中成功提取出来的人乳干细胞与其他间充质干细胞基本类似，表达相同的表面抗原，并且能够在体外扩增，同时具有较低的免疫原性和免疫调节功能。此外，人乳干细胞来源广泛，获得方式也比较容易，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，人乳干细胞在未来细胞治疗及再生医学领域都具有重大的应用潜力。

为了便于人们有效储存和应用干细胞资源，目前在世界不同国家范围内，已经建立了多个干细胞库。所谓干细胞库是将干细胞储存于约为-196℃液氮中及搜集存放干细胞资源相关资料的场所。按所储存的干细胞来源和采集方式，干细胞库主要可分为胚胎干细胞库、成体干细胞库以及病理细胞库，成体干细胞库中包括脐血干细胞库、脂肪干细胞库、以及脐带间充质干细胞库。一个完善的干细胞库应具备随时随地将储存的健康干细胞提供临床使用的能力。目前尚无人乳干细胞库，因此，构建人乳干细胞库，将人健康的人乳干细胞通过本发明建立的系统工程技术储存建库，是将现有的资源充分利用的有效方法，为储存本人、家属和他人在需要采用人乳干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型人乳干细胞，具有十分广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人乳干细胞的获取方法以及人乳干细胞库的构建方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的优点。

本发明提供的一种人乳干细胞库的构建方法，包括如下步骤：

1)        人乳汁的采集：采集乳汁之前，采集供者的可确认身份的信息，优选需经供者签订知情同意书后，方能采集，知情同意书中通常包括供者姓名、年龄、身份证号、通讯地址、联系方式等信息。签订同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；

2)        获取和分离人乳干细胞：取出采集的乳汁，在无菌条件下加入营养液稀释2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和奶状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置如细胞培养皿中，在37℃，5%CO₂的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至80-90%时即得到原代的人乳干细胞；

3)        人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养装置如细胞培养皿中，当细胞长满如铺满整个平皿(100mm)后，去除如吸弃旧培养液，使用磷酸缓冲盐溶液如10mL清洗如一遍，之后用0.25%消化液（通常预热20分钟左右）如2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察细胞之间分离，立刻加细胞培养液如5ml终止消化，轻柔吹打如8-10次成单细胞；800-1000rpm离心5-6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打；之后将细胞悬液1:4传到细胞培养装置如100mm细胞培养皿中，加干细胞培养液，如每个细胞培养皿加10ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞；

4)        人乳干细胞的检测与冻存：

人乳干细胞的检测：待人乳细胞长至80-90%融合时，去除旧的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3-5分钟，优选在显微镜下观察细胞的消化情况，并用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清，收获得到人乳干细胞。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次得到的人乳干细胞进行细胞冻存；

人乳干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196℃的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。

其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理；

5)        建库：在储存入库的容器载体上建立人乳干细胞的相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人乳干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人乳干细胞库管理，即完成人乳干细胞库的构建。

其中，步骤2)所述的营养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM等；

所述的平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可以是PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，SPB盐缓冲溶液等，能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定；

所述的干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM以及自制的含10-20%的血清或无血清培养基。

步骤4)所述的干细胞冻存液是含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO一类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、α-MEM等，其中，冷冻保护剂（如DMSO），血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。

步骤4)所述的程序式降温方法，包括4℃保存40-60min，-20℃保存1-2h，-80℃过夜，最后存入到-196℃液氮，或者，也可以直接置于程序性降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，第二天转到-196℃的液氮中。

本发明提供的一种人乳干细胞的获取方法，包括如下步骤：

1)        人乳汁的采集：采集乳汁之前，采集供者的可确认身份的信息，优选需经供者签订知情同意书后，方能采集，知情同意书中通常包括供者姓名、年龄、身份证号、通讯地址、联系方式等信息。签订同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；

2)        获取和分离人乳干细胞：取出采集的乳汁，在无菌条件下加入营养液稀释如2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和奶状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗如2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置如细胞培养皿中，在37℃，5%CO₂的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至80-90%时即得到原代的人乳干细胞；

3)        人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养装置如细胞培养皿中，当细胞长满时，如铺满整个平皿(100mm)后，去除如吸弃旧培养液，用磷酸缓冲盐溶液如10mL清洗如一遍，之后用0.25%消化液（预热20分钟左右）如2ml消化，最好轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察细胞之间分离，立刻加干细胞培养液如5ml终止消化，轻柔吹打如8-10次成单细胞。800-1000rpm离心5-6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打。将细胞悬液1:4传到细胞培养装置如100mm细胞培养皿中，加干细胞培养液，如每个皿加10ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞；

4)        人乳干细胞的检测与冻存：

人乳干细胞的检测：待人乳干细胞长至80-90%融合时，去除旧的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3-5分钟，优选在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次得到的人乳干细胞进行细胞冻存；

人乳干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196℃的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。

其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理。上述冻存容器可以是冻存管等管状容器，也可以是其它任何合适形状和体积的容器。

其中，步骤2)所述的营养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM等。

所述的平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可以是PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，SPB盐缓冲溶液等，能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定。

所述的干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM以及自制的含10-20%的血清或无血清培养基。

步骤4)所述的干细胞冻存液是含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、α-MEM等，其中，冷冻保护剂（如DMSO），血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。

步骤4所述的程序式降温方法，包括4℃保存40-60min，-20℃保存1-2h，-80℃过夜，最后存入到-196℃液氮，或者，也可以直接置于程序性降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，第二天转到-196℃的液氮中。

其中，细胞培养装置除使用培养皿外，也可以其它任一常用的细胞培养装置。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一，利用本发明获取人乳干细胞的方法，可以有效地分离、纯化、扩增人乳干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并且建立储存人乳干细胞的干细胞库，由此从干细胞库向临床及科研应用提供大量干细胞资源；

第二，本发明获取的人乳干细胞构建成的干细胞库，来源丰富，细胞获取简便，可以获得大量富有活性的人乳干细胞，并且能够进行长时间保存而不失活性，具有良好的应用前景；该库为健康的人乳干细胞，为储存者在特殊情况下需要采用干细胞移植及相关技术治疗时，提供临床适用型的人乳干细胞，并且在取得允许后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1是本发明实施例1人乳干细胞获取方法的步骤2）所得的原代人乳干细胞的200X倒置显微镜图；

          图2是本发明实施例1人乳干细胞获取方法的步骤3）传代后所得的人乳干细胞的200X倒置显微镜图；

图3是本发明实施例1人乳干细胞获取方法的步骤4）中人乳干细胞的流式细胞鉴定图，其中，图中：A: CD105-APC; B: CD13-FITC; C: CD14-FTIC;G: CD34-PE; H: HLA-DR; I: CD90-PE。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中的操作均在严格无菌环境进行。

本实施例提供的一种人乳干细胞的获取方法，包括如下步骤：

（1）人乳汁的采集：采集乳汁之前，需采集供者身份信息，还可包括供者通讯信息，通常可通过经供者签订知情同意书的方式，签订知情同意书后方能采集，知情同意书中包括供者姓名、年龄、身份证明等一些基本信息；签订上述知情同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型的检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；

（2）获取和分离人乳干细胞：将采集的乳汁在无菌条件下加入营养液稀释2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和乳状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养皿中，在37℃、5%CO₂的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至密度为80-90%时即得到原代人乳干细胞，该原代人乳干细胞的显微镜图片请参见图1所示，从图1中可看出，分离出的人乳干细胞长势良好；

（3）人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养皿中，当细胞铺满整个平皿(100mm)后，吸弃旧培养液，用10mL的平衡磷酸盐缓冲溶液洗一遍，然后用0.25%消化液（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml干细胞培养液终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。之后800-1000rpm离心5-6分钟，弃上清，加细胞培养液进行轻柔吹打。将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞，所获得的人乳干细胞的显微镜图片请参见图2，从图2中可看出，步骤3）培养的人乳干细胞长势良好；

（4）人乳干细胞的检测与冻存：

人乳干细胞的检测：待人乳细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3-5分钟，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，该质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，其中，对上述人乳干细胞进行流式细胞检测的图请见图3，图3可看出，人乳干细胞的表面标记表达检测满足基本间充质干细胞标准，其余同批次的人乳干细胞进行细胞冻存；

人乳干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存管中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196℃的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。

其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后有专门人员进行处理。

其中，上述的营养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM等；

上述的平衡盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可以是PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，SPB盐缓冲溶液等，能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定；

上述的干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM以及自制的含10-20%的血清或无血清培养基。

上述的干细胞冻存液是含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、α-MEM等，其中，冷冻保护剂（如DMSO），血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7；

上述的程序式降温方法，包括4℃保存40-60min，-20℃保存1-2h，-80℃过夜，最后存入到-196℃液氮，或者，也可以直接置于程序性降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，第二天转到-196℃的液氮中；

本实施例还提供的一种人乳干细胞库的构建方法，包括如下步骤：

1)    人乳汁的采集：采集乳汁之前，需采集供者身份信息，还可包括供者通讯信息，通常可通过经供者签订知情同意书的方式，签订知情同意书后方能采集，知情同意书中包括供者姓名、年龄、身份证明等一些基本信息；签订上述知情同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；

2)    获取和分离人乳干细胞：将采集的乳汁，在无菌条件下加入营养液稀释2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和奶状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养皿中，在37℃，5%CO₂的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至80-90%时即得到原代的人乳干细胞；

3)    人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养皿中，当细胞铺满整个平皿(100mm)后，吸弃旧培养液，用10mL的磷酸缓冲盐溶液洗一遍，然后用0.25%消化液（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml细胞培养液终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞；然后800-1000rpm离心5-6分钟，弃上清，加细胞培养液进行轻柔吹打。将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞；

4)    人乳干细胞的检测与冻存：

人乳干细胞的检测：待人乳细胞长至80-90%融合时，去除旧的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3-5分钟，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，并将收获的同批次人乳干细胞的其余部分进行细胞冻存；

人乳干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存管中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196℃的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。

其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后有专门人员进行处理；

（5）建库：在储存入库的容器载体上建立人乳干细胞的相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人乳干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人乳干细胞库管理，即完成人乳干细胞库的构建。

其中，上述的营养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM等。

上述的平衡盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可以是PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，SPB盐缓冲溶液等，能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定。

上述的干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM以及自制的含10-20%的血清或无血清培养基。

上述的干细胞冻存液是含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO此类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、α-MEM等，冷冻保护剂（如DMSO），血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。

上述的程序式降温方法，包括4℃保存40-60min，-20℃保存1-2h，-80℃过夜，最后存入到-196℃液氮，或者，也可以直接置于程序性降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，第二天转到-196℃的液氮中。

本发明的优势在于：

利用本发明获取人乳干细胞的方法，可以有效地分离、纯化、扩增人乳干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并且建立储存人乳干细胞的干细胞库，由此从干细胞库向临床及科研应用提供大量干细胞资源。

获取的人乳干细胞构建成的干细胞库，来源丰富，细胞获取简便，可以获得大量富有活性的人乳干细胞，并且能够进行长时间保存而不失活性，具有良好的应用前景。该库为健康的人乳干细胞，为储存者在特殊情况下需要采用干细胞移植及相关技术治疗时，提供临床适用型的人乳干细胞，并且在取得允许后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产。

在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

Claims (12)

1.一种人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）人乳汁的采集：采集乳汁之前，采集供者的可确认身份的信息，并对供者进行至少ABO/Rh血型的检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；

（2）获取和分离人乳干细胞：将采集的乳汁在无菌条件下加入营养液稀释，之后在转速为250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和乳状液体，底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置中，在37℃、5%CO₂的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至密度为80-90%时即得到原代人乳干细胞；

（3）人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养装置中，待细胞长满后，去除旧培养液，用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后使用0.25%消化液消化，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察到细胞之间分离，立刻加干细胞培养液终止消化，轻柔吹打成单细胞；之后800-1000rpm离心5-6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打；将细胞悬液1:4传到细胞培养装置中，每个装置加入干细胞培养液进行培养，期间不用换液，以获得更多的人乳干细胞；

（4）人乳干细胞的检测与冻存：

人乳干细胞的检测：待人乳干细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3-5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000rpm离心5-6分钟，结束后去除上清，收获得到人乳干细胞；将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，所述质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次所得人乳干细胞进行细胞冻存；

人乳干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196℃的液氮中长期保存；细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测；

其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理；

（5）建库：在储存入库的容器载体上建立人乳干细胞的信息，将前述所采集的供者的可确认身份的信息和相应人乳干细胞制备及其细胞库构建过程的信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人乳干细胞库管理，即完成人乳干细胞库的构建。

2.如权利要求1中所述的人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤2）中，在无菌条件下向采集的乳汁中加入营养液稀释2-3倍；所述营养液含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量元素。

3.如权利要求1所述的人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，所述平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，选自PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，或SPB盐缓冲溶液。

4.如权利要求1所述的人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，所述干细胞培养液含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量元素。

5.如权利要求1所述的人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，所述干细胞冻存液含有可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤的细胞冷冻保护剂，血清以及干细胞基本培养基，其中细胞冷冻保护剂，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。

6.如权利要求1或5所述的人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，所述程序式降温的方法包括4℃保存40-60min，-20℃保存1-2h，-80℃过夜，最后存入到-196℃液氮；或者，所述程序式降温的方法为：直接置于程序性降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，第二天转到-196℃的液氮中。

7.一种人乳干细胞的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）人乳汁的采集：采集乳汁之前，采集供者的身份信息，之后对供者进行至少ABO/Rh血型的检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；

（2）获取和分离人乳干细胞：将采集的乳汁在无菌条件下加入营养液稀释，之后在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和乳状液体，底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置中，在37℃、5%CO₂的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至密度为80-90%时即得到原代人乳干细胞；

（3）人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养装置中，当细胞长满后，去除旧培养液，用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后用0.25%消化液消化，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落，或在显微镜下观察到细胞之间分离，立刻加干细胞培养液终止消化，轻柔吹打成单细胞；之后800-1000rpm离心5-6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打；将细胞悬液1:4传到细胞培养装置中，每个细胞培养装置加入干细胞培养液，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞；

（4）人乳干细胞的检测与冻存：

人乳干细胞的检测：待人乳细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3-5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清，收到得到人乳干细胞；将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，所述质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次所得人乳干细胞进行细胞冻存；

人乳干细胞的的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196℃的液氮中长期保存；细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测；

其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理。

8.如权利要求7所述的人乳干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤2）中，在无菌条件下向采集的乳汁中加入营养液稀释2-3倍；所述的营养液含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量元素。

9.如权利要求7所述的人乳干细胞的获取方法，其特征在于，所述平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，选自PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，或SPB盐缓冲溶液。

10.如权利要求7所述的人乳干细胞的获取方法，其特征在于，所述干细胞培养液含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量元素。

11.如权利要求7所述的人乳干细胞的获取方法，其特征在于，所述干细胞冻存液含有保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤的细胞冷冻保护剂，血清以及干细胞基本培养基，其中所述细胞冷冻保护剂，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。

12.如权利要求7所述的人乳干细胞的获取方法，其特征在于，所述程序式降温的方法包括4℃保存40-60min，-20℃保存1-2h，-80℃过夜，最后存入到-196℃液氮；或者，所述程序式降温的方法为：直接置于程序性降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，第二天转到-196℃的液氮中。