CN107058225A

CN107058225A - 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法

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Publication number: CN107058225A
Application number: CN201710074106.XA
Authority: CN
Inventors: 关方霞; 马珊珊; 邢衢; 王欣欣; 黄团结; 孟楠; 杨波
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: CN107058225B

Abstract

本发明公开了一种复合诱导培养基，包括DA、DB、DC三种分化培养液，采用该复合诱导培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法是：首先采用DA分化培养液对脐带间充质干细胞预诱导2天；然后采用DB分化培养液分化诱导1天；最后采用DC分化培养液维持诱导1天；观察诱导后的神经元样细胞形态特征，检测诱导后神经分化相关基因mRNA水平，检测诱导神经元样细胞神经元迁移蛋白DCX、神经元特异性烯醇化酶NSE表达情况：DCX表达阳性者为神经前体细胞,NSE表达阳性者为神经元样细胞。本发明将诱导过程分为三阶段，每阶段诱导时采用不同的培养基，诱导时间短，诱导效率高，诱导分化的神经元样细胞存活稳定，移植后无排斥。

Description

一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞神经分化技术，尤其是涉及一种复合诱导培养基，本发明还涉及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成有较高存活水平的神经元样细胞的方法。

背景技术

临床上，中枢神经系统损伤会导致脑、脊部神经细胞大量死亡，神经功能永久缺失，且很难自我修复。鉴于目前快速提取神经干细胞仍未有稳定的解决方案，因此对其他来源的干细胞进行诱导以获取数目稳定、功能完备的神经元样细胞的策略被科学界寄予厚望。

较其他来源干细胞，脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymalstem cell, HUCMSC)具有采集痛苦小、自我更新快、增殖能力强、无免疫排斥、无伦理争议等特点。如何高效定向诱导HUCMSC成神经元样细胞，对于神经环路、突触连接的重塑和恢复有巨大的临床应用价值。

细胞分化是一种动态、可逆的程序性重调，合适的诱导微环境可促进成神经分化基因有序表达，启动相关通路，导致MSC跨系分化。现有神经分化策略主要包括：抗氧化剂诱导、生长因子诱导、中药诱导、细胞共培养诱导等方案。常用的分化方案虽能诱导神经元样细胞产生，但仍有不足：（1）经典的高浓度抗氧化剂，虽可短时间内通过细胞骨架结构肌动蛋白断裂、收缩导致MSC呈现锥样末端膨大等特征，但亦伴随着细胞存活数目少、效率有限、有致癌转化风险等诸多问题，这与诱导组分作用浓度、时间和固有细胞毒性关系紧密；学者Hofstetter发现，MSCs经5 mM β-ME诱导48小时后膜片钳电生理检测结果显示出诱导的神经元样细胞没有表达钠、钾电压门控通道，不产生动作电位，属不成熟的神经元。（2）单一应用细胞因子可通过靶源性改善神经营养因子供给重建轴突，提高神经元样细胞存活，但诱导时间长、效率低。（3）学者姚晓黎认为，部分中药诱导MSC分化过程存在逆转化现象，诱导时间仍需摸索。（4）细胞共培养方案对实验操作人员技术和环境要求高，后期细胞移植仍需流式筛选分离。因此，组分合理的诱导策略是决定转归效率的关键因素。

发明内容

本发明的目的是针对现有诱导组分或诱导策略存在的不足，提供一种组分合理、高效稳定的复合诱导培养基，本发明还提供采用该培养基在较短时间内将脐带间充质干细胞诱导成存活水平较高的神经元样细胞的方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的复合诱导培养基，包括DA、DB、DC三种分化培养液，所述DA、DB、DC三种分化培养液的配制方法分别为：

DA分化培养液是由每1000ml DMEM-LG培养基中添加40ml FBS和10μg bFGF组成，其中bFGF的终浓度达10 ng/ml；

DB分化培养液是由每1000ml的DMEM-LG培养基中添加50ml Cerebrolysin、4mgForskolin、5mg Insulin、0.36mg Hydrocortisone、1.86g KCl、7g NaCl、2.2g NaHCO₃、190mg NaH₂PO₄、95mg MgCl₂、222mg CaCl₂、1.8g D-glucose组成；其中各组分的终浓度达到5% Cerebrolysin、10μM Forskolin、5 μg/ml Insulin、1 μM hydrocortisone、2.5mM KCl、120 mM NaCl、26mM NaHCO₃、1.25 mM NaH₂PO₄、1 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、10 mM D-glucose；

DC分化培养液是由每1000ml的DMEM-F12培养基中添加10μg bFGF、10μg EGF、10ml100XN2、20ml 50X B27、0.3g L-glutamine组成；其中各组分的终浓度达到：10 ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、1X N2、1X B27、2mM L-glutamine；

将DA、DB、DC三种分化培养液分别混匀并经过滤除菌后分别保存待用。

采用本发明制备的复合诱导培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法如下：

首先将脐带间充质干细胞分离、培养，当汇聚度达到50%时，经胰酶消化、离心收集细胞；并用DMEM-LG培养基制备成细胞悬液后，调整细胞密度至2×10⁵ ml^-1；然后接种、恒温培养至脐带间充质干细胞至60%时，按三个阶段进行分化诱导：首先采用DA分化培养液对脐带间充质干细胞预诱导2天；然后采用DB分化培养液分化诱导1天；最后采用DC分化培养液维持诱导1天；观察诱导后的神经元样细胞形态特征，检测诱导后神经分化相关基因mRNA水平，检测诱导神经元样细胞神经元迁移蛋白DCX、神经元特异性烯醇化酶NSE表达情况：DCX表达阳性者为神经前体细胞, NSE表达阳性者为神经元样细胞。

本发明的优点在于：将诱导过程分为三阶段，每阶段诱导时采用不同的培养基，诱导时间短，诱导效率高，诱导分化的神经元样细胞存活稳定，移植后无排斥。其核心成分为天然提取物、细胞生长提取物、脑脊液无机盐缓冲体系,有效保证了其生物安全性。

在本发明复合诱导培养基中，

Cerebrolysin（脑活素）作为脑细胞激活剂，由动物脑蛋白水解后萃取，由于组成它的器官特异性游离氨基酸与正常脑组织恒定比例相似，且分子量低于10000，因此易透过血脑屏障，不具有抗原性。日本学者杉田之宏证明，每毫升大致相当于每克脑蛋白中的氮物质含量，能调节胞内氧化代谢、控制脑特异性蛋白质的降解；

Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）为天然二萜产物，可促进膜、细胞或组织制备液中腺苷酸环化酶cAMP含量上升，激活蛋白激酶A信号通路；

细胞因子bFGF\EGF在诱导起始中发挥了有丝分裂原、神经营养的作用；

胰岛素（Insulin）：在低糖环境下，胰岛素或类胰岛素能抑制BMP信号通路使干细胞分化为少突细胞，此过程或伴随mTOR信号通路的介导；

脑脊液缓冲体系（包含KCl、NaCl、NaHCO₃、NaH₂PO₄、MgCl₂、CaCl₂、D-glucose组分）：pH范围7.3 ~ 7.4之间，有效模拟神经元样细胞存活所需要的脑脊微环境，提高细胞存活率。

本发明的复合诱导培养基采用包含“脑细胞激活剂+细胞因子+CAMP激活剂+激素+脑脊液缓冲体系”的神经分化液DB作为核心诱导组分，诱导人脐带间充质干细胞4d后，NSE阳性细胞表达率高于“化学诱导联合生长因子”的诱导方案（P < 0.05），且DCX阳性细胞表达率低于经典的诱导策略（P < 0.05）。此外，体内验证表明采用复合诱导培养基诱导人脐带间充质干细胞得到的神经元样细胞，对TBI小鼠神经恢复有较好的效果，NSE免疫荧光结果显示：TBI小鼠脑片中人脐带源分化的神经元样细胞存活稳定，无移植排现象，安全性高。

附图说明

图1是人脐带间充质干细胞光学显微镜下形态学照片（ X 100）。

图2是人脐带间充质干细胞流式细胞鉴定结果。

图3是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导hUCMSC四天后，光学显微镜下细胞形态学照片（ X 200）。

图4 是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导hUCMSC四天后，DCX、NSE阳性细胞免疫荧光染色结果（ X 200）。

图5 是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导hUCMSC四天后，AO/PI荧光染色结果（ X 200）。

图6 是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导hUCMSC四天后，免疫组化检测移植诱导细胞在脑损伤模型小鼠海马中表达分布情况（ X 200）。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。其中采用的实验方法，若无特别说明，均为常规方法；实验所用的器具、仪器、试剂均可通过商业途径获得。

实施例1

本发明的复合诱导培养基，是由DA、DB、DC三种分化培养液组成，DA、DB、DC三种分化培养液的配制方法如下：

DA分化培养液：每1000ml的DMEM-LG（HyClone, 货号：SH30021.01B）培养基中，按原料各自特性溶解添加40ml FBS（HyClone, 货号：SH30396.03）、10 μg bFGF（Peprotech, 货号：100-18B）；

DB分化培养液：每1000ml DMEM-LG（HyClone, 货号：SH30021.01B）培养基中，按原料各自特性溶解添加50ml Cerebrolysin（EVER Neuro Pharma GmbH , 货号：H20100440）、4mgForskolin（AMQUAR, 货号：EY0022）、5mg Insulin（aladdin, 货号：I119752-15mg）、0.36mgHydrocortisone（Sigma, 货号：H0888）、1.86g KCl（Sigma, 货号：P5405）、7g NaCl（Sigma,货号：S5886）、2.2g NaHCO₃（Sigma, 货号：S5761）、190mg NaH₂PO₄（Sigma, 货号：S5011）、95mg MgCl₂（Sigma, 货号：M4880）、222mg CaCl₂（Sigma, 货号：C5670）、1.8g D-glucose（Sigma, 货号：G7021）；

DC分化培养液：每1000ml的DMEM-F12（HyClone, 货号：SH30023.01B）培养基中，按原料各自特性溶解添加10μg bFGF（Peprotech, 货号：100-18B）、10μg EGF（Gibco, 货号：PHG0311）、10ml 100X N2（Gibco, 货号：17502-048）、20ml 50X B27（Gibco, 货号：12657-029）、0.3g L-glutamine（Sigma, 货号：G6392）。

实施例2

采用实施例1配制的复合诱导培养基诱导人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）向神经元样细胞分化，其具体步骤如下：

一、人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的分离、培养

采集人脐带组织标本：脐带组织必须来源于足月剖宫产的健康产妇志愿者，检测传染性相关指标均呈阴性。采集时,应用75%酒精擦拭无菌50ml离心管外壁，去除血污后短时期内预冷生理盐水4度保存。

分离人脐带组织标本：在生物安全柜内，取新鲜脐带标本两段，每段5cm，用预冷生理盐水冲洗3次、去除血污、洗消干净。在含预冷的100 U/mL青链霉素双抗-PBS溶液的平皿中，用手术刀纵向沿脐静脉和脐动脉中间划开组织，使用无菌有齿镊和止血钳轻轻剔除脐带表面薄膜、2条动脉和1条静脉血管；沃顿胶 (WJ) 组织用生理盐水清洗干净，剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，分散转移到25cm²培养瓶中，加入3 ml含有10%胎牛血清FBS、100 U/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数5%的CO₂ 恒温孵育箱内培养。

原代细胞培养：在培养箱中培养组织块 3d 后，观察组织块的贴壁情况。当组织块贴壁良好时，则应及时使用电子移液枪缓慢吸除旧培养液，每瓶重新添加5ml新鲜DMEM-F12/FBS培养液覆盖组织块后，继续置于培养箱中培养；原代组织继续培养3d后，使用电子移液枪缓慢吸除旧培养液，并及时添加5ml DMEM-F12/FBS新鲜培养液覆盖组织块后，置于培养箱中培养；原代培养10d后，在倒置显微镜下可观察到梭形的贴壁细胞从组织块周围爬出。在保持瓶口无菌环境的条件下，用电子移液枪更换培养基。此后，每隔2d后，更换5mlDMEM-F12/FBS新鲜细胞培养基1次；当细胞密度为 80～90%时，胰蛋白酶消化后传代；

细胞传代培养：用移液枪吸取少量新鲜培养基轻轻吹打组织块，使其从瓶壁上脱落，继而转移至新培养瓶中。在旧培养瓶内加入1-2 ml 胰蛋白酶消化液，37℃消化 5min；倒置显微镜下观察到胞体回缩后，加入等体积的FBS液终止消化。转移细胞悬液到15ml离心管中，1500 rpm离心10min弃上清。然后，用1 ml培养基将细胞沉淀重悬后，置于新的培养瓶中继续培养，并标记为 P1细胞。传代2次后，光学显微镜观察对状态良好的P3细胞进行形态学观察：

沃顿胶组织培养7d后，有纺锤形细胞产生；贴壁后的hUC-MSCs呈现梭形或多角形，增殖汇合度达80%以上时，群落呈方向性、旋涡状聚集，如图1所示。

二、人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的细胞表面抗原检测

取P3代HUC-MSC细胞用2.5 g/L的胰酶消化离心后，预冷PBS润洗重悬为1×10⁷ml^-1的单细胞悬液，分别加入5 μl CD29-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、CD34-APC、CD45-PE、HLA-DR-PE单克隆抗体，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测相应细胞表面抗原。

结果显示：CD29、CD44、CD90、HLA-ABC的表达率高于98%，且CD34、CD45、HLA-DR表达率低于1%，即分离培养的细胞属于人脐带间充质干细胞，如图2所示。

三、人脐带间充质干细胞体外成神经分化：

当P3代hUC-MSCs汇聚度达50%时，2.5 g/L胰酶消化、1500 rpm离心10min收集细胞；用DMEM-LG培养基制备细胞悬液，Countess®自动细胞计数仪调整细胞密度为2×10⁵ ml^-1，在放置细胞爬片的48孔板内，每孔接种500μl，37 ℃、体积分数5%的CO₂ 恒温孵育箱内培养hUC-MSCs细胞至60%时进行分化诱导。

体外诱导人脐带间充质干细胞成神经分化时，分组见表1：

表1中，抗氧化剂联合细胞因子诱导方法为常规诱导方法，作为对比组。

抗氧化剂联合细胞因子诱导组：预诱导2d后，短梭形的脐带间充质干细胞形态变窄，细胞没有脱壁现象；分化诱导1d后，胞体发生收缩现象、两极伸展，可观察到明显的轴突结构，部分细胞脱壁、死亡、漂浮；维持分化1d后，胞体进一步发生收缩、变窄情况，且轴突结构两端出现分叉，有锥形神经末端结构形成。

本发明复合诱导培养基组：采用分化培养液DA预诱导2d后，脐带间充质干细胞由短梭状变长，逐步形成长梭状形态；采用分化培养液DB分化诱导1d后，长梭状的细胞胞体固缩，两端进一步变窄，产生折光性良好的细长、网状突触结构，很少有细胞漂浮、脱壁、死亡；采用分化培养液DC维持分化1d后，胞体折光性增强、突触长度延展，临近细胞间呈现网状典型的神经元样细胞形态，如图3所示。

实施例3

对实施例2诱导的神经元样细胞进行鉴定

一、荧光定量PCR检测诱导后神经分化相关基因水平，具体方案如下：

1、提取诱导组细胞总RNA，步骤如下：

1）分别收集状态良好的诱导后的细胞，1000rpm离心，3-5min后去上清；将细胞沉淀中加入1ml Trizol，迅速吹打后室温静置5min，转移至新的1.5 ml无酶EP管中；

2）按200μl/管加入氯仿，上下颠倒EP管20s后，室温静置10min；

3）4℃、12000 rpm离心15min后，将上清后移至新的1.5 ml无酶EP管中，并等体积加入预冷的异丙醇，吹打均匀后置于4℃沉淀10 min；

4）4℃、12000 rpm离心 15min后弃掉上清；然后用2 ml 75%乙醇洗涤沉淀；

5）4℃、10000 rpm离心 5 min，用移液枪吸去大部分上清；

6）4℃、10000 rpm离心5 min，用移液枪轻轻吸尽上清；

7）室温干燥后，当 RNA基本透明时，按每管20 μl加入RNase-free Water充分溶解，并用微量分光光度计测定所抽提 RNA的浓度。

2、qRT-PCR检测基因的相对表达量，步骤如下：

1）按TaKaRa公司的逆转录试剂盒说明书要求合成cDNA，各组反转录总RNA约800ng；

2）去除基因组DNA反应：冰上配制好反应混合液后，室温静止5min, 反应体系如下：

3）反转录合成cDNA：冰上配制好反应体系，按“37℃ 15min、85℃ 5s”的条件进行反应后，4℃保存。反应体系如下：

4） Real Time PCR：使用 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR仪和TaKaRa qRT-PCR反应试剂盒，设GAPDH为内参，按“95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 34s，40个循环”的反应条件检测各组神经分化相关基因DCX、NSE、Mash1、Ngn1的mRNA表达水平，反应体系如下：

5）PCR完成后，采用比较CT法对实验结果进行分析，目的基因的相对表达量等于2^-△△CT。本步骤引物序列见表2：

表2 神经分化相关基因DCX、NSE、Mash1、Ngn1引物序列、退火温度、片段长度

。

荧光定量PCR结果（见表3）：较正常组，本发明的复合诱导组和“抗氧化剂联合细胞因子”诱导组神经分化相关基因都有明显升高（P <0.05）；与“抗氧化剂联合细胞因子”诱导组相比，采用本发明复合诱导培养基复合诱导的细胞中NSE、Mash1、Ngn1的mRNA表达量显著上升，而DCX表达量降低（P <0.05）；

表3各诱导组HUCMSC中DCX、NSE、Mash1、Ngn1 mRNA表达量比较

注：“抗氧化剂联合细胞因子”诱导组记作方案α，本发明的复合诱导组记作方案β；

*:与对照组相比，P ＜0.01; #:与方案α相比，P ＜0.05。

3、免疫荧光鉴定不同诱导方案神经元迁移蛋白DCX、神经元特异性烯醇化酶NSE的表达情况：

1）用PBS漂洗不同分化方案诱导完毕后48孔板3遍，4%多聚甲醛于4 ℃过夜固定；

2）用0.2% Triton X-100室温通透10 min，PBS润洗3次，每次10分钟；

3）用5%BSA室温封闭30 min，分别加入鼠抗DCX单抗（稀释比例1：50）、兔抗NSE抗体（稀释比例1：100稀释），置于4 ℃孵育过夜（PBS替代一抗作阴性对照）；

4）次日，用PBS漂洗3次，每次10 min，各组分别按200μl/孔加入FITC标记羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗，室温避光孵育1 h；

5）PBS润洗3次，加DAPI染色，封片，倒置荧光显微镜上镜观察，计数。

免疫荧光结果显示（见表4）：采用“抗氧化剂联合细胞因子”诱导脐带间诱导4d后，DCX、NSE阳性表达率分别为( 73.7±2.522) %、( 40.7±0.419) %，向神经元前体细胞分化更显著；采用本发明的复合诱导细胞中DCX、NSE阳性表达率分别为：( 42.5±0.825) %、(87.7±0.061) %，向神经元样细胞增加明显，如图4所示，具有统计学意义；

表4 各组细胞中DCX、NSE阳性细胞率比较（%）

*：与对照组相比，P ＜0.01; #：与方案α相比，P ＜0.05。

4、Live-dead检测本发明的复合诱导后细胞存活情况：

1）分化诱导完成后，更换48孔板中培养液；

2） AO/PI荧光染色：稀释AO、PI原液至100μg/mL，将其与DMEM/F12培养基按1:50体积比配制混合染色液；

3）弃孔板旧液，加入500μl混合染色液，室温孵育5~10min，倒置荧光显微镜观察细胞存活。

AO/PI荧光染色显示：经本发明复合诱导培养基诱导4d后，存活的细胞较多（绿色），死亡的细胞较少（红色），且形态学上呈现出交错的突触结构，神经元样细胞特征明显，如图5所示。

二、免疫组化检测移植人脐带间充质干细胞诱导细胞后脑损伤小鼠海马部位存活情况：

选用10只C57BL/6J小鼠饲养一周后制作脑损伤小鼠模型。造模前，更换垫料1次，并禁食禁水24h，所涉及的动物操作程序符合动物保护与伦理要求。所有实验动物均购自市场商业化的实验动物技术有限公司。

1、脑损伤动物模型制作：

采用自由落体脑皮质损伤模型，步骤如下：

1）术前10%水合氯醛按0.04 ml/10g对小鼠给予麻醉后，头部备皮、消毒；

2）脑立体定位仪上俯卧位固定小鼠，校零各轴读数，确保小鼠头部水平；

3）用手术刀沿脑中线纵切5cm开口，钝性分离皮下组织、暴露颅骨。在前囱后1.5mm、中线旁侧1.5mm处环钻开3 mm直径骨窗，保证硬脑膜完好；

4）立体定位仪上，距骨窗20cm高度释放20g撞针（直径2mm）制作2mm深度脑损伤模型。

2、侧脑室移植诱导分化的细胞 :

1）牙科钻在前囟后2 mm、旁开1.5 mm处建立直径1mm小孔；

2）脑立体定位仪上，5min内用微量注射针在左侧脑室（前囟后2mm、旁开1.5mm、深度2mm）移植5×10⁴个细胞，留针5min后，缓慢拨出，消毒缝合。

3、小鼠脑切片制备：

1）脑损伤细胞移植小鼠饲喂28d后，麻醉开胸剪开右心耳，用头皮针在左心室内升主动脉方向灌注分别20ml预冷0.01M PBS、4%多聚甲醛溶液，肝脏变白后取脑；

2）新鲜脑组织4%多聚甲醛溶液固定24h，梯度蔗糖脱水72h；

3）OCT包埋，冰冻切片机制作20μm切片。

4、免疫组化检测移植诱导细胞在脑损伤模型小鼠海马中表达分布情况:

1）冰冻切片室复温30min，PBS漂洗3遍，每次5min ;

2）微波炉中0.01M枸橼酸缓冲抗原修复20min，室温冷却后PBST清洗10min，重复3次；

3）1% Triton-100室温通透30min，PBST清洗10min，重复3次；置于3%H2O2室温孵育30min后， PBST清洗10min，重复3次；

4）室温下，10%山羊血清封闭90min，洗去封闭液；4℃过夜孵育MAB1281一抗后，复温30min，PBST清洗3次，每次10min；

5）滴加与一抗对应的稀释后的二抗，37℃孵育1-2h，PBST清洗10min，重复3次；

6）DAB染色后，蒸馏水润洗；苏木素复染后，、PBS清洗后，脱水透明，封片观察。

采用SPSS17.0进行数据分析，实验数据用表示，组间数据用检测，多组数据采用方差分析，检验水准α=0.05。

免疫组化染色结果显示：正常小鼠海马组织内中，没有阳性染色出现。而在移植本发明中复合诱导的细胞组，脑损伤小鼠海马组织内存在数目较多的被MAB1281抗体结合、着色统一、胞浆呈棕黄色的细胞颗粒，即显示其为经本发明的复合诱导的神经元样细胞可以有效迁移到损伤部位进行神经修复，且移植小鼠30d内无死亡，如图6所示。

Claims

1.一种复合诱导培养基，其特征在于：包括DA、DB、DC三种分化培养液，所述DA、DB、DC三种分化培养液的配制方法分别为：

将DA、DB、DC三种分化培养液分别混匀并经过滤除菌后分别保存。

2.采用权利要求1制备的复合诱导培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法，其特征在于：