CN106148272A - 一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法 - Google Patents

一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法，步骤如下：取胸腹主动脉移植两周后的大鼠的移植血管；将血管放于含30％FBS的DMEM/F12培养液的培养皿中，剖开血管腔，将血管平铺，剥离血管外膜；移入另一培养皿中，将血管剪碎；将培养液及血管组织块吸入经FBS浸润后的培养瓶中；倾斜培养瓶，弃掉培养液，再将血管组织块密度均匀的摊平于培养瓶底部；翻转培养瓶，培养3‑4h后，翻转培养瓶，之后5‑7天内静置培养瓶；待细胞生长达80％融合状态时消化传代，传代至3代即可实验用或冻存备用。本发明的原代培养方法不仅为实验研究节约了大量的时间和资金，还为体外模拟移植性血管的体内环境，研究移植性血管疾病及其分子机制提供了更真实、更方便的实验模型。

Description

一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法。
背景技术
原代培养(primary culture)也叫初代培养，指直接从体内取出的肿瘤细胞或组织进行的第一次的培养物。最常用的原代培养有贴块法和消化法等。贴块法是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。消化法培养则是将组织块剪碎，用胶原酶消化，使细胞脱落细胞分散。如欲从临床活检或切除的肿瘤组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
血管外膜成纤维细胞在介入、动脉硬化、移植后血管再狭窄血管重塑形成中起到重要作用。因此，以移植后血管外膜成纤维细胞作为研究的切入点，进一步阐明外膜成纤维细胞被激活后，其表型和生物学功能等的变化，对于防治介入、器官移植等涉及血管增殖性疾病具有重要的临床意义。由于移植后血管外膜成纤维细胞在取样和原代培养的过程中容易被污染，造成培养的失败，目前尚未有关于移植后血管外膜成纤维细胞进行原代培养的报道。若采用消化法分离培养移植后血管外膜成纤维细胞，其所需的消化酶种类多，价格昂贵，操作繁琐，污染机会大，不易普及；若采用组织块法进行培养，培养的周期长，容易受培养体系的影响，特别是牛血清的质量和数量，培养基的种类等都是影响血管外膜成纤维细胞体外培养的主要因素。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法，步骤如下：
(1)取胸腹主动脉移植两周后的大鼠的移植血管，用PBS缓冲液冲洗血管；
(2)将血管放于含30％(体积百分数)FBS(胎牛血清)的DMEM/F12培养液的培养皿中，纵向剖开血管腔，剥离血管外膜；
(3)将血管外膜移入另一含30％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液的培养皿中，用小弯剪将血管剪碎；
(4)用FBS浸润培养瓶底面；在培养瓶铺入组织块之前，先用FBS浸润培养瓶底面，组织块在3天左右即可长出细胞，相比不进行浸润处理，细胞长出时间提前了1-2天左右。
(5)将培养皿中的培养液及剪碎后的血管组织块吸入经FBS浸润后的培养瓶中，将组织块均匀铺在培养瓶的底部；
(6)倾斜培养瓶，将其中的培养液吸出弃掉，再将血管组织块密度均匀的摊平于培养瓶底部，组织块的间隔为4-6mm；优选为5mm；组织块的间隔对于细胞培养的效果影响很大，若组织块的间隔过小，则培养的细胞会紧贴在一起，影响细胞的形态和生长速度；若组织块的间隔过大，则由于细胞存在相互促生长效应，同样也会影响细胞的生长速度。发明人在试验过程中对组织块的间隔距离进行了优化考察，结果发现，组织块的间隔为4-6mm时，原代培养的效果较佳。
(7)翻转培养瓶(底面朝上)，在另一面加入含30％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液3-4ml(保证液面高度2-3mm，没过后续培养的组织块高度)，盖上瓶盖，放入37℃培养箱中培养，3-4h后，小心翻转培养瓶(培养液勿将组织块冲起)后静置培养瓶，以助其贴壁生长，继续培养至5-7天，细胞长满培养瓶；需要说明的是，培养液的加入量也需要进行优化考察，若培养液的加入量过少，则无法满足细胞生长的水分和营养需求；若培养液的加入量过多，则容易导致细胞漂浮，不利于细胞的贴壁培养。
(8)待细胞生长达80％融合状态时用胰酶(Typsin)消化传代，传代至3代即可实验用或冻存备用。
步骤(2)中，剥离血管外膜的方法为：将血管平铺，管腔面朝上，用弯头镊子沿血管长轴适当用力刮血管腔面，松解外膜与中膜之间的贴附，用镊子提起血管一端的外膜，轻轻剥下，完整获取整条血管外膜组织，同时去除血管内膜和中膜细胞。采用本发明的剥离血管外膜的方法，无需在显微镜下操作，操作更简单、节省时间，更好的保持组织块的活性。
步骤(3)中，用小弯剪将血管外膜剪碎成不大于1mm3的组织块。
步骤(4)中，吸取1ml的FBS浸润底面积为25cm2培养瓶。
步骤(8)中，传代用的培养液为含10％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液。
上述方法中，所述FBS为四季青胎牛血清。常规的细胞传代培养采用的是Gibicol胎牛血清；本发明所使用的四季青胎牛血清与之相比，细胞生长状态无显著差别，但降低了成本，提高了性价比。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用含30％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液进行传代培养，与传统含20％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液相比，组织块长出细胞可提前2天左右，且原代培养后的血管外膜成纤维细胞存活率更高。
(2)本发明可传代的移植血管外膜成纤维细胞原代培养方法的成功建立，原代细胞传代次数增加，不仅为实验研究节约了大量的时间和资金，而且还为体外研究移植性血管疾病等血管重塑性疾病及其分子机制，提供了更真实，更方便的实验模型。
附图说明
图1：原代培养后移植血管外膜成纤维细胞的增殖活性检测结果；移植后原代培养细胞增殖活性比较(CCK-8细胞计数试剂盒)，移植后细胞被激活，增殖能力增强，#p<0.05。
图2：原代培养后移植血管外膜成纤维细胞的迁移活性检测结果，空白对照组(A,B)成纤维细胞细胞24、48小时的划痕试验愈合慢，移植组(C,D)成纤维细胞细胞24、48小时的划痕试验愈合快，#p<0.05。
图3：原代培养后细胞表型的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实验试剂和仪器：
本发明实施例中所用到的实验试剂和材料如下：
大鼠，购自北京维通利华实验动物技术中心。
DMEM/F12培养基，购自Hyclone公司；
胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，购自四季青公司；
青霉素-链霉素溶液，购自康宁公司。
实施例1：移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法
具体方法如下：
(1)将异系胸腹主动脉移植后两周的大鼠麻醉，将其浸泡于75％酒精中2-5分钟进行消毒，消毒后，将其固定在大鼠板上，在超净工作台中，剪开皮肤、肌肉，打开腹腔，另换剪刀和镊子，用棉棒推开肠道，充分暴露手术视野，棉签钝性分离血管，剪下并取出移植血管，切勿损失血管外膜；将剪下的血管置于装有4℃PBS缓冲液的培养皿中，在培养皿中用4℃PBS缓冲液冲洗血管三次，将血管上的血污洗净(用小镊子夹住血管，用滴管吸取PBS缓冲液进行冲洗)；
(2)将血管放于含30％(体积百分数)FBS(胎牛血清)的DMEM/F12培养液的培养皿中，用小镊子夹住血管头的一侧，小直剪伸进血管，纵向剖开血管腔；采用眼科弯头镊子血管长轴适当用力刮血管腔面，松解外膜与中膜之间的贴附力。用弯头镊子提起血管一端的外膜，轻轻剥下、完整获取整条血管外膜组织，同时去除血管内膜和中膜细胞。
(3)将刮掉内膜和中膜的血管移入另一含30％FBS的DMEM/F12培养液的培养皿中，用小弯剪将血管剪碎(碎片约1mm3)；
(4)用FBS浸润培养瓶底面；在培养瓶铺入组织块之前，先用FBS浸润培养瓶底面，组织块在3天左右即可长出细胞，相比不进行浸润处理，细胞长出时间提前了2天左右。
(5)将培养皿中的培养液及剪碎后的血管组织块吸入经FBS浸润后的培养瓶中，将组织块均匀铺在培养瓶的底部；
(6)倾斜培养瓶，将其中的培养液吸出弃掉，再将血管组织块密度均匀的摊平于培养瓶底部，组织块间隔为5mm；
(7)翻转培养瓶(底面朝上)，在另一面加入含30％FBS的DMEM/F12培养液3-4ml(保证液面高度2-3mm，没过后续培养的组织块高度，既可满足细胞培养营养的需要，又不因为培养基过多产生较大浮力使组织块漂浮，影响其贴壁生长)，盖上瓶盖，放入37℃培养箱中培养，3-4h后，小心翻转培养瓶(培养液勿将组织块冲起)，静置培养。
(8)待细胞生长达80％融合状态时用胰酶(Typsin)消化,10％FBS的DMEM/F12培养液传代至3代即可实验用或冻存备用。
对比例1：
无步骤(4)，即不采用FBS浸润培养瓶底面，其余操作同实施例1。
对比例2：
将步骤(2)、(3)和(7)中的FBS的体积分数调整为20％，其余操作同实施例1。
对比例3：
将步骤(2)、(3)和(7)中的FBS的体积分数调整为35％，其余操作同实施例1。
对比例4：
将步骤(7)调整为：向培养瓶中加入含30％FBS的DMEM/F12培养液，使培养液没过组织块，放入37℃培养箱中培养，其余操作同实施例1。
对比例5：
将步骤(7)中加入DMEM/F12培养液后液面高度调整为1mm，其余操作同实施例1。
对比例6：
将步骤(7)中DMEM/F12培养液后液面高度调整为4mm，其余操作同实施例1。
对比例5中，由于DMEM/F12培养液加入量过少，无法满足细胞生长的水分和营养需求，导致细胞生长缓慢；对比例6中，由于DMEM/F12培养液加入量过多，导致细胞漂浮，不利于细胞的贴壁生长。
效果试验：
1.原代培养后细胞增殖活性的检测：
采用CCK-8细胞计数试剂盒(购自碧云天生物公司)检测本发明实施例1原代培养后的移植血管外膜成纤维细胞的增殖活性，以未做移植的大鼠胸主动脉外膜原代培养作空白对照，操作步骤、培养方法同前。
具体步骤如下：
(1)取对数生长期的细胞，用0.25％的胰酶将细胞消化，用含10％FBS的DMEM/F12培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/ml；
(2)接种于96孔板中，每孔100μl，静置培养48h；
(3)血清饥饿24h使细胞进入生长静止期；
(4)含10％血清的DMEM/F12培养基，继续培养24h,每种血清浓度设六个复孔；
(5)每孔加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1小时；
(6)清除气泡后用酶标仪在450nm测定吸光度。
结果如图1所示，由图1可以看出，本发明实施例1原代培养的移植后血管外膜的成纤维细胞的增殖活性明显高于空白对照组。
2.原代培养后细胞迁移能力的检测
采用划痕法检测本发明实施例1原代培养后细胞迁移能力，以未做移植的大鼠胸主动脉外膜原代培养作空白对照，操作步骤、培养方法同前；具体操作过程如下：
(1)用记号笔在6孔板背面均匀画数条横线，间隔约1cm；
(2)取对数生长期的细胞，用0.25％的胰酶将细胞消化，用含10％FBS的DMEM/F12培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml；
(3)接种于6孔板内，静置培养24h达到约90％融合；
(4)用200μl灭菌吸头垂直于6孔板背面的横线做划痕；
(5)用PBS洗3次以去除划掉的细胞；
(6)加入含1％FBS的DMEM/F12培养基继续培养；
(7)在倒置显微镜下于0小时、24小时和48小时照相；
(8)计算划痕不同时间点的愈合速率。
结果分析：结果使用病理图像分析软件(Image-Pro Plus 5.0 software)分析并计算愈合速率。愈合速率＝(初始划痕宽度－相应时间点划痕宽度)/初始划痕宽度×100％
结果如图2所示，由图2可以看出，本发明实施例1原代培养的移植后血管外膜的成纤维细胞(图中的Tran组)的迁移活性明显高于空白对照组(图中的Con组)。
3.原代培养后细胞表型的检测
采用免疫荧光染色法检测本发明实施例1原代培养后的细胞表型，以未做移植的大鼠胸主动脉外膜原代培养作空白对照，操作步骤、培养方法同前。
取第3代成纤维细胞进行免疫荧光染色鉴定。待细胞融合后，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/ml，接种于预置细胞爬片的24孔板内，培养24小时后取出细胞爬片进行免疫荧光染色。
(1)PBS洗，5min×2次；
(2)新鲜配制4％多聚甲醛室温固定15min；0.5％TritonX100PBS室温通透20min
(3)PBS洗，5min×3次；
(4)正常山羊血清37℃封闭30min；
(5)弃去山羊血清，滴加适当比例稀释的一抗(vimentin和α-smooth actin)，37℃孵育2小时或者4℃过夜；
(6)PBS洗，5min×3次；
(7)滴加TRITC或FITC标记二抗，37℃孵育1小时；
(8)PBS洗，5min×3次；
(9)DAPI(终浓度5μg/ml)复染，室温2～3min；
(10)PBS洗，5min×2次；
(11)抗淬灭剂封片。
结果判定：在荧光显微镜下拍照观察结果，细胞胞核呈现蓝色荧光，而阳性细胞胞浆可见红色或绿色荧光。免疫荧光染色结果使用病理图像分析软件(Image-Pro Plus 5.0software)分析。随机选取8个高倍视野，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。
结果如图3所示，由图3可以看出，本发明实施例1原代培养的移植后血管外膜的成纤维细胞的表型(细胞的功能和特点)与空白对照组相比发生改变。移植后原代培养的细胞vimentin、α-SMA染色阳性，对照组仅vimentin阳性。说明移植后原代培养的细胞被激活，已经具有了平滑肌细胞的特性，增殖能力和迁移能力增强。
将本发明实施例1和对比例1-3原代培养方法进行比较，结果见表1。
表1：

Claims (8)

1.一种移植后血管外膜成纤维细胞的原代培养方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取胸腹主动脉移植两周后的大鼠的移植血管，用PBS缓冲液冲洗血管；
(2)将血管放于含30％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液的培养皿中，纵向剖开血管腔，剥离血管外膜；
(3)将血管外膜移入另一含30％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液的培养皿中，用小弯剪将血管剪碎；
(4)用FBS浸润培养瓶底面；
(5)将培养皿中的培养液及剪碎后的血管组织块吸入经FBS浸润后的培养瓶中，将组织块均匀铺在培养瓶的底部；
(6)倾斜培养瓶，将其中的培养液吸出弃掉，再将血管组织块密度均匀的摊平于培养瓶底部，组织块间隔为4-6mm；
(7)翻转培养瓶，在另一面加入含30％(体积百分数)FBS的DMEM/F12培养液，盖上瓶盖，放入37℃培养箱中培养，3-4h后，翻转培养瓶后静置培养瓶，以助其贴壁生长，继续培养至5-7天，细胞长满培养瓶；
(8)待细胞生长达80％融合状态时用胰酶消化传代，传代至3代即可实验用或冻存备用。
2.如权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤(2)中，剥离血管外膜的方法为：将血管平铺，管腔面朝上，用弯头镊子沿血管长轴刮血管腔面，松解外膜与中膜之间的贴附，用镊子提起血管一端的外膜，轻轻剥下，完整获取整条血管外膜组织。
3.如权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，用小弯剪将血管剪碎成不大于1mm3的血管组织块。
4.如权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤(4)中，吸取1ml的FBS浸润底面积为25cm2培养瓶。
5.如权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤(6)中，组织块间隔为5mm。
6.如权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤(7)中，加入DMEM/F12培养液后的液面高度为2-3mm。
7.如权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤(8)中，传代用的培养液为含10％FBS的DMEM/F12培养液。
8.如权利要求1-7任一项所述的原代培养方法，其特征在于，DMEM/F12培养液中所用的FBS为四季青胎牛血清。
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