CN107177617A - 一种靶向沉默HDAC1基因的LV‑HDAC1shRNA慢病毒合成方法及应用 - Google Patents

一种靶向沉默HDAC1基因的LV‑HDAC1shRNA慢病毒合成方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向沉默HDAC1基因的LV‑HDAC1shRNA慢病毒合成方法，首先在GenBank上检索人HDAC1的mRNA序列，合成特异性的shRNA片段；用Lipofectamin2000转染siRNA到HEK293细胞中，置于CO2培养箱培养72h，提取细胞总RNA；利用实时荧光PCR技术筛选具有最佳干扰HDAC1效率最高的shRNA；最后利用mU6‑MCS‑Ubi‑EGFP工具载体质粒、pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒，合成慢病毒LV‑HDAC1shRNA。同时，本发明还公开了该LV‑HDAC1shRNA慢病毒作为高效调控胞内HDAC1表达的表观遗传修饰药物的应用。本发明合成慢病毒改变hUC‑MSCs细胞乙酰化水平的同时，可明显促进其增殖和神经分化潜能的提高，更有利于后续细胞移植治疗。

Description

一种靶向沉默HDAC1基因的LV-HDAC1shRNA慢病毒合成方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其是涉及一种靶向沉默HDAC1基因的LV-HDAC1shRNA慢病毒合成方法，本发明还涉及将该慢病毒作为高效调控胞内HDAC1表达的表观遗传修饰药物的应用。
背景技术
近年来，干细胞替代疗法为包括创伤性脑损伤（TBI）在内的中枢神经损伤疾病的治疗带来希望。脐带源性间充质干细胞(hUC-MSC)具有一定的增殖分化能力，是伦理争议小、临床应用价值高的种子细胞。但鉴于干细胞在体内外增殖和分化效率有限，目前亟需更为安全、有效的诱导调控方式提高其成神经分化潜能。
学者Struhl K提出：组蛋白乙酰化修饰的表观遗传干预手段，可调控细胞内乙酰化酶（HAT）和去乙酰化酶（HDAC）的动态平衡来调控干细胞的增殖和定向分化。本申请的发明人团队前期研究表明，与未分化的干细胞相比，已分化的成熟神经元中HDAC1的表达量降低。学者吕建祎认为：影响干细胞分化、增殖的阻遏复合物上，HDAC1 、2 都有表达；且学者MacDonald J L 指出：敲除HDAC2 可能会抑制神经祖细胞的增殖。这与本申请发明人团队的前期研究结果一致。这表明，靶向调控HDAC1有助于干细胞神经命运决定的启动。
目前，调控细胞组蛋白乙酰化水平的常用手段是使用HDAC抑制剂。但是仍存在很多不足：1.广谱性的HDAC抑制剂特异性不强，且可能存在剂量依赖性，损害脑认知能力；2.特异性的HDAC1抑制剂虽可改善胞内HDAC1水平，但细胞传代、增殖后，干预效果呈现递减效应；3.HDAC抑制剂价格昂贵，体内实验成本高。因此，有效稳定的靶向干预HDAC1对于调控干细胞神经分化潜能十分重要。
发明内容
本发明的目的在于针对组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）抑制剂存在的不足，提供一种靶向沉默HDAC1基因的LV-HDAC1shRNA慢病毒合成方法；本发明还提供合成的LV-HDAC1shRNA慢病毒作为高效调控胞内HDAC1表达的表观遗传修饰药物的应用。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
1、本发明所述的靶向沉默HDAC1基因的LV-HDAC1shRNA慢病毒合成方法，包括下述步骤：
第一步，GenBank上检索人HDAC1的mRNA序列，合成特异性的shRNA片段；
第二步，用Lipofectamin2000转染siRNA到HEK293细胞中，置于CO2培养箱培养72h，提取细胞总RNA；利用实时荧光PCR技术筛选具有最佳干扰HDAC1效率最高的shRNA；
第三步，利用mU6-MCS-Ubi-EGFP工具载体质粒、pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒，合成慢病毒LV-HDAC1shRNA。
2、本发明合成的LV-HDAC1shRNA慢病毒作为高效调控胞内HDAC1表达的表观遗传修饰药物的应用。
2.1 本发明采取上述慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSC筛选可靶向沉默HDAC1基因、调控胞内乙酰化水平、增殖良好的HDAC1shRNA-MSC细胞株，评估其周期、凋亡、迁移能力：
（1）将hUC-MSCs细胞按3~5×104 ml-1密度接种于96孔板中的12个孔内，体积为90μl，细胞培养箱中培养24h；
（2）利用慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs，在倒置荧光显微镜下，通过比较各组细胞感染效果，确认hUC-MSCs的感染条件和感染参数；
（3） 使用已确定复感染指数的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs，流式分选获取稳定整合慢病毒LV-HDAC1shRNA细胞，记作HDAC1shRNA-MSC细胞；
（4） 荧光定量PCR、Western blot检测慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞内HDAC1基因沉默情况、乙酰化水平；
（5） CCK8法测定慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞的增殖曲线；
（6） PI染色检测慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞周期；
（7）SA-β-Gal实验检测HDAC1shRNA-MSC细胞衰老情况；
（8）Caspase 3检测评估HDAC1shRNA-MSC细胞凋亡；
（9）Transwell迁移实验检测HDAC1shRNA-MSC细胞细胞迁移。
2.2 本发明用神经分化诱导培养基诱导MSC和HDAC1shRNA-MSC细胞，qRT-PCR、免疫荧光评估慢病毒LV-HDAC1shRNA对hUC-MSCs神经诱导分化的影响：
（1）利用复合诱导培养基对MSC和HDAC1shRNA-MSC细胞进行神经分化诱导；
（2）提取诱导分化后的MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞RNA，用荧光定量PCR检测慢病毒LV-HDAC1shRNA对 hUC-MSCs细胞神经分化相关基因mRNA水平的影响；
（3）免疫荧光检测诱导神经元样细胞神经元迁移蛋白DCX、神经元特异性烯醇化酶NSE表达情况：DCX表达阳性者为神经前体细胞, NSE表达阳性者为神经元样细胞。
2.3 侧脑室移植HDAC1shRNA-MSC细胞，利用qRT-PCR检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况，利用新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况：
（1）侧脑室移植HDAC1shRNA-MSC细胞，qRT-PCR检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况；
（2）利用新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况。
本发明的优点在于：
1、 合成的LV-HDAC1shRNA慢病毒携带 GFP 荧光标签，便于跟踪、选择和富集转染的细胞；且有较高的转染效率，可长时间维持基因沉默；采用第2代系统的慢病毒载体，所收集的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。
2、 慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs，HDAC1基因表达水平明显下调，H3K9Ac表达显著增加。慢病毒改变hUC-MSCs细胞乙酰化水平的同时，可明显促进其增殖和神经分化潜能的提高，更有利于后续细胞移植治疗；
3、 侧脑室移植LV-HDAC1shRNA感染的hUC-MSCs，可以通过提高神经分化相关基因与神经营养因子的表达，继而改善TBI小鼠学习记忆能力，促进其神经修复。
附图说明
图1是本发明制备的shRNA3转染人脐带间充质干细胞后，应用荧光定量PCR、Western blot检测shRNA3干扰HDAC1基因表达效率的结果。
图2 是本发明制备的mU6-MCS-Ubi-EGFP-HDAC1shRNA3慢病毒载体质粒结构图。
图3是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染分选收获的HDAC1shRNA-MSC细胞，倒置荧光显微镜下细胞形态学照片（100 X）。
图4 是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染分选收获的HDAC1shRNA-MSC细胞应用荧光定量PCR、Western blot检测HDAC1基因沉默情况、细胞乙酰化水平结果。
图5 是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞应用CCK8法测定的增殖曲线。
图6 是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞应用PI染色法测定的细胞周期结果。
图7 是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞应用SA-β-Gal法测定的细胞衰老结果。
图8 是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞应用Caspase 3检测的细胞凋亡结果。
图9 是采用本发明制备的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞应用Transwell迁移实验检测的细胞迁移结果。
图10 是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞4d后，应用荧光定量PCR检测神经分化相关基因mRNA水平影响的结果。
图11 是采用本发明制备的复合诱导培养基诱导慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞4d后，DCX、NSE阳性细胞免疫荧光染色结果（ X 200）。
图12 是侧脑室移植慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞治疗脑损伤模型小鼠28d后，应用荧光定量PCR技术检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子表达情况的结果。
图13 是侧脑室移植慢病毒LV-HDAC1shRNA感染的HDAC1shRNA-MSC细胞治疗脑损伤模型小鼠28d后，应用新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更详细的说明。其中采用的实验方法，若无特别说明，均为常规方法；实验所用的器具、仪器、试剂均可通过商业途径获得。
实施例1：合成、筛选具有稳定靶向沉默能力的LV-HDAC1shRNA慢病毒
（1）GenBank上检索人HDAC1的mRNA序列（NM_004964.2），送吉玛基因合成3条特异性的shRNA片段，分别记作shRNA1、shRNA2、shRNA3，序列信息详见表1；
（2）按siRNA:Lipofectamin2000（1:0.05）转染HEK293细胞，置于CO2培养箱培养72h，提取细胞总RNA；利用实时荧光PCR技术（引物见表2，结果见图1-A）、Western blot检测筛选出了具有最佳干扰HDAC1效率最高的shRNA片段（图1-B,C, C为B的灰度分析结果），即shRNA3。注：*：与shRNA1组相比，P<0.05；#，与shRNA2组相比，P<0.05。
（3）把shRNA3正义链和反义链溶于退火缓冲液中，90℃水浴15min，冷却至室温，合成双链DNAoligo片段。用Hpa I和Xho I酶双酶切mU6-MCS-Ubi-EGFP工具载体质粒并回收；缓冲液中用T4 DNA连接酶将线性化mU6-MCS-Ubi-EGFP质粒和已退火DNAoligo片段16℃过夜连接，反应体系如下：
（4）取得到连接液转化EColi感受态细胞，将PCR鉴定后的阳性克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的U6-MCS-Ubi-EGFP-HDAC1shRNA3慢病毒载体质粒（图2）。
（5）离心管中混匀DNA溶液（mU6-MCS-Ubi-EGFP-HDAC1shRNA3载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒15μg），用转染试剂定容至1ml，室温孵育15min。
（6）混合液缓慢滴加至293T细胞培养液中，混匀，静置于 37℃、5% CO2 细胞培养箱中培养。
（7）培养 6 h 后弃去含有转染混和物的培养基，加入 10ml 的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。
（8）缓慢加入含 10%血清的细胞培养基 20 ml，于 37℃、5% CO2 培养箱内继续培养 48-72 h。
（9）根据细胞状态，收集转染后 48 h（转染即可计为 0 h）的 293T 细胞上清液。
（10）于 4℃、4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。
（11）以0.45μm滤器过滤上清液于 40 ml 超速离心管中。
（12）分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至 Beckman 超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃。
（13）离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液（可用 PBS 或细胞培养基替代），轻轻反复吹打重悬。
（14）经充分溶解后，高速离心 10000rpm、5min后，取上清按要求分装，即为慢病毒LV-HDAC1shRNA。
实施例2：慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSC，筛选HDAC1shRNA-MSC细胞株
采用实施例1配制的慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSC，筛选可靶向沉默HDAC1基因、调控胞内乙酰化水平、增殖良好的HDAC1shRNA-MSC稳定株，具体步骤如下：
（1）将hUC-MSCs细胞按3~5×104 ml-1密度接种于96孔板中的12个孔内，体积为90μl，细胞培养箱中培养24h；
（2）感染试剂的配制：
配制polybrene(M)：使用Complete Medium稀释polybrene，至终浓度50 μg/ml；
配制polybrene(E)：使用Eni.s稀释polybrene，至终浓度50 μg/ml；
使用Eni.s将病毒稀释为三种滴度：A组1×108 TU/ml、B组1×107 TU/ml、C组1×106TU/ml。
（3）以横坐标从左向右为：Complete Medium、polybrene(M)、Eni.s polybrene(E)， 纵坐标从上至下为：A组1×108 TU/ml、B组1×107 TU/ml、C组1×106 TU/ml，按表3《感染条件筛选表》分别更换培养液和加入病毒液进行细胞感染；
（4）混匀后继续培养，8-10h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基；
（5）感染3-4天后，观察各组荧光表达情况。其中，每隔1天换液1次，以保持细胞活性；
（6） 在倒置荧光显微镜下，确认hUC-MSCs复感染指数（Multiplicity of infection，MOI）为10，慢病毒LV-HDAC1shRNA感染P3代 hUC-MSCs 2~3天，传代1次后，流式分选获取稳定整合慢病毒LV-HDAC1shRNA细胞系，倒置荧光显微镜存留荧光照片后（图3），记作HDAC1shRNA-MSC细胞。
（7） 提取MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞RNA和蛋白，利用荧光定量PCR（引物见表2）检测HDAC1基因沉默情况、Western blot检测慢病毒LV-HDAC1shRNA对 hUC-MSCs细胞乙酰化影响，结果显示：与MSCs组相比，HDAC1shRNA-MSC组蛋白去乙酰化酶HDAC1在mRNA水平的表达明显下调（图4-A，P<0.05）；hUC-MSC经慢病毒感染后，HDAC1蛋白表达下调，H3K9Ac表达上调，且差异显著（图4-B，C，P<0.05）。注：*：MSCs组相比，P<0.05。
（8）取状态良好的P4代MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞用2.5 g /L的胰酶消化离心后，将少许细胞悬液滴加细胞计数盖片边缘，进行细胞计数；根据测定的计数结果，用培养基重悬为密度为2×104 ml-1的单细胞悬液。96孔板中，按1500个细胞每孔进行接种，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜孵育。使用CCK8法检测MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞增殖情况，结果显示：与对照组相比，感染慢病毒LV-HDAC1shRNA的细胞有先缓后增的增殖趋势，但无统计学差异（图5）。
（9）将状态良好的P4代MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞，培养24h后，用胰蛋白酶消化离心后，弃上清；将细胞沉淀用1mL预冷PBS溶液重悬、清洗后，离心去上清；用70%乙醇固定细胞24h后，离心去上清；在避光条件下，各组细胞分别加入0.5 ml的PI染色液，于37 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。流式结果显示：较MSCs组，HDAC1shRNA-MSC组细胞，G0/G1期下调（由89.245%降至75.861%），S期上调（由8.662%升至20.254%），与细胞增殖联系密切（图6）。
（10）用生长状态良好的P4代MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞，以每孔105个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁，完全伸展开后更换培养基。弃去细胞培养液，每孔加入1mL清理液，清洗生长中的细胞表面；弃去清理液，每孔再加入1mL固定液，覆盖整个生长表面，室温孵育10min；弃去固定液，每孔再加入1mL酸性液，清洗细胞表面；弃去酸性液，再次用酸性液清洗细胞一次；弃去酸性液，每孔加入1mL预热30min后的配置好的的β-Gal染色工作液，放入37℃培养箱孵育7h，光学显微镜下观察并计数蓝染细胞（蓝染程度与细胞衰老程度相关性），结果显示，HDAC1shRNA-MSC细胞蓝染率比MSC细胞高，细胞衰老亦有增加（图7A，B）。注：*：MSCs组相比，P<0.05。
（11）用生长状态良好的P4代MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞，取密度为1*105 /孔每组 设置3个复孔,每孔100μl ,用含血清的DMEM-F12培养48h。均匀混合Caspase 3底物和缓冲液，取100μl加入各孔中，孵育1h后酶标仪检测OD 405 nm处的吸光值，结果显示：与MSC组相比，HDAC1shRNA-MSC组48h时，caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度有显著增强（图8），细胞凋亡有所增多，但无显著差异。
（12）用生长状态良好的P4代MSC、HDAC1shRNA-MSC组细胞，取密度为2*105 /孔取细胞悬液200 μl接种于Transwell小室的上室，将600 μl含20%胎牛血清的DMEM-F12培养基加入下室，每组设三个复孔；常规培养24h后，用棉签擦去Transwell小室上室内面的细胞，4%多聚甲醛固定15min，0.1%结晶紫溶液染色15min，PBS洗3遍，随机取 10 个视野显微镜下观察、计数拍照。结果显示：较MSC组，HDAC1shRNA-MSC组细胞，细胞迁移数目有显著增强（图9）。注：**：MSCs组相比，P<0.001。
实施例3：复合诱导培养基神经分化诱导MSC和HDAC1shRNA-MSC细胞，评估慢病毒对MSCs神经分化的影响
本发明用神经分化诱导培养基诱导MSC和HDAC1shRNA-MSC细胞，qRT-PCR、免疫荧光评估慢病毒LV-HDAC1shRNA对hUC-MSCs影响，具体步骤如下：
（1）用DMEM-LG培养基调整MSC和HDAC1shRNA-MSC细胞密度为2×105 ml-1，恒温培养至60%汇聚度，DA分化培养液预诱导2天、DB分化培养液分化诱导1天、DC分化培养液维持诱导1天，完成神经分化诱导，其中诱导培养基特征为：
DA分化培养液是由每1000ml DMEM-LG培养基中添加40ml FBS和10μg bFGF组成，其中bFGF的终浓度达10 ng/ml；
DB分化培养液是由每1000ml的DMEM-LG培养基中添加50ml Cerebrolysin、4mgForskolin、5mg Insulin、0.36mg Hydrocortisone、1.86g KCl、7g NaCl、2.2g NaHCO3、190mg NaH2PO4、95mg MgCl2、222mg CaCl2、1.8g D-glucose组成；其中各组分的终浓度达到5% Cerebrolysin、10μM Forskolin、5 μg/ml Insulin、1 μM hydrocortisone、2.5mM KCl、120 mM NaCl、26mM NaHCO3、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、10 mM D-glucose；
DC分化培养液是由每1000ml的DMEM-F12培养基中添加10μg bFGF、10μg EGF、10ml100XN2、20ml 50X B27、0.3g L-glutamine组成；其中各组分的终浓度达到：10 ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、1X N2、1X B27、2mM L-glutamine；
（2）提取诱导分化后的MSCs、dMSCs、HDAC1shRNA-MSC组细胞RNA，用荧光定量PCR检测慢病毒LV-HDAC1shRNA对 hUC-MSCs细胞神经分化相关基因mRNA水平的影响，结果显示：与对照组相比，经神经诱导后重组慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs细胞DCX、NSE表达增加，且除Ngn1外神经分化相关基因Mash1、Ngn2表达普遍显著上调（图10，P<0.05）。注：*：P<0.05。
（3）免疫荧光检测MSC、dMSCs、HDAC1shRNA-MSC组细胞神经元迁移蛋白DCX、神经元特异性烯醇化酶NSE表达情况：DCX表达阳性者为神经前体细胞, NSE表达阳性者为神经元样细胞。步骤如下：
a. 用PBS漂洗不同分化方案诱导完毕后48孔板3遍，4%多聚甲醛于4 ℃过夜固定。
b. 用0.2% Triton X-100室温通透10 min，PBS润洗3次，每次10分钟。
c. 用5%BSA室温封闭30 min，分别加入鼠抗DCX单抗（稀释比例1：50）、兔抗NSE抗体（稀释比例1：100稀释），置于4 ℃孵育过夜（PBS替代一抗作阴性对照）。
d. 次日，用PBS漂洗3次，每次10 min，各组分别按200μl/孔加入FITC标记羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗，室温避光孵育1 h。
.PBS润洗3次，加DAPI染色，封片，倒置荧光显微镜上镜观察，计数。
免疫荧光结果显示：重组慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs细胞经神经诱导4d后，DCX、NSE阳性表达率分别为( 45.9±3.614) %、( 89.1±1.387) %，向神经元样细胞分化更显著，免疫荧光照片如图11所示，具有统计学意义。
实施例4：侧脑室移植HDAC1shRNA-MSC细胞，qRT-PCR检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况，新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况。
（1）饲养24只C57BL/6J小鼠一周后制作脑损伤小鼠模型，分为四组：
a. Sham组：只打开骨窗，不进行脑损伤，不移植细胞，共6只；
b. Vehicle组：中度脑损伤模型，不移植细胞，仅侧脑室注射生理盐水，共6只；
c. MSCs组：中度脑损伤模型，移植hUC-MSCs，共6只小鼠；
d. HDAC1shRNA-MSC组：中度脑损伤模型，移植LV-HDAC1shRNA感染后的HDAC1shRNA-MSC，共6只小鼠。
（2）造模前，更换垫料1次，并禁食禁水24h，所涉及的动物操作程序符合动物保护与伦理要求。所有实验动物均购自市场商业化的实验动物技术有限公司。
a. 脑损伤动物模型制作：采用自由落体脑皮质损伤模型，步骤如下：
1）术前10%水合氯醛按0.04 ml/10g对小鼠给予麻醉后，头部备皮、消毒。
2） 脑立体定位仪上俯卧位固定小鼠，校零各轴读数，确保小鼠头部水平。
3） 用手术刀沿脑中线纵切5cm开口，钝性分离皮下组织、暴露颅骨。在前囱后1.5mm、中线旁侧1.5mm处环钻开3 mm直径骨窗，保证硬脑膜完好。
4） 立体定位仪上，距骨窗20cm高度释放20g撞针（直径2mm）制作2mm深度脑损伤模型。
b. 侧脑室移植诱导分化的细胞 :
1）牙科钻在前囟后2 mm、旁开1.5 mm处建立直径1mm小孔；
2）脑立体定位仪上，5min内用微量注射针在左侧脑室（前囟后2mm、旁开1.5mm、深度2mm）移植5×104个细胞，留针5min后，缓慢拨出，消毒缝合
（3）qRT-PCR检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况：
小鼠动物行为学实验结束后，麻醉处死，取出脑组织，将损伤侧组织匀浆后通过RNA提取试剂盒获取总RNA。以GAPDH为内参，使用荧光定量PCR仪检测各组小鼠脑内DCX、MAP2、BDNF、NGF、NT3基因的表达情况,引物见表4。
结果显示：与Vehicle组相比，治疗28d后，MSCs、HDAC1shRNA-MSC组小鼠损伤侧DCX、MAP2表达水平明显升高（P<0.05），且后者神经元相关基因表达显著上调（图12，P<0.05）。与Vehicle组相比，治疗28d后，MSCs、HDAC1shRNA-MSC组小鼠脑内神经营养因子表达水平明显升高（P<0.05），且后者海马内神经营养因子BDNF、NGF、NT3基因表达明显上调（图12，P<0.05）。注：*：与Sham组相比，P<0.05；#：与Vehicle组相比，P<0.05；
（3）新事物识别实验评估移植后小鼠神经记忆恢复情况：脑外伤后28d，本实验采取新事物识别实验检测动物学习记忆能力。
. 为了保证实验数据真实有效，实验过程应严格按照以下步骤进行：
1）训练前72h，每天轻柔抚摸实验小鼠1min，消除其与测试者间陌生感。
2）训练前24小时，将动物放一个测试用50 cm×50 cm×25cm不透明箱子中，适应测试环境10min。
3）训练前准备A，B，C三个物体，其中A，B物体为体积约4×4×4 cm3红色立方体，C物体是直径4cm的绿色球形物体。实验开始后，首先将A、B放入箱中在一侧壁的左右两端；将小鼠背朝两物体放入场内后，开启录像设备，离开测试房间，记录实验动物用鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2~3 cm范围内探究的时间。10min后，把小鼠放回笼子。1h后，用C替换A，并重新让小鼠在此箱中探索5分钟，重复观察相同指标。待全部实验结束后，将小鼠送回饲养房。
4）通过公式辨别指数=新物体所用时间/(新物体所用时间+旧物体所用时间)×100%，分析小鼠的辨别指数。
b.通过统计其探索新旧事物所用时间后发现：与Vehicle组相比，经细胞治疗后MSCs、HDAC1shRNA-MSC小鼠新物体鉴别指数显著增加，二者间HDAC1shRNA-MSC组变化较大（图13，P<0.05）。注：*：与Sham组相比，P<0.05、**：与Sham组相比，P<0.01；#：与Vehicle组相比，P<0.05。
采用SPSS17.0进行数据分析，实验数据用表示，组间数据用检测，多组数据采用方差分析，检验水准α=0.05。

Claims (2)

1.一种靶向沉默HDAC1基因的LV-HDAC1shRNA慢病毒合成方法，其特征在于：包括下述步骤：
第一步，GenBank上检索人HDAC1的mRNA序列，合成特异性的shRNA片段；
第二步，用Lipofectamin2000转染siRNA到HEK293细胞中，置于CO2培养箱培养72h，提取细胞总RNA；利用实时荧光PCR技术筛选具有最佳干扰HDAC1效率最高的shRNA；
第三步，利用mU6-MCS-Ubi-EGFP工具载体质粒、pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒，合成慢病毒LV-HDAC1shRNA。
2.权利要求1所述的LV-HDAC1shRNA慢病毒作为高效调控胞内HDAC1表达的表观遗传修饰药物的应用。
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