CN106566804A - 一种培养人脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种培养人脐带间充质干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

一种培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁；将T25培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；当细胞达70%～80%融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。该种方法及能保证充质干细胞的活性又能提高培养效率。

Description

一种培养人脐带间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种培养人脐带间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC, mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
而现有技术中，间充质干细胞的培养步骤都比较的复杂，而且在培养的过程中很容易有细菌进入，从而就会严重影响间充质干细胞的良好生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够减少细菌污染的培养人脐带间充质干细胞的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
S2、沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁；
S3、将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
S4、每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
S5、当细胞达70%～80%融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
通过上述技术方案，将夹痕和淤血除去，这样可以减少已坏死的组织对培养的干细胞造成影响。同时，利用含有双抗的PBS缓冲液对脐带外周以及脐静脉内腔进行清洗，这样一方面可以把脐带清理干净，另一方面也可以保证充质干细胞的存活率，而且，双抗能够抑制细菌生长，避免了充质干细胞在培养的过程中受到污染。
脐静脉内膜的细胞与脐带的充质干细胞的分化不同，将脐带脉内膜除去，可以有效地提高充质干细胞的纯度。
将间充质干细胞放置在含有体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，这样一方面可以保证充质干细胞的正常呼吸繁殖，同时，也有助于间充质干细胞的正常繁殖。而且，在每次过夜后都将T25培养瓶底壁进行翻转，这样能够保证每一面的间充质干细胞都不会受到长时间的挤压，从而有利于保证间充质干细胞的繁殖速率。
在S4中对贴块进行换液，这样可以保证使得间充质干细胞能够有足够的营养物质来繁殖。
利用胰蛋白酶来对T25培养瓶中的间充质干细胞进行处理，这样可以提高间充质干细胞的分散率，从而更有利于间充质干细胞的培养和繁殖，而且由于一般胰蛋白酶溶液往往都含有钙镁离子，因此，乙二胺四乙酸能够与钙镁离子形成配合物，从而有利于降低钙镁离子对胰蛋白酶活性的影响。
作为优选，所述完全培养基A，包括含体积分数为1%～3%胎牛血清、35～45%MCDB201、7～13µg/L血小板衍生生长因子、8～12µg/L碱性成纤维细胞生长因子、5～15µg/L表皮生长因子的DF12培养基。
作为优选，所述完全培养基A，包括含体积分数为2%胎牛血清、40% MCDB201、10µg/L血小板衍生生长因子、10µg/L碱性成纤维细胞生长因子、10µg/L表皮生长因子的DF12培养基。
胎牛血清能够为间充质干细胞的生长提供基础的环境条件，同时，各种生长因子的加入，能够有助于促进间充质干细胞的分裂。进而，有利于提高间充质干细胞的培养效率。
作为优选，所述完全培养基A在使用前，先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒。
由于一般细菌的致死点均为温度68℃与时间30min以下，所以将完全培养基A经此法处理后，可杀灭其中的致病性细菌和绝大多数非致病性细菌；同时，完全培养基A加热后突然冷却，急剧的热与冷变化也可以促使细菌的死亡。从而能够有效地对完全培养基A起到灭菌的作用。
作为优选，待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
由于完全培养基A中的表皮生长因子的DF12培养基其在酸性的条件下容易偏黄从而影响培养过程中的观察，而碳酸氢钠能够起到缓冲作用，并且碳酸氢钠分解后产生的钠盐和CO2都是细胞生存所需要的物质，所以也能够为细胞提供一定的物质补给。
作为优选，S2中剩余组织的切块为3.2～4.6mm3。
将剩余组织切成3.2～4.6mm3的切块，这样可以保证尽可能多的间充质干细胞能够与完全培养基A进行接触，从而有利于能够提高间充质干细胞的成活率。
作为优选，将切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min。
这样可以对连接相邻间充质干细胞质的胶原蛋白和蛋白纤维进行初步的分解，这样一方面仍旧方便对切块进行取放，降低切块破碎的可能性，另一方面也有利于每个间充质干细胞在培养的过程中能够更好地从完全营养基A中汲取所需的营养物质，从而大大提高了间充质干细胞的培养效率。
作为优选，S5中的胰蛋白酶在配置成消化液前，先经过PCH絮凝剂的沉淀提纯。
作为优选，PCH絮凝剂的质量分数为0.3%～0.5%。
胰蛋白酶在配置消化液前先，先经过PCH絮凝剂的沉淀提纯，这样可以进一步将胰蛋白酶与钙镁离子发生分离，而且PCH絮凝剂不会胰蛋白酶的活性造成影响，因此，有利于提高消化液的分解效率，进而大大提高了间充质干细胞的培养效率。
同时，根据以下试验数据，在室温下,PCH絮凝剂在上清液中的质量分数与胰蛋白酶的物理性质之关系：
PCH絮凝剂的质量分数 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.6
透光率 24 26 26 45 54 58 58
絮凝现象 极慢 慢 慢 快 快 快 慢
从上表可以很看出，胰蛋白酶的沉淀当PCH絮凝剂于上清液中的质量分数为0.3%～0.5%时絮凝现象较为明显。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.将新鲜脐带的夹痕和 除去，这样可以减少坏死细胞对充值干细胞的培养造成影响；
2.利用胎牛血清和各类生长因子配置成完全培养基A来对充质干细胞进行培养，这样为充质干细胞的生长提供了有效地环境；
3.将完全培养基A先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，这样既能够较为完全地杀灭完全培养基A中的细菌，同时又不会破坏其内部的其他生长因子效用；
4.胰蛋白酶在配置成消化液前先用PCH絮凝剂进行沉淀提纯，这样可以有效地将胰蛋白酶与钙镁离子进行分离，而且也不会导致胰蛋白酶的失活。
附图说明
图1是培养人脐带间充质干细胞的流程图。
具体实施方式
以下结合附图1对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
步骤一：采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤二：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，切块的尺寸为3.2mm3；
步骤三：切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min，然后将切块贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁上；
步骤四：将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
步骤五：每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
步骤六：取新鲜胰蛋白酶，向其内部加入1%的PCH絮凝剂，进行沉淀过滤，然后用生理盐水对沉淀的胰蛋白酶进行清洗，并将其稀释成1.25g/L。
步骤七：当细胞达70%～80%融合时，用步骤六中配置的胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的混合制成消化液进行消化，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。以上述方法还可以进行多代的培养。
完全培养基A的配置：
将体积分数为1%的胎牛血清、35%的 MCDB201、7µg/L血小板衍生生长因子、8µg/L碱性成纤维细胞生长因子和5µg/L表皮生长因子的DF12培养基进行均匀混合，制得完全培养基A；
将制得的完全培养基A先加热至68℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4℃进行消毒；
待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
实施例二：
步骤一：采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤二：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，切块的尺寸为4.6mm3；
步骤三：切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min，然后将切块贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁上；
步骤四：将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
步骤五：每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
步骤六：取新鲜胰蛋白酶，向其内部加入3%的PCH絮凝剂，进行沉淀过滤，然后用生理盐水对沉淀的胰蛋白酶进行清洗，并将其稀释成1.25g/L。
步骤七：当细胞达70%～80%融合时，用步骤六中配置的胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的混合制成消化液进行消化，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
完全培养基A的配置：
将体积分数为3%的胎牛血清、45%的 MCDB201、13µg/L血小板衍生生长因子、12µg/L碱性成纤维细胞生长因子和15µg/L表皮生长因子的DF12培养基进行均匀混合，制得完全培养基A；
将制得的完全培养基A先加热至70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到5℃进行消毒；
待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
实施例三：
步骤一：采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤二：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，切块的尺寸为3.9mm3；
步骤三：切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min，然后将切块贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁上；
步骤四：将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
步骤五：每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
步骤六：取新鲜胰蛋白酶，向其内部加入2%的PCH絮凝剂，进行沉淀过滤，然后用生理盐水对沉淀的胰蛋白酶进行清洗，并将其稀释成1.25g/L。
步骤七：当细胞达70%～80%融合时，用步骤六中配置的胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的混合制成消化液进行消化，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
完全培养基A的配置：
将体积分数为2%的胎牛血清、40%的 MCDB201、10µg/L血小板衍生生长因子、10µg/L碱性成纤维细胞生长因子和10µg/L表皮生长因子的DF12培养基进行均匀混合，制得完全培养基A；
将制得的完全培养基A先加热至69℃，并保持此温度30min以后急速冷却到5℃进行消毒；
待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
实施例四：
步骤一：采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤二：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，切块的尺寸为3.2mm3；
步骤三：切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min，然后将切块贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁上；
步骤四：将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
步骤五：每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
步骤六：取新鲜胰蛋白酶，向其内部加入1%的PCH絮凝剂，进行沉淀过滤，然后用生理盐水对沉淀的胰蛋白酶进行清洗，并将其稀释成1.25g/L。
步骤七：当细胞达70%～80%融合时，用步骤六中配置的胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的混合制成消化液进行消化，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
完全培养基A的配置：
将体积分数为2%的胎牛血清、35%的 MCDB201、7µg/L血小板衍生生长因子、10µg/L碱性成纤维细胞生长因子和15µg/L表皮生长因子的DF12培养基进行均匀混合，制得完全培养基A；
将制得的完全培养基A先加热至68℃，并保持此温度30min以后急速冷却到5℃进行消毒；
待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
实施例五：
步骤一：采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤二：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，切块的尺寸为3.9mm3；
步骤三：切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min，然后将切块贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁上；
步骤四：将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
步骤五：每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
步骤六：取新鲜胰蛋白酶，向其内部加入2%的PCH絮凝剂，进行沉淀过滤，然后用生理盐水对沉淀的胰蛋白酶进行清洗，并将其稀释成1.25g/L。
步骤七：当细胞达70%～80%融合时，用步骤六中配置的胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的混合制成消化液进行消化，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
完全培养基A的配置：
将体积分数为3%的胎牛血清、40%的 MCDB201、10µg/L血小板衍生生长因子、12µg/L碱性成纤维细胞生长因子和5µg/L表皮生长因子的DF12培养基进行均匀混合，制得完全培养基A；
将制得的完全培养基A先加热至69℃，并保持此温度30min以后急速冷却到5℃进行消毒；
待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
本发明的实施例一至实施例二的无菌检测采依照《中国药典 2010 版》薄膜过滤法检测，采用 HTY-601集菌仪和 APY 系列培养器。
实施例一 实施例二 实施例三 实施例四 实施例五
细菌生长情况 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
S2、沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁；
S3、将S2中的T25培养瓶底壁，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；
S4、每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；
S5、当细胞达70%～80%融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
2.根据权利要求1所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特
征在于：所述完全培养基A，包括含体积分数为1%～3%胎牛血清、35～45% MCDB201、7～13µg/L血小板衍生生长因子、8～12µg/L碱性成纤维细胞生长因子、5～15µg/L表皮生长因子的DF12培养基。
3.根据权利要求1所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述完全培养基A，包括含体积分数为2%胎牛血清、40% MCDB201、10µg/L血小板衍生生长因子、10µg/L碱性成纤维细胞生长因子、10µg/L表皮生长因子的DF12培养基。
4.根据权利要求1所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述完全培养基A在使用前，先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒。
5.根据权利要求4所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：待完全培养基A消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
6.根据权利要求1所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于： S2中剩余组织的切块为3.2～4.6mm3。
7.根据权利要求6所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：将切块先放在质量分数为1%的胶原酶II中消化10min,然后再将切块转移到质量分数为0.25%的胰蛋白酶中消化10min。
8.根据权利要求1所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：S5中的胰蛋白酶在配置成消化液前，先经过PCH絮凝剂的沉淀提纯。
9.根据权利要求8所述的一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：PCH絮凝剂的质量分数为0.3%～0.5%。
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CN108103016A (zh) * 2018-02-26 2018-06-01 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法

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