CN108559726A - 一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群及其制备方法，属于生物医药领域。本发明的细胞亚群来源于成体神经组织或诱导多能干细胞；所述细胞亚群利用特异性标记物进行检测，所述特异性标记物包括巢蛋白、PAX6、SOX2、波形蛋白、Musashi‑1和NGFR。本发明提供的细胞亚群是单一细胞亚群，在体外培养到P5代，纯度可达90％以上，细胞活性95％以上，即便连续传代到第32代依然能保持良好的干性和分化潜能；可通过调节NF‑κB通路反应来逆转脑损伤后的神经元死亡和炎症反应，且对淋巴细胞和免疫细胞的增殖具有抑制作用。

Description

一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群及其制备方法。
背景技术
脑损伤通常包括缺血型脑损伤(如脑卒中)，缺血缺氧型脑损伤(如小儿脑瘫)和创伤性脑损伤。脑损伤类疾病给个人健康和社会带来了严重的负担。在发达国家，脑卒中是导致成年人丧失行动能力和死亡的第三大原因。小儿脑瘫通常指出生前到出生后一个月内由各种原因引起的非进行性脑损伤或脑发育异常所导致的中枢性运动障碍。临床上以姿势与肌张力异常、肌无力、不自主运动和共济失调等为特征，常伴有感觉、认知、交流、行为等障碍和继发性骨骼肌肉异常，并可有癫痫发作，该病目前无理想的治疗手段，致残率高，给患者本人及家庭造成的精神负担和经济负担重。
根据卫生部发布的数据计算，我国每年新生儿1600万人，据不同统计，小儿脑瘫发病率在千分之二到千分之五左右，即每年3～8万人；而由于以往人口出生率高、医疗条件落后导致发病率高、治愈率低等原因，有报道称我国已有累积小儿脑瘫患者500万人。因此该病危害十分严重。
脑损伤如小儿脑瘫目前常用的治疗方式有物理治疗、作业治疗、家庭训练、矫形器等。常用的药物有脑神经营养药、肌肉松弛剂等，然而药物治疗只有在必要时才使用，它不能替代功能性训练。注射用鼠神经生长因子是被SFDA批准的一种生物制剂，提取自小鼠的颌下腺，与人的同源性达90％，采用肌肉注射的方式给药，据报道对小儿脑瘫引起的肌张力、运动发育、姿势异常、反射异常等症状有一定改善效果。
目前所有的治疗脑损伤的药物大多为提供营养，缓解症状，不能达到治疗的目的。也就是说，目前市场上并没有特异性治疗脑损伤类疾病的有效药物。在临床上通常采取药物和运动康复相结合的办法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群，只通过药物就可有效治疗脑损伤类疾病，见效快，周期短。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群，所述细胞亚群来源于成体神经组织或诱导多能干细胞；
所述细胞亚群利用特异性标记物进行细胞亚群检测，所述特异性标记物包括巢蛋白、PAX6、SOX2、波形蛋白、Musashi-1和NGFR；所述细胞亚群检测的巢蛋白阳性表达率为90％～99％，PAX6阳性表达率为80％～90％，SOX2阳性表达率为90％～9％，波形蛋白的阳性率为95％～99％，Musashi-1的阳性表达率为85％～99％，NGFR的阳性率为40％～60％。
优选的，所述的细胞亚群的制备方法，包括以下步骤：
1)将成体神经组织或诱导多能干细胞的单细胞悬液接种到无血清完全培养基中进行悬浮培养，得到原代细胞；
2)将步骤1)得到的所述原代细胞培养12～16天，得到原代神经细胞亚群，将所述原代神经细胞亚群进行重复的依次进行的消化、传代培养，传代至第五代，得P5代细胞；
3)将步骤2)得到的所述P5代细胞进行细胞亚群检测，检测阳性率合格的细胞作为种子细胞；
4)将步骤3)得到的所述种子细胞进行扩增传代培养，传代至P6代～P9代，得到细胞亚群。
优选的，步骤1)所述无血清完全培养基以DMEM/F12为基本培养基，包含终浓度为1～5％(v/v)的B-27、0.5～2.5％(v/v)的N2、0.01～0.05ug/ml的神经营养因子，0.01～0.05ug/ml的EGF，0.005～0.025ug/ml的LIF，1.0～3.0mMol/L的L-谷氨酰胺，0.5～1.5mMol/L的丙酮酸钠和0.5～1.5mMol/L的NAC。
优选的，步骤1)所述悬浮培养为在35℃下，体积分数为5％的二氧化碳条件下培养。
优选的，步骤2)所述消化使用的酶为木瓜蛋白酶、DNA酶I和L-半胱氨酸盐酸盐消化酶中的一种或几种。
优选的，步骤3)所述细胞亚群检测为将所述P5代细胞做细胞流式分析和异源微生物鉴定。
本发明还提供了一种所述细胞亚群在制备对脑损伤类疾病有治疗作用的药物中的应用。
优选的，所述药物为注射液或滴鼻制剂；所述注射液或滴鼻制剂中细胞亚群的浓度为(1×106～1×107)个细胞/200μL。
优选的，所述药物的移植途径包括：鼻腔筛板吸附扩散、脑内局部定点注射、静脉回输和鞘内注射。
本发明提供了一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群，来源于神经源细胞群，无其他细胞的交叉污染，是一种单一的细胞亚群，该细胞亚群在体外培养到P5代时，纯度依然可达90％以上，细胞活性在95％以上，即便是连续传代到第32代依然能保持良好的干性和分化潜能；且该细胞亚群的分化能力强于胚胎干细胞、其他神经干细胞以及间充质干细胞，此细胞亚群分化为神经元的效率可达70％以上。脑卒中和缺血缺氧型小儿脑瘫等脑损伤疾病主要表现为脑部多个区域的炎症反应、神经元凋亡和神经髓鞘的丢失，进而导致神经行为功能的损伤和认知功能的下降。本发明中的细胞亚群可以在体内体外分化为神经元替代凋亡神经元，分泌神经营养因子改变炎症环境，甚至激活内源神经干细胞参与修复活动，再建神经环路和轴突连接，以达到改善脑损伤疾病患者的神经行为活动和认知障碍。
附图说明
图1为神经细胞，其中左图为悬浮培养的神经细胞亚群，右图为正在分裂增殖的单个神经细胞；
图2为对SOX2和NESTIN的流式分析图；
图3为对Vimentin和Musash-1的流式分析图；
图4为荧光显微镜下的免疫组织染色图，其中A为GFAP染色的胶质细胞图；B为TUJI染色的神经元细胞图；C为O4染色的少突胶质细胞图片；D为神经亚群细胞分化为各种神经细胞的比例；
图5为神经细胞亚群治疗对脑损伤的作用图；
图6为切片中脑损伤的面积和损伤对侧的脑面积计算图；
图7为神经细胞亚群对脑损伤模型鼠的治疗效果图；
图8为神经细胞亚群的获得性试验结果图；
图9为给药后3天的细胞浆中IL-1β、p-IκBα和NF-κB p65的表达和细胞核中的NF-κB p65的表达分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群，所述细胞亚群来源于成体神经组织或诱导多能干细胞；所述细胞亚群利用特异性标记物进行细胞亚群检测，所述特异性标记物包括巢蛋白、PAX6、SOX2、波形蛋白、Musashi-1和NGFR；所述细胞亚群检测的巢蛋白阳性表达率为90％～99％，PAX6阳性表达率为80％～90％，SOX2阳性表达率为90％～9％，波形蛋白的阳性率为95％～99％，Musashi-1的阳性表达率为85％～99％，NGFR的阳性率为40％～60％。
在本发明中，所述细胞亚群具备自我扩增能力，且经过SOX2、NESTIN、Vimentin和PAX6等细胞标记物的检测，结果呈阳性，则此细胞群为神经源干细胞亚群；在体外，采用细胞免疫荧光的方法，检测到经过重组因子SHH，成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)，糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂CHIR99021因子的诱导，该细胞群可分化为72％的神经元细胞，13％的星形胶质细胞，5％的少突胶质细胞，分化为多巴胺神经元的比例为26％。
本发明提供了一种上述细胞亚群的制备方法，包括以下步骤：
1)将成体神经组织或诱导多能干细胞的单细胞悬液接种到无血清完全培养基中进行悬浮培养，得到原代细胞；
2)将步骤1)得到的所述原代细胞培养12～16天，得到原代神经细胞亚群，将所述原代神经细胞亚群进行重复的依次进行的消化、传代培养，传代至第五代，得P5代细胞；
3)将步骤2)得到的所述P5代细胞进行细胞亚群检测，检测阳性率合格的细胞作为种子细胞；
4)将步骤3)得到的所述种子细胞进行扩增传代培养，传代至P6代～P9代，得到细胞亚群。
本发明制备上述细胞亚群时，将成体神经组织或诱导多能干细胞的单细胞接种到无血清完全培养基中进行悬浮培养，得到原代细胞。
在本发明中，所述成体神经组织优选为脊髓组织，所述脊髓组织来源于供者捐献的脊髓组织；所述诱导多能干细胞来源于商业购买。在本发明中，以成体神经组织制备所述单细胞悬液时，其制备方法优选包括：在显微解剖镜下分离成体脊髓组织，去除血管和结缔组织后，将得到的脊髓组织放入培养皿中，用手术剪将组织剪成碎块，所述碎块优选的为1mm左右，将碎块与消化液混合，消化30～40min后，离心，得到单细胞悬液，接种到无血清完全培养基中得到原代神经细胞亚群；以诱导多能干细胞(IPSC)制备单细胞悬液时，其制备方法优选的包括：在6孔板中培养IPSC细胞，密度达80％-90％时，更换分化培养基(N2B27含5mmol/L SB431542,5mmol/L的drosomophorin)，然后每隔1天换1次培养基，第7天时将细胞刮下，转为预处理的6孔板中培养，培养基含有2％的N2和2％B-27。然后观察，2天细胞贴壁后，换液，继续培养，隔天换液，直至第15天。消化细胞,DMEM/F12培养基洗一遍，用无血清完全培养基培养在6孔板中培养1周，消化，离心，去上清后，吹散细胞，获得单细胞悬液。
在本发明中，所述消化液优选的包括L-半胱氨酸盐酸盐，DNaseI酶和木瓜蛋白酶，所述L-半胱氨酸盐酸盐的浓度优选的为0.1～1mg/ml，所述DNaseI酶的浓度为10～20μg/ml，所述木瓜蛋白酶的浓度为10～50μg/ml；所述消化液的用量优选的为消化5～10mg脊髓组织使用5～10ml消化液；所述消化优选的在培养箱中进行，更优选在二氧化碳培养箱中进行，最优选的在浓度5％的二氧化碳培养箱中进行；所述培养箱内的温度优选的为35℃，在所述消化过程中，优选的每隔一段时间震荡一次，更优选的为每5min震荡一次；
消化完成后将消化液离心，所述离心优选的设置离心力为200g～500g，更优选的为250～350g，最优选的为300g；所述离心的时间优选的为3～6min，更优选的为4～5.5min，最优选的为5min。
本发明离心后取上清，添加缓冲溶液后吹打，使之形成单细胞悬浮，得到单细胞悬液。在本发明中，所述离心后优选的吸弃上清至约50μl处，所述缓冲溶液的主要成分包括氯化钾0.1％-0.5％，氢氧化钠0.01％-0.05％，磷酸二氢钠0.05％-0.1％，氯化镁0.01％-0.03％，葡萄糖0.5％-5％，丙酮酸钠0.1％-0.5％，山梨醇1％-5％，优选的用所述缓冲溶液将吸弃上清后补足1ml，所述吹打的次数优选的为10～15次。本发明吹打完成后优选再用缓冲溶液洗涤后离心，去掉上清后获得单细胞悬液。
得到单细胞悬液后，本发明对所述单细胞悬液中的细胞进行计数，然后重悬在无血清培养基中，调整细胞密度，接种后进行悬浮培养。在本发明中，所述计数的方法优选的为本领域的常规细胞计数方法，更优选的为采用细胞自动计数仪计数；
本发明中，所述无血清培养基以DMEM/F12为基本培养基，包括B-27、N2、碱性成纤维生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、白血病抑制因子LIF、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和N-乙酰半胱氨酸NAC，在本发明中，所述B-27为无血清添加物，所述B-27的体积浓度更优选的为1～5％，最优选的为2％；所述N2为添加物，所述N2的体积浓度更优选的为0.5～2.5％，最优选的为2％；所述bFGF的浓度更优选的为0.01～0.05μg/ml，所述bFGF可促进细胞修复，细胞增殖和分裂；所述EGF的浓度优选的为0.01～0.05μg/ml，所述EGF可促进细胞的增殖分化；所述LIF的浓度优选的为0.005～0.025μg/ml，所述LIF对维持细胞的未分化状态有重要作用；所述L-谷氨酰胺的浓度优选的为1.0～3.0mMol/L，所述L-谷氨酰胺为细胞的生长提供氨基酸营养；所述丙酮酸钠的浓度优选的为0.5～1.5mMol/L，所述丙酮酸钠为细胞代谢所需的重要物质，可提供碳源；所述NAC的浓度优选的为0.5～1.5mMol/L，所述NAC为抗氧化剂；
在本发明中利用所述无血清培养基调整细胞密度，优选的调整到0.5×105～5×105个细胞/ml，更优选的为1×105个细胞/ml，将调整完密度的细胞接种后进行悬浮培养，所述接种优选的为向容量为150ml培养瓶中接种20ml调整完密度的细胞，本发明中所述培养瓶优选的为超低吸附的培养瓶，更优选的为低吸附T75培养瓶；所述悬浮培养优选在培养箱中进行，所述培养箱优选的为二氧化碳培养箱，更优选的所述二氧化碳的体积浓度为5％，所述培养的温度优选的为35℃。
得到原代细胞后，本发明将所述原代细胞培养12～16天，得到原代神经细胞亚群，将所述原代神经细胞亚群进行重复的依次进行的消化、传代培养，传代至第五代，得P5代细胞。在本发明中，所述原代细胞培养用培养基优选的为无血清培养基。在本发明中，所述原代细胞培养优选的每隔一段时间添加一次培养基，更换一次培养基，更优选的每隔3天添加一次，在本发明中，所述添加的体积更优选的为总培养液的1/10～1/8，在本发明中，所述添加最优选的为添加2次；在本发明中，所述更换的频率优选的为4天，所述更换的量更优选的为总培养液体积的1/3～1/4，所述更换最优选的为更换2次；在本发明中，所述培养基的更换方法优选为：待细胞培养到第7～8天，将细胞培养瓶取出，将培养瓶垂直竖立3～5分钟使细胞球沉底，取出1/3上清液，然后加入等量的新鲜培养基，培养瓶放平轻轻晃动，使培养液混匀，培养基更换完成后，迅速放入二氧化碳培养箱中培养，3～4天后，重复上述换液操作一次。
在本发明中，细胞培养到第12～16天时，细胞球直径＞350μm，将细胞收集起来，得到原代神经细胞亚群。在本发明中，所述细胞收集优选的为用无菌吸管将低吸附T75培养瓶中的神经球和培养液吸入50ml离心管中，100g，4℃，离心10min，使神经球充分沉淀到管底，尽量吸弃上清，得到原代神经细胞亚群。
得到原代神经细胞亚群后，本发明将所述原代神经细胞亚群进行消化。所述消化的步骤优选的包括：将所述原代神经细胞亚群离心后吸弃上清，添加无菌神经细胞消化液后在培养箱中作用10～50min，再次离心后吸弃上清，添加DMEM/F12使组织分离。在本发明中，所述离心优选的在离心力100g、温度4℃的条件下离心，所述离心的时间优选的为10min，使神经球充分沉淀到管底，尽量吸去上清；吸弃上清后，将无菌神经消化液注入装有原代神经细胞球的离心管中，所述无菌神经消化液的用量优选为5～50ml，更优选的为消化神经细胞亚群的量为2×107个～20×107个；加入消化液后，置于培养箱中作用10～50分钟，所述培养箱优选的为二氧化碳培养箱，所述培养箱优选的设置为35℃，在培养箱中，优选的每10分钟手动震荡一次，所述震动的时间优选的为5秒；培养箱中作用完成后，再次离心，所述再次离心的温度优选的为4℃，所述再次离心的离心力优选为300g，所述再次离心的时间优选的为10分钟；，再次离心后吸弃上清，加入5mL DMEM/F12冲洗，上下吹打2～3次，使组织分离；低温离心机4℃，300g，离心5～30分钟。
在本发明中，所述消化完成后，进行传代，所述传代优选的包括向消化完成的原代细胞亚群中加入缓冲液洗涤，吸弃上清后加入DMEM，使细胞沉淀悬浮均匀后接种，所述缓冲液的用量优选为1～10ml，所述洗涤优选的为洗涤三次；吸弃上清后，加入DMEM，所述DMEM的用量优选的为2ml，使细胞沉淀悬浮均匀，计数；在本发明中个，所述接种的密度优选的为1×105个/ml，所述接种优选的为接种到T75培养瓶中，得P2代细胞。在本发明中，从P2代细胞得到P5代细胞，经过相同的消化、传代过程，如此反复，直至获得P5代细胞。在本发明中，原代细胞传代到P5代细胞，细胞扩增15～30倍，纯度20％～30％纯化到85％～90％。
本发明中，将上述P5代细胞进行细胞亚群检测，检测阳性率合格的细胞作为种子细胞。在本发明中，所述细胞鉴定优选的包括细胞流式分析和异源微生物鉴定，所述细胞流式分析优选的包括检测NESTIN，Pax6，SOX2，Vimentin，Musash-1和NGFR六种细胞特异性标记物在所述细胞群上的表达情况，所述检测结果显示此细胞群的NESTIN阳性率在92％，PAX6的阳性率在86％，SOX2的阳性率在93％，Vimentin的阳性率在97％，Musashi-1的阳性率在98％，NGFR的阳性率在49％，此时，所述细胞群具备自我扩增能力，所述P5代细胞即为神经源干细胞亚群。在体外，采用细胞免疫荧光的方法，检测到经过重组因子SHH，成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)，糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂CHIR99021因子的诱导，该细胞群可分化为72％的神经元细胞，13％的星形胶质细胞，5％的少突胶质细胞，分化为多巴胺神经元的比例为26％；
在本发明中，所述异源微生物鉴定包括源病原体检测，无菌检测，支原体和内毒素检测，所述鉴定的方法优选的为本领域的常规检测方法，更优选的为药典方法检测，如检测合格将作为种子细胞，更优选的将该种子细胞冻存作为种子库。
得到种子细胞后，本发明将上述种子细胞培养扩增，传代到P6代～P9代，得到细胞亚群。在本发明中，所述种子细胞为种子库细胞时，优选的复苏种子库细胞，用完全无血清培养基培养，消化传代，直至培养到P9代。在本发明中，所述消化传代的方法优选的与上述消化传代方法相同。在本发明中P5代细胞～P9代细胞可扩增10～20倍。在本发明中，将所述细胞亚群连续传代，在体外可连续传代到32代，保持特异性标记物的表达不变，分化为神经元的能力不降低，端粒酶活性小于2，在本发明中得到的细胞亚群具有高扩增倍数，和高神经元转化率。
本发明还提供了一种所述细胞亚群在制备对脑损伤类疾病有治疗作用的药物中的应用。在本发明中，所述药物优选为注射液或滴鼻制剂；在本发明中，所述注射液中细胞亚群的浓度优选为(1×106～1×107)个细胞/200μL。在本发明中，所述注射液的制备方法包括：将所述细胞亚群溶于生理盐水中。在本发明中，所述滴鼻制剂的制备方法包括：将所述细胞亚群负载于微载体上，所述微载体包括明胶为载体、微胶囊或微球载体；将所述神经细胞亚群负载于明胶微载体的方法包括：将培养到P9代的神经细胞亚群5×106个细胞悬液100ul滴注到聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)明胶微载体上，明胶载体的为长0.5厘米,宽0.5厘米的正方形，制成滴鼻制剂，可放于鼻腔顶部。神经细胞亚群在明胶载体可长时间存活，24小时内，细胞存活率在92％，细胞活性为95％。另一方面，负载于明胶载体的神经细胞亚群在无血清培养基存在的条件可进行增殖：将负载于明胶载体的神经细胞亚群放在含有6ml无血清培养基的T25培养瓶中，放在二氧化碳培养箱培养，10天后可扩增5.3倍。将负载于明胶载体的神经细胞亚群放在分化培养条件下，可分化为神经胶质细胞和神经元。负载于明胶载体制成的滴鼻制剂，可以保证细胞在短时间内(24小时)的稳定存在，同时，明胶载体中的神经细胞亚群可沿鼻腔筛板—嗅球通路或三叉神经通路迁移进入大脑，从而更有效地治疗脑损伤疾病。
在本发明中，所述对脑损伤类疾病有治疗作用的药物的移植途径包括：鼻腔筛板吸附扩散、脑内局部定点注射、静脉回输和鞘内注射。
下面结合实施例对本发明提供的对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将脊髓组织置于100mm无菌培养皿的神经组织缓冲溶液中，用缓冲液反复冲洗。在解剖镜下，一手持眼科镊，另一手持眼科剪，剥去脊髓组织周围的结缔组织和周围血管膜用精细手术镊夹分离脊髓，放入35mm无菌培养皿的缓冲溶液中。再用精细手术镊将脊髓分割成约1mm大小的组织块。
将得到的组织和缓冲溶液用无菌一次性3ml滴管转移进入一个或多个15/50ml离心管，静置5分钟，使组织块充分沉淀到管底，尽量吸弃上清。然后用无菌注射器和0.22um滤膜进行无菌过滤，直接滤入离心管中，每个15ml离心管中需5ml消化液，之后进行轻微晃动。将离心管放入35℃二氧化碳培养箱消化，每5分钟手动振荡一次，消化30分钟后，离心300g，5分钟，20℃。最后用无菌一次性3ml滴管吸弃上清至约50ul处，用1ml枪头吸取950ul缓冲溶液加入离心管，轻柔吹吸10－15次，以致形成单细胞悬液。
配制20ml无血清完全培养基加入低吸附T75培养瓶中。根据计数得到的悬液细胞密度和100个细胞/ul的最终细胞接种密度，计算需接种的细胞悬液的体积。用无菌一次性吸管混匀细胞悬液，用合适量程的移液枪在液面下再吹打，取出计算体积的单细胞悬液，迅速加入低吸附T75培养瓶中，并轻轻从不同方向晃动容器，使细胞在培养液中均匀分布。将接种后的T75培养瓶迅速放入二氧化碳培养箱中。
原代细胞接种培养后，根据细胞生长情况及培养液外观，每过2～3天，从二氧化碳培养箱中取出T75培养瓶，放入生物安全柜中，加入2ml无血清完全培养基于低吸附T75培养瓶中，并轻轻从不同方向晃动，使细胞均匀分布。然后将培养瓶迅速放回二氧化碳培养箱中，连续2次加液。待细胞培养到第7～8天，将细胞培养瓶取出，将培养瓶垂直竖立3～5分钟使细胞球沉底，取出1/3上清液，然后加入等量的新鲜培养基。培养瓶放平轻轻晃动，是培养液混匀，迅速放入二氧化碳培养箱中。3～4天后，重复上述换液操作一次。细胞培养至14天，观察细胞生长状态，用无菌吸管将低吸附T75培养瓶中的神经球和培养液吸入50ml离心管中，100g，4℃，离心10min，使神经球充分沉淀到管底，尽量吸去上清，将吸取的上清液放入无菌容器中，得到原代神经细胞亚群。
将已配好的10ml神经消化液用无菌注射器注入装有原代细胞球的离心管中。将离心管口密封，静置3分钟。加入准备好的除菌神经组织消化液，放入35℃的二氧化碳培养箱中作用30分钟(每10分钟手动震荡一次5秒)；低温离心机4℃，300g，离心10分钟；吸弃上清，加入1～5mL DMEM/F12冲洗，上下吹打2～3次，使组织分离。低温离心机4℃，300g，离心10-20分钟；重新加入1～5mL缓冲液洗涤，共洗涤三次；吸弃上清；加入1～5mL DMEM，使细胞沉淀悬浮均匀，注意不要产生气泡使细胞沉淀悬浮均匀，然后用细胞自动计数仪计数。
根据计数得到的悬液细胞密度，计算需接种的细胞悬液的体积。按1×105个/ml的接种密度，将细胞悬液接种在低吸附T75培养瓶中，轻轻从不同方向晃动，使细胞在培养液中均匀分布。将接种后的低吸附T75培养瓶迅速放入二氧化碳培养箱中。此细胞记为P1代细胞。细胞接种培养后，根据细胞生长情况及培养液外观，每过2～3天加一次液，每3～4天换液一次。连续培养10～14天后，将细胞进行消化：将低吸附T75培养瓶中的神经球和培养液吸入50ml离心管中，100g，4℃，离心10min，使神经球充分沉淀到管底，尽量吸去上清，将已配好的5-50ml无菌神经消化液注入装有P2神经球的离心管中，放入35℃的二氧化碳培养箱中作用10-50分钟(每10分钟手动震荡一次5秒)，低温离心机4℃，300g，离心10分钟，吸弃上清，加入5mL DMEM/F12冲洗，上下吹打2～3次，使组织分离；低温离心机4℃，300g，离心5～30分钟；重新加入1～10mL缓冲液洗涤，共洗涤三次；吸弃上清，加入2mL DMEM，使细胞沉淀悬浮均匀，计数；然后按1×105个/ml的密度接种到T75培养瓶中，得P2代细胞，如此反复，直至获得P5代细胞。
将P5代细胞用于流式细胞鉴定，取2×106个细胞悬液，进行500g，3moin离心，弃上清；然后加入1.2ml生理盐水，混合均匀，分装于6支管中，做好标记。每只EP管中加100ul固定破膜液，4℃孵育，20分钟；加清洗液400ul，500g离心3分钟，弃上清；加入50ul清洗液，加入表1所列的同型或抗体，涡旋振荡30S，避光孵育30分钟；用PBS或生理盐水500g，3分钟离心洗涤两次，弃上清；用500ul的PBS或生理盐水重悬上流式细胞分析检测。检测结果如图2和图3所示。
表1流式细胞鉴定时加入的同型或抗体
管号 同型或抗体
1 无
2 lgG1κAlexaFluor647,lgG2aκAlexaFluor488
3 Sox2-5ul+Nestin-5ul
4 Musashi-5ul+Vimentin-5ul
5 Pax-65ul
6 CD2715ul
实施例2
利用购买得到的IPSC细胞，在6孔板中培养IPSC细胞，密度达80％-90％时，更换分化培养基(N2B27含5mmol/L SB431542,5mmol/L的drosomophorin)，然后每隔1天换1次培养基，第7天时将细胞刮下，转为预处理的6孔板中培养，培养基含有2％的N2和2％B-27。然后观察，2天细胞贴壁后，换液，继续培养，隔天换液，直至第15天。消化细胞,DMEM/F12培养基洗一遍，用无血清完全培养基培养在6孔板中培养1周，消化，离心，去上清后，吹散细胞，获得单细胞悬液。
获得单细胞悬液后的步骤与实施例1完全相同。
实验例1
利用实施例1～2得到的P5代细胞进行试验：
一、神经细胞亚群体外诱导神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞
A.取12孔板采用PLL(sigma，P4707)进行包被。
具体步骤包括：1).将PLL加入到12孔板中进行包被，每孔0.5ml；2).将12孔板放入37℃培养箱孵育2小时；3).用灭菌水洗涤三次，开盖置于生物安全柜中1小时使其干燥。
B.神经细胞群的自发分化
将悬浮培养中的神经细胞球(大小50-100um)连同培养基一起吸出，接种至包被好的12孔板中进行贴壁培养，每孔0.5ml，注意使各孔中细胞球数量相当，培养箱内培养8小时使神经球充分贴壁后补液1ml分化培养液，成分为：DMEM/F12溶液中加入B27(50:1)，N2(100:1)，Glutamin(100:1)，丙酮酸钠(100:1)。培养2周使细胞球中细胞分散贴壁并自发分化，每三天进行换液，吸走1ml分化培养液，再加入1ml新鲜分化培养液。
C.神经球自发分化比例的鉴定
将分化完成的细胞用4％多聚甲醛进行固定。进行相应的一抗和二抗染色(如下表2)。拍照并进行分析。
表2经球自发分化时一抗二抗染色表
具体实验步骤如下：
1)神经细胞固定
将12孔板带入通风橱室，用一次性吸管加入1ml/孔冰的PBS洗涤，轻轻晃动后吸弃上清，再加入1ml/孔冰上预冷的PHEM固定液，轻轻晃动，确保固定液全部覆盖细胞，盖好盖子，平放培养板，用定时器倒计时10分钟。固定完成后，吸出PHEM固定液至特定废液存储瓶中。
2)1×PBS洗涤
用一次性吸管加入PBS缓冲液，每孔1mL，洗涤3次，每次5分钟。吸掉PBS缓冲液后立即靠边加入新的PBS缓冲液，保持细胞湿润，避免使培养皿干燥而造成细胞变形脱落。
3)血清封闭
将固定好的培养板中的1×PBS吸出，用1ml移液枪加入含Triton破膜抗体稀释液(10％normal donkey serum/0.1％Triton/PBS)500ul/每孔(作为含Triton抗体反应前的封闭血清)，轻轻晃动，盖好孔板盖，平放，室温封闭1小时。
4)一抗反应
一抗工作液的配制：从冰箱中拿出破膜抗体稀释液和一抗，配制各一抗的工作液。一抗工作液的加入：孔板上做好标记，用移液枪在各孔中吸出封闭液，然后加入对应的一抗工作液，每孔加入500μL。盖好盖子，用铝箔包好孔板，水平放入4度冰箱中反应过夜。
5)一抗洗涤
将上一步的孔板从4度冰箱中取出，加入1mL/孔PBS缓冲液，轻轻晃动孔板。共3次，每次5分钟。
6)二抗反应
二抗工作液及DAPI配制及加入：从冰箱中拿出含Triton抗体稀释液和二抗。按照要求配制各一抗对应的二抗工作液。将洗涤好的孔板取出，用移液枪在各孔中吸出PBS缓冲液，然后加入相对应的二抗工作液，每孔500μL。盖好盖子，用铝箔包好孔板，室温反应1小时。然后取出孔板，加入1mL/孔PBS缓冲液。轻轻晃动孔板，洗涤5分钟。吸弃后加入新PBS缓冲液洗涤。PBS共反复洗涤5次，每次5分钟。
染色完成后的孔板可以直接进行下步数据采集工作。
C.免疫组织化学染色的数据采集
将染好色的孔板带入显微镜室。使用荧光显微镜进行拍照。按照不同荧光二抗的激发波长分别拍照，为图片的merge做准备。分别在10X和20X倍物镜下，每孔随机取三个视野进行拍照，结果见图4。图4显示出在分化条件下神经细胞亚群分化神经胶质细胞(GFAP)(A)、为神经元(TUJ1)和少突胶质细胞(C)的情况，图4D示各个神经细胞的分化比例。
实验例2
神经细胞亚群治疗缺血缺氧型小儿脑瘫模型大鼠的效果评价：
将SPF级出生后7天的SD大鼠(13-19g，雌雄各半)，用乙醚麻醉，动物固定并暴露左侧颈总动脉，用电凝器进行横断，待其恢复1.5小时，然后在7.8％O2、92.2％N2的低氧箱中进行缺氧2小时(HI)。模型成功后24小时，给予此神经细胞亚群鼻腔注射，细胞数为3x105/6ul，左右各3ul，两次间隔时间5分钟。实验分组：
正常组(正常动物)—给予生理盐水；
对照组(正常动物)—给予该神经细胞亚群；
模型对照组(模型动物)—给予生理盐水；
模型给药组(模型动物)—给予该神经细胞亚群。
疗效检测和机理探索：
鼻腔给予神经细胞群注射液3h后，PKH-26(红)标记的细胞(3×105细胞/动物)在SD大鼠头部的在体生物发光，SD大鼠头部的在体生物发光成像明显；脑中总的荧光强度明显强于生理盐水给药组；细胞在脑内主要分布在嗅球，皮质，胼胝体和海马区域。
神经细胞亚群治疗对脑损伤的长期影响，结果如图5所示。切片中脑损伤的面积和损伤对侧的脑面积均进行了计算，结果如图6所示。可见神经细胞群给予后能显著减少脑损伤模型造成的脑梗死面积(模型组大鼠5只，给药组大鼠6只)。
神经细胞亚群治疗能够明显改善脑损伤模型鼠损伤后动物的感觉，学习，记忆和认知能力，实验结果如图7所示。
由图(B)可见在给药后第3天，此细胞能显著降低翻正实验所需的时间；
由图(C)可见在给药后第5天，此细胞能显著降低步态分析的时间。
在获得性试验中，模型组大鼠的潜伏期明显比给药组和对照组大鼠潜伏期长；在保留试验中，模型组大鼠和正常组大鼠和给药组大鼠相比，在目标象限所花费的时间和跨越平台的频率都显著降低，具体结果如图8所示。
鼻腔给药后第3天采用western blot对IL-1β，磷酸化IκBα，和NF-κB p65的表达量进行检测，结果如图9所示，脑损伤增加了细胞内IL-1β，磷酸化IκBα和NF-κB P65的表达，而治疗细胞给予后能逆转这一过程。对于细胞核NF-κB，hNSCs能显著的增强其表达。
实验例3
神经细胞亚群对免疫功能的调节作用：
以RPMI-1640完全培养基(含10％FBS)为重悬培养基，将外周血单核细胞PBMC重悬，调节浓度至1×106个/ml，按照每孔1ml的加液量加入6孔transwell下室，加入1ml已培养至适宜状态的神经细胞亚群于6孔transwell上室，加入比例分别设置为，神经细胞与PBMC细胞比例为1:5、1:1、5:1，以考察细胞比例影响，同时设置单独含有每种对应浓度的淋巴细胞孔以及单独的神经细胞孔作为对照孔。在5％CO2、37℃环境下共培养2天，检测每个孔中PBMC细胞的表型(CD3+CD4、CD3+CD8)以及PBMC增值率。此发明中所述的特定神经源细胞群对免疫细胞增殖有抑制作用。
结果显示：当待测细胞与外周淋巴细胞1：5混合培养时，增值的淋巴细胞比例由95.6％抑制到68.1％，增值抑制率为28.7％；当待测细胞与外周淋巴细胞1：5混合培养时，Th1的比例由21.17％抑制到7.54％，增值抑制率为68.8％；Th2的比例由0.75％抑制到0.31％，增值抑制率为60.1％；Th17的比例由0.52％抑制到0.21％，增值抑制率为62.4％；Treg细胞的比例由9.85％增值到10.9％，增值促进率为10.7％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种对脑损伤类疾病具有治疗作用的细胞亚群，可逆转脑损伤后的的异常表达，对于细胞核NF-κB，该细胞能显著的增强其表达，且对外周淋巴细胞没有明显的刺激作用，反而对淋巴细胞和免疫细胞的增殖具有抑制作用，反映了较低的免疫原性可以抑制免疫细胞增殖；动物药效学实验表明此细胞群注射液经鼻腔筛板或脑内定点注射给予脑损伤模型大鼠，可改善脑损伤大鼠的运动平衡能力和脑损伤面积，并且移植的细胞群可在脑内存活35天以上，并已分化为功能性神经元，所有实验动物未出现免疫反应，成瘤组织，没有发生意外死亡，显示了较好的安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种对脑损伤类疾病有治疗作用的细胞亚群，其特征在于，所述细胞亚群来源于成体神经组织或诱导多能干细胞；
所述细胞亚群利用特异性标记物进行细胞亚群检测，所述特异性标记物包括巢蛋白、PAX6、SOX2、波形蛋白、Musashi-1和NGFR；所述细胞亚群检测的巢蛋白阳性表达率为90％～99％，PAX6阳性表达率为80％～90％，SOX2阳性表达率为90％～9％，波形蛋白的阳性率为95％～99％，Musashi-1的阳性表达率为85％～99％，NGFR的阳性率为40％～60％。
2.权利要求1所述的细胞亚群的制备方法，包括以下步骤：
1)将成体神经组织或诱导多能干细胞消化的单细胞悬液接种到无血清完全培养基中进行悬浮培养，得到原代细胞；
2)将步骤1)得到的所述原代细胞培养12～16天，得到原代神经细胞亚群，将所述原代神经细胞亚群进行重复的依次进行的消化和传代培养，传代至第五代，得P5代细胞；
3)将步骤2)得到的所述P5代细胞进行细胞亚群检测，检测阳性率合格的细胞作为种子细胞；
4)将步骤3)得到的所述种子细胞进行扩增传代培养，传代至P6代～P9代，得到细胞亚群。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述无血清完全培养基以DMEM/F12为基本培养基，包含终浓度为1～5％(v/v)的B-27、0.5～2.5％(v/v)的N2、0.01～0.05ug/ml的神经营养因子，0.01～0.05ug/ml的EGF，0.005～0.025ug/ml的LIF，1.0～3.0mmol/L的L-谷氨酰胺，0.5～1.5mmol/L的丙酮酸钠和0.5～1.5mmol/L的NAC。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述悬浮培养为在35℃下，体积分数为5％的二氧化碳条件下培养。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述消化使用的消化酶为木瓜蛋白酶、DNA酶I和L-半胱氨酸盐酸盐消化酶中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述细胞亚群检测为将所述P5代细胞做细胞流式分析和异源微生物鉴定。
7.权利要求1所述细胞亚群在制备对脑损伤类疾病有治疗作用的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为注射液或滴鼻制剂；所述注射液或滴鼻制剂中细胞亚群的浓度为(1×106～1×107)个细胞/200μL。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述注射液的制备方法包括：将所述细胞亚群溶于生理盐水；所述滴鼻制剂的制备方法包括：将所述细胞亚群负载于微载体上。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的移植途径包括：鼻腔筛板吸附扩散、脑内局部定点注射、静脉回输和鞘内注射。
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