CN108103016A - 一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法：脐带预处理，物理破碎脐带，间充质干细胞分离，利用消化酶处理获得间充质干细胞，在含有10％胎牛血清和DMEM/F12细胞培养基的培养液中培养获得临床应用数量级的间充质干细胞；所述物理破碎脐带为用剪刀把处理后的脐带剪碎；所述消化酶为胶原酶Ⅱ溶液联合胰蛋白酶。本发明采用物理破碎联合消化酶的方法从脐带提取间充质干细胞，该扩增方法显著提高了间充质干细胞的扩增效率，而且使得间充质干细胞具有良好的细胞免疫学表型；提取的脐带间充质干细胞数量有了显著的提高，在相同的培养时间内，该培养方法获得的细胞数量相对较多。

Description

一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，通过采用体外扩增培养体系获得可以用于临床的间充质干细胞。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞可以自我复制，自我更新，刺激组织生长和修复，并且污染源低，获得方便，生物性能稳定、免疫源性更原始。在适宜的体外实验条件下，容易扩增和保存。间充质干细胞通过改变T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和树突样细胞分泌的细胞因子，使其体内的免疫细胞增殖，所以间充质干细胞在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景。
随着科学技术的不断进步，寻找新型和更具潜力的间充质干细胞已经成为当今研究热点。本发明从剖腹产胎盘组织中提取间充质干细胞，然后进行原代分离和培养，对间充质干细胞做细胞表型标志、增殖分化以及免疫调节能力等在内的性质鉴定。间充质干细胞可以促进组织修改，改善免疫，在临床上用于自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等均有明显疗效。如何获得足够数量的更具潜力的间充质干细胞是MSCs应用在临床上的重要保证，以期进一步拓宽人们对脐带间充质干细胞生物学性质的认识，并为这一类间充质干细胞的临床应用提供支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，材料来源易得、操作简单方便高效，能有效降低MSCs的培养成本和获得大量的MSC细胞，为MSCs在临床的应用提供基础。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法：脐带预处理，物理破碎脐带，间充质干细胞分离，利用消化酶处理获得间充质干细胞，在含有10％胎牛血清和DMEM/F12细胞培养基的培养液中培养获得临床应用数量级的间充质干细胞；所述物理破碎脐带为用剪刀把处理后的脐带剪碎；所述消化酶为胶原酶Ⅱ溶液联合胰蛋白酶。
进一步的，一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，具体步骤为：
a)脐带预处理
从保存液中取出脐带，物理破碎脐带，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血液和血块，用10倍双抗浸泡后用剪刀剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织碎块；
b)原代间充质干细胞分离
将剪碎的组织小块，用胶原酶Ⅱ溶液消化，后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化，终止消化后用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液，洗涤离心得到的沉淀物即为间充质干细胞，用培养液重悬，接种于六孔板内培养。
进一步的，步骤b中，分离的间充质干细胞按照1-3*106/ml密度接种于六孔板中，培养1-3天，根据细胞生长状态更换MSC细胞培养液。
进一步的，步骤b中，用胶原酶Ⅱ溶液消化12-24小时，后加入胰蛋白酶在37℃条件下消化15-30分钟，用含血清的完全培养基终止消化，用生理盐水洗两次，用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液。
进一步的，步骤b中，当间充质干细胞数量达到80％～90％融合度时，用胰蛋白酶消化传代转移到T25细胞培养瓶继续培养。
本发明的有益效果为：
(1)本发明的方法获得的脐带间充质干细胞在7-10天的培养周期中，细胞量可增殖12-20倍，可得到大量富有活性的脐带间充质干细胞，并且经过流式细胞仪检测和体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力。提取脐带间充质干细胞，能够满足临床治疗的要求。获得的脐带间充质干细胞能够长时间保存而不失其活性，且操作简单易行，成本低廉，可直接用于科学实验研究和临床上的辅助治疗，富有应用前景。
(2)本发明采用物理破碎联合消化酶的方法从脐带提取间充质干细胞，该扩增方法显著提高了间充质干细胞的扩增效率，而且使得间充质干细胞具有良好的细胞免疫学表型；
(3)本发明采用物理破碎联合消化酶的方法，提取的脐带间充质干细胞数量有了显著的提高，在相同的培养时间内，该培养方法获得的细胞数量相对多，培养的间充质干细胞按照国际细胞治疗协会(ISCT)制定MSC的标准进行形态学、免疫学和体外分化实验鉴定为间充质干细胞。其细胞数量、倍增时间和增殖能力明显高于骨髓来源的间充质干细胞。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是通过本发明的方法进行培养获得的间充质干细胞的结果；
图2是脐带间充质干细胞流式细胞仪检测的免疫细胞表型；
图3是脐带间充质细胞增殖曲线图；
图4是脐带间充质干细胞诱导分化后的成骨细胞形态图；
图5是RT-PCR检测证实，脐带MSCs诱导前后心肌相关基因表达图。
具体实施方式
下面结合附图1-5对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明的实施例包括：
(1)采集信息：
经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿的脐带，采集脐带之前产妇需要做艾滋病病毒抗体、肝炎病毒抗体(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎)，梅毒螺旋体抗体、支原体、肝功能等检测，所有的检验报告合格，方可采集脐带组织。
(2)制备所需细胞培养液：1)制备间充质干细胞培养液：每50mL间充质干细胞的完全培养液中包含：胎牛血清：5mL；DMEM/F12细胞培养基：45mL。2)每50mL胶原酶溶液包含：胶原酶Ⅱ(sigma)：50m；PBS：50mL；过滤除杂，分装到10个离心管中，-20℃保存，使用时先放于4℃慢慢解冻。
(3)原代培养：
a、脐带从手术台取下后，浸入0.9％的生理盐水中，常温保存，带回实验室12h内进行处理，并且对采集的脐带进行相关病原微生物检测，将采集信息录入计算机系统。
b、将脐带置于超净台内，用止血钳、剪刀、镊子等手术器械剥去动静脉，再用生理盐水洗去残留的血液和血块。
c、用10倍的双抗(青霉素和链霉素混合液)浸泡脐带5-10分钟后，用纱布晾干，用剪刀剪碎。
d、用胶原酶Ⅱ溶液消化12-24小时，然后用胰蛋白酶在37℃条件下消化15-30分钟，用生理盐水洗两次，100目筛网过滤收集细胞。
e、用含有10％胎牛血清和DMEM/F12的培养液中培养，调整细胞密度1-3*106/ml接种于6孔板中，于37℃、5％的CO2孵箱里培养，24-72小时后换液，观察细胞形态。
f、当细胞数量达到80％～90％融合度时，用胰蛋白酶消化传代。
(4)传代培养：
将培养瓶的旧培养基倒掉后，用PBS洗三遍细胞，加入0.25％胰蛋白酶2mL消化贴壁细胞，在显微镜下观察，待大部分细胞变小变圆后立即加入10％的血清终止消化，轻轻将细胞吹打下来，吸入15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞。将细胞悬液吹打混匀，用细胞计数板计数，以(1～3)×104/cm2传入T25培养瓶中，每个培养瓶中再加3-5mL完全培养液，放入5％v/v二氧化碳培养箱，每周换2-3次液，取P3代以后的细胞用于试验。
(5)观察指标和检测方法
1)倒置显微镜：观察细胞形态学、融合度和融合度达到80％～90％的时间。
2)细胞计数板对细胞进行计数
公式：细胞悬液的细胞数/mL＝(4个大格子细胞总数/4)×104×稀释倍数细胞悬液的细胞总数＝细胞悬液的细胞数/mL×细胞悬液的毫升数
(6)测定细胞增殖情况：
CCK-8法的具体步骤包括：分别取融合度达80％～90％所培养的P3代细胞，消化离心，用PBS洗2次后，以1×105个/mL的密度种植于96孔板，设三个孔，每孔加入100μL细胞悬液，待细胞贴壁后，培养2～3天，取生长对数期细胞，放于37℃、5％二氧化碳培养箱中，于接种后于24h、2d、5d、7d利用CCK-8法检测细胞的生长情况，于490nm处分光光度计测定各组细胞的OD值，取均值绘制生长曲线。
(7)脐带间充质干细胞的细胞特征检测
免疫表型检测CD105、CD90、CD73、CD34、HLA-DR、CD14、CD45、CD19(见表1)，将第4-7代人脐带来源的间充质干细胞接种于6孔板中，待细胞达到80-90％融合时使用10ml胰酶消化，将细胞悬液转入10ml离心管中并以1000rpm离心3分钟。离心之后，弃掉上清，PBS洗涤2次，分成每管1×106细胞，第一管为空白对照(只含间充质干细胞)，用于调节流式细胞仪的电压，第二管加入同型对照抗体(PE-MOUSE IgGl/FITC-MOUSEIgG1/APC-Mouse IgG1)5μl，其余管中加入其它相应抗体5μl，混匀，4℃避光孵育20分钟，PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入500μl PBS重悬，混匀，即可上机(流式细胞仪，BD公司)检测。细胞免疫表型为：CD73，CD90，CD105为阳性标记，CD14，CD45，CD34，HLA-DR为阴性标记(见图2)。
表1
(8)多向分化潜能：
a、脐带干细胞的成骨诱导分化
诱导分化培养基为含有100nmol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸钠，50μmol/L VitC和10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，每两天换培养液一次，培养21天后用PBS洗涤细胞两次，用福尔马林固定15分钟，骨涎蛋白免疫组化染色，鉴定钙结节的产生。显微镜下观察，诱导后的细胞呈阳性表达(见图2)。
b、脐带干细胞的心肌诱导分化
诱导分化培养基为含有10μmol/L的5-氮胞苷和10％FBS的DMEM/F12培养液，加入诱导液24小时后，立即更换为10％FBS的DMEM/F12培养液，每两题天换液一次，培养八周。提取细胞的RNA，进行RT-PCR检测人心肌转录因子GATA4和cTnT，α-actin的表达。结果表明这些基因均有一定程度的表达(见图3)，RT-PCR检测证实，人脐带MSCs诱导前不表达上述心肌细胞标志物，经5-Aza诱导后心肌细胞标记均有一定程度的表达。
(9)细胞冻存
取P3代生长状态良好的间充质干细胞用于冻存，冻存前一天换液，冻存当天细胞汇合度应达90％以上。冻存的具体步骤：1、去除旧培养基，PBS洗1次，然后加入适量胰酶消化细胞，待大部分细胞回缩变圆时，立即加入终体积10％的FBS终止；2、将细胞吹打下来转移到离心管，离心(1000rpm，5min)洗涤2次，加入细胞冻存液(DMSO：FBS＝1：9)重悬细胞沉淀，吹打混匀，分装至细胞冻存管，每管1.5mL；3、将冻存管放入程序降温盒，-80℃冻存过夜后，转入液氮长期保存。
(10)细胞复苏
从液氮中取出冻存管，立即放入39℃的温育箱内中迅速摇晃，使冻存细胞在2min内迅速融化。将解冻的细胞转移至预装有5mLDMEM/F12完全培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，1000rpm离心5min，弃上清。再用重复上诉步骤一次，尽可能去除DMSO。最后加入适量培养基重悬细胞沉淀，移至细胞培养瓶内，置于37℃、5％二氧化碳的饱和湿度培养箱内复苏培养。
采用本发明的方法扩增的脐带间充质干细胞在7-10天的培养周期中，细胞量可增殖12-20倍，可得到大量富有活性的脐带间充质干细胞，并且经过流式细胞仪检测和体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力。培养获得的脐带间充质干细胞能够长时间保存而不失其活性，且操作简单易行，成本低廉，可直接用于科学实验研究和临床上的辅助治疗，富有应用前景。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：脐带预处理，物理破碎脐带，间充质干细胞分离，利用消化酶处理获得间充质干细胞，在含有10％胎牛血清和DMEM/F12细胞培养基的培养液中培养获得临床应用数量级的间充质干细胞；所述物理破碎脐带为用剪刀把处理后的脐带剪碎；所述消化酶为胶原酶Ⅱ溶液联合胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
a)脐带预处理
从保存液中取出脐带，物理破碎脐带，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血液和血块，用10倍双抗浸泡后用剪刀剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织碎块；
b)原代间充质干细胞分离
将剪碎的组织小块，用胶原酶Ⅱ溶液消化，后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化，终止消化后用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液，洗涤离心得到的沉淀物即为间充质干细胞，用培养液重悬，接种于六孔板内培养。
3.根据权利2所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中，分离的间充质干细胞按照1-3*106/ml密度接种于六孔板中，培养1-3天，根据细胞生长状态更换MSC细胞培养液。
4.根据权利2所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中，用胶原酶Ⅱ溶液消化12-24小时，后加入胰蛋白酶在37℃条件下消化15-30分钟，用含血清的完全培养基终止消化，用生理盐水洗两次，用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液。
5.根据权利2或3所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中，当间充质干细胞数量达到80％～90％融合度时，用胰蛋白酶消化传代转移到T25细胞培养瓶继续培养。
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