CN103409363A - 感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法。旨在建立感光前体细胞与视网膜感光细胞变性视网膜组织的共培养体系。该方法包括如下步骤：制备胚眼来源的感光前体细胞层；制备变性视网膜神经细胞层；将所得变性视网膜神经细胞层放置在感光前体细胞层上；插入式细胞培养皿的下室制备视网膜色素上皮层；构建体外视网膜组织与细胞的共培养体系，放置37℃，5℅CO₂培养箱中培养。利用本发明方法在体外可直接观察和检测宿主细胞和移植细胞的生物特性和细胞结构、移植细胞与宿主细胞之间突触联系、移植细胞与宿主细胞的染色质构象重建、跟踪移植胚眼来源的感光前体细胞的存活、增殖、分化和功能重建的轨迹。

Description

感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法

技术领域

 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法。

背景技术

 细胞培养是将细胞置于体外条件下进行生长和繁殖，并可直接观察其细胞的形态结构和细胞生长周期等生命活动。培养的细胞独立生存于人工模拟的环境内，但该环境与真实的体内环境相比有很大差异。为了能够建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外培养环境与体内环境相吻合，使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，人们在细胞培养技术的基础上创建了细胞共培养技术。细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞共同培养在同一环境中的技术，目前主要有两种方法：① 直接共培养体系，即将两种或两种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触；② 间接共培养体系，即将两种或两种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。细胞共培养技术，具有更好地反映体内环境的优点，该方法已被广泛应用在现代细胞研究中。

目前，在胚胎干细胞治疗致盲性眼病的基础与临床转化研究中，两种或两种以上细胞间的共培养远远不能满足实验的要求。

发明内容

为了模拟体内环境条件，直接观察和检测胚眼来源的感光前体细胞移植后，跟踪移植胚眼来源的感光前体细胞的存活、增殖、分化和功能重建的轨迹，本发明提供了一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

 设计一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，包括如下步骤：

（1）在插入式细胞培养皿的上室的物质交换膜上制备胚眼来源的感光前体细胞层；

（2）制备变性视网膜神经细胞层；

（3）将上步所得变性视网膜神经细胞层的内层即内界膜朝上，变性残留的部分光感受器细胞层向下放置在步骤（1）中所述的感光前体细胞层上；        

（4）在所述插入式细胞培养皿的下室制备视网膜色素上皮层；

（5）构建体外视网膜组织与细胞的共培养体系，在插入式细胞培养皿中添加体外共培养所需的培养液至变性视网膜神经细胞层上面4～8mm，放置37℃， 5℅CO₂培养箱，每48～60小时换一次培养液。

在上述步骤（1）中可采用如下具体方法制备感光前体细胞移植层：

将经鉴定和纯化合格的胚眼来源的视网膜感光前体细胞进行荧光标记，根据眼球种属来源和移植对象的不同制备出不同浓度的细胞悬液，即小鼠制备出含有0.25～0.5×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、大鼠制备出含有1×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、新西兰兔和香猪制备出含有1×10⁷个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、猕猴和人制备出含有1～1.2×10⁸个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液；取一个移植单位的所述细胞悬液均匀的对应的放置在与其细胞数目相一致的插入式细胞培养皿上室的物质交换膜上，放置37℃，5℅CO₂培养箱内培养60分钟后，使感光前体细胞均匀排列至8～10层。

在上述步骤（2）中，可采用如下具体方法制备变性视网膜神经细胞层：

在5秒内快速完整的取出离体眼球的变性视网膜神经层，并将该视网膜神经层以视盘为中心切成四瓣形，切口从视网膜的周边部开始至赤道部内1～2mm，将视网膜神经细胞层的内层朝上、变性残留的部分光感受器细胞层向下放置在所述插入式细胞培养皿的上室孔内物质交换膜的感光前体细胞上。

上述胚眼来源的感光前体细胞与所述变性视网膜神经细胞属于同一个种属。

在上述步骤（4）中，可采用如下具体方法制备视网膜色素上皮层：

选择与实验组种属相同遗传背景的胚眼来源视网膜干细胞诱导定向分化的视网膜色素上皮细胞，通过各项微生物检测合格和细胞活性检测合格后，按照不同的实验对象，获取相匹配数量的视网膜色素上皮细胞，选择合适的插入式细胞培养皿，将细胞的放置于所述插入式培养皿的下室。

在上述步骤（4）中，所述视网膜色素上皮细胞的数量根据眼球种属来源和移植对象的不同而有异，即小鼠为1～1.5×10⁴个，大鼠为2～2.5×10⁴个，新西兰白兔和香猪均为2～2.5×10⁵个，猕猴和人均为2～2.5×10⁶个。

上述插入式培养皿的上室内径为5～25mm，该上室内径与实验动物离体眼球或遗体捐献眼球直径的大小相匹配。

上述感光前体细胞移植后第一周内所使用的培养液为：

（1）小鼠来源的感光前体细胞选择培养基：含有N2/B27的Neurobasal培养液内加入10 ng/ml bFGF, 50 nM DHA, 2 μM RA, 10μM DAPT，1× 青链霉素；

（2）人来源的感光前体细胞选择培养基：Neurobasal培养基内加入20ng/ml b FGF，10× B27，2μM RA（视黄酸）, 50 nM DHA（二十二碳六烯酸）,1× Glutamax，1×青链霉素。

上述感光前体细胞移植后第一周后所使用的培养液为：

（1）小鼠来源的感光前体细胞选择：含有B27的Neurobasal培养液，加入10 ng/ml BDNF，10 ng/ml IGF-1, and 10 ng/ml NGF，1×青链霉素；

（2）人来源的感光前体细胞选择：Neurobasal培养基，20ng/ml b FGF，20ng/ml EGF，10× B27，0.1mM非必需氨基酸，40ug/ml视黄酸，1×青链霉素。

本发明具有积极有益的效果：

（1）本发明建立体外胚眼来源的感光前体细胞与视网膜感光细胞变性视网膜组织的共培养体系，提供胚眼来源的感光前体细胞移植后，在体外可直接观察和检测宿主细胞和移植细胞的生物特性和细胞结构、移植细胞与宿主细胞之间突触联系、移植细胞与宿主细胞的染色质构象重建、跟踪移植胚眼来源的感光前体细胞的存活、增殖、分化和功能重建的轨迹。

（2）建立了一个有价值的体外模拟干细胞移植治疗视网膜感光细胞变性疾病的试验方法及实验平台。 

附图说明

图1为感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法的具体步骤示意图；

图2为体外感光前体细胞与变性视网膜组织共培养体系的剖面示意图；

图3为正常视网膜和变性视网膜的细胞示意图，其中，左图为正常视网膜的细胞结构，右图为变性视网膜的细胞结构；

图4为本发明感光前体细胞分化的新感光细胞与双极细胞形成信号传递通路的示意图及其局部放大图，其中，右图为放大图；

图5为变性视网膜组织培养结果：其中左图为以本发明方法培养6周后视网膜的光镜照片，右图为对照组视网膜的光镜照片。

在图中，1为在插入式细胞培养皿的上室物质交换膜上制备感光前体细胞层，2为制备变性视网膜神经细胞层，3为将变性视网膜神经细胞层的内层即内界膜朝上、变性残留的部分光感受器细胞层向下放置在感光前体细胞层上，4为在插入式细胞培养皿的下室制备视网膜色素上皮层，5为构建体外视网膜组织与细胞的共培养体系，6为变性的视网膜组织，7为感光前体细胞，8为视网膜色素上皮细胞，9为神经节细胞层，10为内核层，11为光感受器细胞层，12为色素上皮细胞层，13为光感受器细胞层，14为内核层，15为神经节细胞层。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的检测、鉴定、纯化方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：一种胚眼来源的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养的方法,参见图1、图2，包括如下步骤：

（1）制备胚眼来源的感光前体细胞层

通过对胚眼来源的视网膜感光前体细胞7严格按照国家胚胎干细胞培养和纯化标准进行一系列的微生物病原菌和内源性毒素的检测，所有指标完全合格、细胞活性达到标准、纯化合格后，对感光前体细胞7进行荧光标记；根据眼球种属来源和移植对象的不同制备出不同浓度的细胞悬液，小鼠制备出含有0.25～0.5×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、大鼠制备出含有1×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、新西兰兔和香猪制备出含有1×10⁷个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、猕猴和人制备出含有1～1.2×10⁸个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液，取一个移植单位的细胞悬液均匀的放置于在与细胞数目相一致的插入式细胞培养皿上室的物质交换膜上，放置37℃，5℅CO₂培养箱内培养60分钟后，显微镜下观察细胞的密度，要求感光前体细胞6均匀排列至8～10层。

荧光标记感光前体细胞有两种标记方法：

（1）绿色荧光标记：感光前体细胞转染GFP，携带绿色荧光标记；

（2）红色荧光标记：感光前体细胞用Dil标记为红色荧光。

插入式细胞培养皿上室的选择：根据实验动物离体眼球或遗体捐献眼球直径的大小决定选择插入式培养皿上室内径的大小，一般成年小鼠眼球直径为4mm，可选上室内径为5mm；成年大鼠可选上室内径为7mm；猕猴或人的视网膜可选择上室内径为25mm。

放置37，CO₂培养箱60分钟后观察细胞的密度，要求细胞均匀排列，如果细胞出现不均匀堆积现象，把细胞培养液轻轻吹开，静止30分钟后再观察。按照细胞数量与上室的面积计算，视网膜感光前体细胞应该在上室内排列8～10层，这样符合正常视网膜光感受器细胞的解剖层次。

（2）制备视网膜神经细胞层

选择不同时期、不同类型的视网膜感光细胞变性实验动物的离体眼球或遗体捐献眼球的变性视网膜，在5秒内快速完整的取出离体眼球的视网膜神经层。

取出视网膜神经细胞层的具体步骤：

1）清洁眼球：首先用预冷的pH7.4的磷酸盐缓冲液充分冲洗眼球；根据眼球来源，选择相应的抗生素加入预冷的生理盐水内充分冲洗眼球，如使用庆大霉素则每毫升生理盐水内含有20IU；眼球放在装有冰块的眼球固定器上，去除眼球表面的所有血样附属物和其他附属的组织，保留四条直肌。因为来自动物或遗体捐献的眼球，眼球表面有许多血样附属物和其他附属的组织，为了防止组织细胞之间的污染，小心用弯剪刀仔细剪除眼球表面的组织和血迹附属物，保留四条直肌。因为眼球壁较薄，小动物眼球壁大约0.6～0.8mm，大动物眼球壁大约0.8～1.2mm，人的眼球壁大约1.0～1.5mm，切记不要把眼球壁剪破。该步骤要求动作准确迅速，确保在0～4℃低温条件下操作，以保证眼球各种细胞的活性。每一个眼球，需要更换一次眼球固定器的塑料覆盖膜，以防污染。

2）固定眼球：将清洁处理过的实验动物来源的眼球或遗体捐献的眼球的四条直肌固定在与眼球大小相应的装有冰块的眼球固定器上。为了防止污染，每一只眼球在冲洗后，更换一张眼球固定器的塑料纸。

在固定眼球时，千万注意不要强行牵拉四条直肌，因为直肌巩膜附着点的巩膜厚度大约为0.3mm，以免造成眼球破裂。选择大小合适的眼球固定器，以眼球的直径大小为依据来选择。如果眼球固定器大小不适宜，切开眼球壁的时候，严重者可造成眼内容物的脱出，也可带来造成操作的不便。

3）切开眼球壁：在解剖显微镜下，用视网膜取出器C端的一次性刀片在小鼠、大鼠或荷兰猪的眼球，沿角巩膜缘后1mm切开全层的眼球壁360度，大型实验动物小香猪、家兔、狗、猕猴等大型实验动物的眼球，或遗体捐献的眼球，沿眼球的平坦部（角膜缘后4mm）切开全层眼球壁360度。

一次性刀片必须确保其刀刃的锋利，以确保手术时避免对眼球施加任何的压力，避免重复使用，以防治污染。根据不同眼球壁的厚度，掌握好切开球壁的深度，一般成年小动物眼球壁厚度大约0.6～0.8mm，大动物眼球壁厚度大约为0.8～1.2mm，人的眼球壁厚度大约为1.0～1.5mm，同一类眼球不同发育年龄其眼球壁的厚度也有所差异，应注意。该步骤必须在显微镜下仔细操作，不要切开的过浅或过深，二者均可造成眼球组织细胞的损伤。小动物眼球壁切开是沿着角膜缘外1mm切开，大动物眼球壁切开是在角膜缘后4mm处切开，预先用标记笔画出所要切开的部位，以免错位，造成视网膜和眼内组织的损伤。

4)清除眼内容物：掀起眼球的前部，用视网膜取出器B端的视网膜一次性取出勺，沿着眼球壁的切口进入眼内，把晶状体和玻璃体轻轻托出。

操作时，小动物用视网膜取出勺从眼球壁的切口沿球壁的弧形进入，轻轻将晶状体和玻璃体一起托出；大动物分两步，先用视网膜取出勺沿眼球壁切口水平进入将晶状体托出，然后沿球壁的弧形进入将玻璃体轻轻托出。视网膜取出勺进入眼内操作时，动作一定要轻柔，切记不可使用其搅动眼内物，以免牵拉视网膜，造成视网膜人为的脱离。

5)取出视网膜神经层：此时剪除眼球的前部组织，用无齿镊轻轻夹住眼球壁呈灰白色的内层，沿眼球壁切口的全周给于充分的分离，分离深度大约5mm左右，用视网膜取出勺沿球壁的弧度进入视网膜下腔，取出完整的视网膜神经细胞层。

由于眼球离体后，尤其是人体捐献的眼球，离体时间越长，视网膜神经层越容易与视网膜色素上皮层脱离，该步骤操作时动作一定要轻柔，沿着视网膜下腔的自然弧度进入，将全层视网膜神经层取出。根据眼球的大小，选择相适应直径的视网膜取出勺。调整视网膜取出勺恰当的角度后，沿着眼球壁的自然弧度进入视网膜下腔，切记操作动作不要粗暴，这一步最容易造成视网膜取出不完全或视网膜呈碎片状。识别视网膜的内层：用视网膜取出勺取出视网膜神经上皮层，呈灰白色球形，特别注意内界膜在球的内层，感光细胞层为球的外层，用两把无齿镊轻轻夹持视网膜锯齿缘的边，注入细胞培养液至视网膜神经细胞层的半球体，用微型剪刀将视网膜神经层围绕视盘切成四瓣形，切口从视网膜的周边部开始至赤道部1～2mm。

（3）视网膜神经细胞层的内层（内界膜）朝上，变性残留的部分光感受器细胞层向下覆盖插入式细胞培养皿在上室内物质交换膜的感光前体细胞之上。

（4）制备视网膜色素上皮层：

选择与实验组种属相同遗传背景的胚眼来源视网膜干细胞诱导定向分化的视网膜色素上皮细胞8，通过各项微生物检测合格和细胞活性检测合格后，取一定的视网膜色素上皮细胞8数量，选择合适大小的插入式细胞培养皿，均匀的放置在其培养皿的下室，置37℃，5℅CO₂培养箱内培养2小时，观察细胞密度在80%左右。

对胚眼来源的视网膜色素上皮细胞8细胞严格按照国家标准进行一系列的微生物病原菌和内源性毒素的检测，所有指标完全合格后，细胞活性达到标准，方可使用。

确定移植视网膜色素上皮细胞8的数量：每一个视网膜内含有光感受器细胞分别为1.1～1.25亿个视杆细胞，630～680万个视锥细胞，而每一个视网膜色素上皮细胞8要负责45个光感受器细胞的新陈代谢，并维持其正常的功能。一般情况下，人的体外共培养模型需要视网膜色素上皮细胞2.6×10⁶个，小鼠需要1×10⁴个，视网膜色素上皮细胞8过多或过少均会影响实验效果。

视网膜色素上皮细胞8功能的维持：视网膜色素上皮细胞8对维持光感受器的功能起着至关重要的作用。每一个正常的视网膜色素上皮细胞8每天需要消化4000个光感受器细胞更新的盘膜并代谢排除其废物，维持视网膜光感受器的正常功能。在体外培养体系中，需要维持视网膜色素上皮细胞8的功能正常，以确保移植感光前体细胞 7的存活、分化、迁移和功能重建的进行。要求视网膜色素细胞8在插入式细胞培养皿的下室内的每周传代一次，保证视网膜色素上皮细胞8功能的稳定性。

（5）构建体外感光前体细胞与视网膜培养体系：

完成上述三个步骤后，再将装有视网膜感光前体细胞7和变性视网膜组织6的上室放置在插入式细胞培养皿内。一个模拟视网膜感光前体细胞7移植到视网膜下腔治疗视网膜感光细胞变性的体外模型已建立。添加体外共培养所需的培养基至视网膜上面5～6mm，放置37℃，5℅CO₂培养箱，每两天半换一次培养液。

所述感光前体细胞移植后第一周内所使用的培养液为下列培养液：

（1）小鼠来源的感光前体细胞选择培养基：含有N2/B27的Neurobasal培养液内加入10 ng/ml bFGF, 50 nM DHA, 2 μM RA, 10μM DAPT，1× 青链霉素；

（2）人来源的感光前体细胞选择培养基：Neurobasal培养基内加入20ng/ml b FGF，10× B27，2μM RA, 50 nM DHA,1× Glutamax，1×青链霉素。

该类培养液是促进视网膜感光前体细胞在体外细胞与组织培养体系中向感光细胞分化。

所述感光前体细胞移植后第一周后所使用的培养液为：

（1）小鼠来源的感光前体细胞选择：含有B27的Neurobasal培养液，加入10 ng/ml BDNF，10 ng/ml IGF-1, and 10 ng/ml NGF，1×青链霉素；

（2）人来源的感光前体细胞选择：Neurobasal培养基，20ng/ml b FGF，20ng/ml EGF，10× B27，40ug/ml视黄酸，0.1mM非必需氨基酸，1×青链霉素。

该类培养液在体外细胞与组织培养体系中的作用是维持视网膜感光细胞的存活。

在图3中，变性视网膜与正常视网膜对比显示变性视网膜的感光细胞11的数目减少，外节消失，色素上皮细胞12消失。

在图4中，显示在该发明培养系统中，感光前体细胞7分化为感光细胞的过程模式图，新的感光细胞11与内核层10中的双极细胞形成信号传递。

图5中的左图为本发明方法培养六周后的光镜照片，按照上述实施例中的培养方法将C57BL/6J小鼠胚眼来源的感光前体细胞7放在上室，感光前体细胞7上面放入出生12天的Crx^-/-小鼠变性视网膜组织6神经细胞层（节细胞层向上），把C57BL/6J小鼠胚眼来源的视网膜干细胞定向诱导分化为色素上皮细胞8置入培养皿的下室，培养6周后，可以看到完整的视网膜结构，即包括光感受器细胞层13、内核层14、节细胞层15；图5中的右图为试验对照，其试验方法是仅把出生12天的Crx^-/-同窝小鼠变性视网膜组织6放在相同的培养皿的上室内，变性视网膜组织6下面没有放入感光前体细胞，下室内不置放色素上皮细胞8，其它与上述方法相同，培养6周后，变性视网膜组织6的感光细胞11全部变性消失，内核层14的细胞排列紊乱，节细胞15层变薄，整个视网膜细胞结构紊乱。

从上述实施例可以看出：本发明建立了体外建立胚眼来源的感光前体细胞与变性视网膜组织的共培养体系，提供胚眼来源的感光前体细胞移植后，可直接观察和检测宿主细胞和移植细胞的生物特性和细胞结构、移植细胞与宿主细胞之间突触联系、移植细胞与宿主细胞的染色质构象重建、跟踪移植胚眼来源的感光前体细胞的存活、增殖、分化和功能重建的轨迹。建立了一个有价值的体外模拟干细胞移植治疗视网膜感光细胞变性疾病的试验方法及实验平台。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，包括如下步骤：

（1）在插入式细胞培养皿的上室物质交换膜上制备胚眼来源的感光前体细胞层；

（2）制备变性视网膜神经细胞层；

（3）将上步所得变性视网膜神经细胞层的内层即内界膜朝上，变性残留的部分光感受器细胞层向下，放置在步骤（1）中所述的感光前体细胞层上；        

（4）在所述插入式细胞培养皿的下室制备视网膜色素上皮层；

（5）构建体外视网膜组织与细胞的共培养体系，在所述插入式细胞培养皿中添加体外共培养所需的培养液至变性视网膜神经细胞层上面4～8mm，放置37℃，5℅CO₂培养箱，每48～60小时换一次培养液。

2.根据权利要求1所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，在所述步骤（1）中制备感光前体细胞移植层的具体方法如下：

将经鉴定和纯化合格的胚眼来源的视网膜感光前体细胞进行荧光标记，根据眼球种属来源和移植对象的不同制备出不同浓度的细胞悬液，即小鼠制备出含有0.25～0.5×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、大鼠制备出含有1×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、新西兰兔和香猪制备出含有1×10⁷个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、猕猴和人制备出含有1～1.2×10⁸个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液；取一个移植单位的所述细胞悬液均匀的放置在与其细胞数目相一致的插入式细胞培养皿上室的物质交换膜上，放置37℃，5℅CO₂培养箱内培养60分钟后，使感光前体细胞均匀排列至8～10层。

3.根据权利要求1所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，制备变性视网膜神经细胞层的具体方法如下：

在5秒内快速完整的取出离体眼球的变性视网膜神经层，并将该视网膜神经层以视盘为中心切成四瓣形，切口从视网膜的周边部开始至赤道部内1～2mm，将视网膜神经细胞层的内层朝上、变性残留的部分光感受器细胞层向下放置在所述插入式细胞培养皿的上室孔内物质交换膜的感光前体细胞上。

4.根据权利要求3中所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，所述胚眼来源的感光前体细胞与所述变性视网膜神经细胞层属于同一个种属。

5.根据权利要求1所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，制备视网膜色素上皮层的方法如下：

选择与实验组种属相同遗传背景的胚眼来源视网膜干细胞定向诱导分化为视网膜色素上皮细胞，通过各项微生物检测合格和细胞活性检测合格后，按照不同的实验对象，获取相匹配数量的视网膜色素上皮细胞，选择合适的插入式细胞培养皿，将所述视网膜色素上皮细胞放置在该插入式培养皿的下室。

6.根据权利要求5所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，所述视网膜色素上皮细胞的数量根据眼球种属来源和移植对象的不同而有异，即小鼠为1～1.5×10⁴个，大鼠为2～2.5×10⁴个，新西兰白兔和香猪为2～2.5×10⁵个，猕猴和人为2～2.5×10⁶个。

7.根据权利要求1所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，所述插入式培养皿的上室内径为5～25mm，该上室内径与实验动物离体眼球或遗体捐献眼球直径的大小相匹配。

8.根据权利要求 1 所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，所述感光前体细胞与视网膜在体外共培养的第一周内所使用的培养液为：

（1）小鼠来源的感光前体细胞选择培养基：含有N2/B27的Neurobasal培养液内加入10 ng/ml bFGF, 50 nM DHA, 2 μM RA, 10μM DAPT，1× 青链霉素；

（2）人来源的感光前体细胞选择培养基：Neurobasal培养基内加入20ng/ml b FGF，10× B27，2μM RA, 50 nM DHA,1× Glutamax，1×青链霉素。

9.根据权利要求 1 所述的感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，其特征在于，所述感光前体细胞与视网膜在共培养第一周后所使用的培养液为：

（1）小鼠来源的感光前体细胞选择：含有B27的Neurobasal培养液，加入10 ng/ml BDNF，10 ng/ml IGF-1, and 10 ng/ml NGF，1×青链霉素；

（2）人来源的感光前体细胞选择：Neurobasal培养基，20ng/ml b FGF，20ng/ml EGF，10× B27，1mM RA，40ug/ml视黄酸，0.1mM非必需氨基酸，1×青链霉素。

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