CN109609554A - 一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建LentiCRISPR v2‑mir338重组质粒；S2.将S1所得LentiCRISPR v2‑mir338重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；S3.将S2所得慢病毒颗粒转染HUMSCs，即得到基因工程化的HUMSCs。HUMSCs经沉默mir338基因表达后，细胞增殖速度加快，将HUMSCs注射到脑损伤小型猪颅内，对脑损伤有较好的治疗效果。

Description

一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及基因工程与生物医学工程技术领域，具体地，涉及一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是指局部脑组织包括神经细胞和胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的病变、坏死或功能瞬态损耗。目前，缺血性脑血管疾病在全部脑血管病中約占80％，并且脑缺血疾病有着发生率高，死亡率高，复发率高，致残率高等特点。而我国是卒中高发的国家，每年新发脑卒中200万人，卒中死亡人数约250万人，年增长率达8.7％。临床上因大脑中动脉闭塞导致的缺血性脑血管病占绝大多数。目前，随着医疗水平和医疗服务条件的提高，特别是急救手段和治疗效果的提高，使得脑卒中患者的死亡率逐渐下降，而生存下来的脑卒中患者大约有75％的人遗留不同程序的致残，严重影响患者的日常生活活动能力和社交能力，给家庭和社会带来了巨大的负担，因此，研究脑缺血的治疗及康复，降低其死亡率和致残率，对提高患者的生活质量有着极大的意义。

干细胞是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞，主要存在于胚胎、骨髓、外周血、脐带血等处，而血液(外周血、脐带血)中的干细胞，目前发现有造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)两种。脐带血中干细胞含量丰富，明显超过外周血含量。MSCs是混合细胞群，不具备典型的形态特征，其表达的表面标志抗原具有非单一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，目前没有找到MSCs的特异性抗原标记，鉴定MSCs主要是根据其形态、功能等。许多研究证明MSCs均标记为：SH₂(+)、SH₃ (+)、CD₂₉(+)、CD₄₄(+)、CD₇₁(+)、CD₉₀(+)、CD₁₀₅(+)、CD₁₀₆(+)、CD_120a (+)、CD₁₂₄(+)、CD₁₆₆(+)。MSCs在体外可分化为神经样细胞。如在脑源性神经营养性因子、碱性成纤维生长因子的诱导或脑组织细胞共培养，MSCs能分化为具有神经元和神经胶质细胞标志的细胞。

脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞之一，其来源丰富、采集方便、安全、无伦理问题，且具有免疫调节作用等特点，决定了其在临床治疗方面具有很大的应用前景。目前干细胞的临床应用有两种方法：一是直接将脐带血间充质干细胞移植体内，通过体内的微环境诱导其为相应的细胞，发挥相应的作用；二是将脐带血间充质干细胞体外培养、定向诱导其分化为目的神经样细胞，然后通过一定的方法植入到体内，治疗相关神经系统疾病。脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞，具有多向分化潜能，在体外能够定向诱导分化为各种神经细胞，为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。

miRNA的特点之一是具有高度的组织特异性。脑组织中存在一些特有的或含量异常丰富的miRNA，调控着大脑中至少30％的蛋白质编码基因，与脑组织细胞的生长发育和功能密切相关。其中，miR-338主要存在于神经元远端轴突中，凋亡相关酪氨酸激酶 (AATK)为其靶点。AATK和miR-338均为髙度保守基因，在脊椎动物中枢神经系统中显著表达。AATK表达水平增高促进了神经突触的生长。上调AATK可促进体外培养的小脑颗粒神经元的调亡。说明一定量的AATK对于神经元生长和维持动态平衡是非常重要的。miR-338主要通过抑制AATK的表达，来控制神经细胞调亡。Jeyaseelan K等研究结果显示，miR-338在大鼠的脑组织和血液样本中均出现了表达下调。Dharap等研究发现 miR-338在大鼠缺血再灌注3h、6h和24h时表达下调，以再灌注24h表达下调最明显，但在再灌注3d时其表达有恢复趋势。

miR-338对疾病的病理生理、发病机制的调控作用为疾病开辟了新的诊治思路，其临床应用前景十分广泛。由于缺血性脑卒中的病理生理机制复杂，目前对于缺血性脑损伤中具体调控机制的认识还不是很清楚。因此，需要进一步的深入研究miR-338的作用点、发挥的功能及在缺血性脑损伤整个病理生理过程中的作用机制。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞的制备方法，所述脐带间充质干细胞通过沉默mir338基因的表达，刺激细胞增殖速度加快，进而治疗小型猪脑损伤。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的基因工程化的mir338基因沉默的脐带间充质干细胞。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法中所述的LentiCRISPR v2-mir338重组质粒、慢病毒颗粒和/或mir338基因沉默的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供mir-338基因在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建LentiCRISPR v2-mir338重组质粒；

S2.将S1所得LentiCRISPR v2-mir338重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；

S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的mir338基因沉默的脐带间充质干细胞。

本发明所述脐带间充质干细胞经沉默mir338基因后，细胞增殖速度加快；此外，发明人构建了西藏小型猪介入梗阻模型，将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明对脑损伤有较好的治疗效果。行为学结果显示：缺血缺氧模型组西藏小型猪出现明显的一侧偏瘫及抽搐的症状，无法站立行走；干细胞治疗组及脐带间充质干细胞经基因修饰组在治疗后7天小型猪出现明显的好转，抽搐停止，并可站立缓慢行走。综上，表明本发明所述沉默mir-338表达的脐带间充质干细胞可用于治疗西藏小型猪脑损伤，尤其对由脑缺血引起的脑损伤有较好的治疗效果。

优选地，所述慢病毒系统载体为LentiCRISPR v2。

优选地，所述宿主细胞为293T细胞。

优选地，步骤S2中，所述慢病毒颗粒的MOI指数为10。

优选地，步骤S3中，转染时间为4h。

本发明还请求保护上述制备方法制备得到的基因工程化的mir338基因沉默的脐带间充质干细胞。

本发明还请求保护上述LentiCRISPR v2-mir338重组质粒、慢病毒颗粒和/或mir338 基因沉默的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。

此外，本发明人还构建了过表达mir-338的重组质粒，发现过表达mir338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后，引起了细胞增殖减慢，表明过表达mir-338不能治疗脑损伤。

本发明还请求保护mir-338基因在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。

优选地，所述制剂沉默mir-338基因的表达。通过沉默mir-338基因的表达，促进细胞增殖，进而达到治疗缺血型脑损伤的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的脐带间充质干细胞沉默mir338基因表达后，细胞增殖速度加快；将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明对脑损伤有较好的治疗效果，可用于制备治疗脑损伤的药物或制剂，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为人脐带血干细胞表面分子鉴定结果；其中，A为IgG，B为CD73，C为CD90， D为CD105，E为CD34。

图2为过表达mir338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后的显微镜图片；其中，A为荧光显微镜镜下图，B为普通显微镜镜下图。

图3为过表达mir338的重组质粒转染人脐带血间充质干细胞后细胞增殖情况。

图4为LentiCRISPR v2-mir338转染脐带间充质干细胞后的显微镜图片；其中，A为荧光显微镜镜下图；B为普通显微镜镜下图。

图5为实施例5中HE染色的病理结果。

图6为实施例5中Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色结果；其中，A为CD11b 免疫细胞化学的结果，B为GFAP免疫细胞化学的结果，C为Nestin免疫细胞化学的结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1过表达mir-338慢病毒颗粒的构建及鉴定

1、目的质粒的获取

采用慢病毒系统载体pLVX-DsRed-Monomer-N1，将目的基因的cDNA序列连接到载体上，酶切位点：AsuII/BamHI，用基因合成的方法获得目的质粒 mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1，重组质粒mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1的序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGC AGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGA AGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGG AGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACA AGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGC TGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCC TCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAG TCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCG GCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA GATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAAT ATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAG ACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGT GTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGC AAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAA ATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCC TTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT GCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCA AGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTG TGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAA TTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGG GCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAA GAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAG 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2、重组质粒转化感受态细胞

重组质粒mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1加入预冷的感受态细胞冰浴30min；42℃热敷90s(期间不要振荡)；再次冰浴2～3min；加入800μL L.B.液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200r/min振荡培养45min；吸取100μL菌液涂布于Kan抗性平板，并于培养箱中先正置培养1h，后倒置培养12～16h。挑取抗性平板上的菌落，分别接种于 LB液体培养基中培养(含10μg/mL卡那霉素)，于37℃、200r/min振荡培养过夜，用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒。

3、慢病毒颗粒的包装及MOI测定

采用mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1重组质粒与两个包装质粒(pMD2.G，pSPAX) 对293T细胞进行共转染。分别于第3天和第6天收集病毒液并使用Lenti-XConcentrator 慢病毒浓缩系统(Clontech，TaKaRa，CA)进行浓缩。病毒感染复数(multiplicity of infection， MOI)应用Lenti-X GoStix(Clontech，TaKaRa，CA)进行检测。未重组目的基因的空质粒pLVX-DsRed-Monomer-N1也同时被包装生产作为空载体对照组。

结果表明，慢病毒颗粒的MOI指数为10。

实施例2 mir-338过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞

1、人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定

用含10％FBS的DMEM低糖培养基培养HUMSCs，将细胞置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。每日使用倒置显微镜观察细胞1次，隔2～4天换培养液一次。培养瓶中的细胞生长到80％～95％融合时进行细胞传代或收集细胞铺板培养。弃去旧培养液，加入 0.25％胰酶消化液2mL，细胞变圆﹑上浮后，加入4mL培养液终止消化，再转移至无菌离心管中，于1000r/min离心4min，弃上清液，以1:4～1:6比例转移至新的无菌培养瓶中培养。

弃培养瓶内旧培养基，PBS洗涤细胞三次，加入胰蛋白酶消化收集细胞。PBS洗涤细胞沉淀3次，用细胞染色缓冲液(含1％FBS的PBS)重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为 3×10⁶cells/mL。吸100μL细胞悬液加入到1.5mL管中，加入2μL抗体，轻轻混匀后，4℃孵育30min。加入1mL染色缓冲液洗涤细胞3次，于250×g离心5min，弃上清。加入400μL 染色缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测脐带血干细胞表面分子。

鉴定结果如图1所示，人脐带间充质干细胞低表达CD34、CD19、CD45、CD11b和 HLA-DR，表达率≤2％；高表达CD73、CD90、CD105，表达率≥95％。

2、慢病毒转染HUMSCs

HUMSCs于转染前一天以1×10⁵cells/孔接种于6孔板，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养过夜。对于每一待转的6孔板的每孔，按如下准备：于一无菌的EP管中加入2μg 待转质粒，加入Opti-MEM无血清培养基至体积为200μL，轻轻吹打均匀，按转染试剂(μL) 与质粒(μg)1.5:1的比例加入3μL转染试剂到上述EP管内，轻轻吹打均匀，室温静置 20min。向6孔板每孔内加入200μL转染混合物，轻轻混匀，6孔板于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养。转染4h后，弃孔内液体，PBS冲洗一次后加入DMEM完全培养基继续培养48h，弃孔内培养基，收集细胞，提取细胞总RNA。

并在荧光显微镜和普通显微镜下观察慢病毒转染结果，结果如图2所示，表明mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1质粒在脐带间充质干细胞中高表达绿色荧光蛋白。

3、MTT检测细胞增殖实验结果

收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度5.0～6.0×10⁴Cells/mL，接种96孔板，每孔加100μL的细胞悬液约5000～6000个细胞，在37℃、5％CO₂条件下孵育过夜。待细胞铺板孵育过夜后(16～24小时)，弃去原培养基，按以上分组及处理，置于37℃含5％CO₂培养箱中孵育分别24、48、72小时后；分别向每孔中加入10μL5mg/mL MTT溶液，继续于细胞培养箱内培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养基，每孔加入200μL DMSO，置于摇床上室温低速振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪上测定OD₄₉₀。以时间为横坐标，OD₄₉₀为纵坐标绘制细胞生长曲线。

如表1和图3所示，过表达mir338的质粒转染人脐带血间充质干细胞后引起了细胞增殖减慢。

表1稳转细胞株增殖检测结果(MTT)

实施例3沉默mir-338慢病毒颗粒的构建及鉴定

1、目的基因获取

采用慢病毒系统载体LentiCRISPR v2，将目的基因的cDNA序列连接到载体上，酶切位点：BamHI/Apa I，用基因合成的方法获得目的质粒LentiCRISPR v2-mir338，重组质粒LentiCRISPR v2-mir338的序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:2

TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCA ATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGG CTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGT AACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACC AGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATT TTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTC GGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGG CCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTA TATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGC AAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAAT TATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGC AGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCC AGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCT GGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGG AAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATG GAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAG AATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGAT AGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTT CAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTC GATTAGTGAACGGATCGGCACTGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTG GGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCA 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GATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATC TTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGA CAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTG GACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATG GCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCA GCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAG AACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGA CCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAG ATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCC 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CCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTG CTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACA GCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGT GGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTC GAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGT GAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCAC AAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGT CCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCC TGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAG 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ATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAG CGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTT CTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT CTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATT TCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAA GTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCA GCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGC CCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCAC GTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGC CGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGAC GACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGG TGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGAC CGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGA TCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGT ATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACA ACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGC TTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCA CAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTT TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATAC CAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACC CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAA GAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGC TGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGG TCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATT AAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTC AGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAA GTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCG CAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGG CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGT TATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAAC CAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCA CTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAA GGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG AGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACG 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2、重组质粒转化感受态细胞

重组质粒加入预冷的感受态细胞冰浴30min；42℃热敷90s(期间不要振荡)；再次冰浴2～3min；加入800μL L.B.液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200r/min振荡培养45min；吸取100μL菌液涂布于Kan抗性平板，并于培养箱中先正置培养1h，后倒置培养 12～16h。挑取抗性平板上的菌落，分别接种于LB液体培养基中培养(含10μg/mL卡那霉素)，于37℃、200r/min振荡培养过夜，用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒。

3、慢病毒颗粒的包装及MOI测定

采用LentiCRISPR v2-mir338重组质粒与两个包装质粒(pMD2.G，pSPAX)对293T细胞进行共转染。经培养、富集后即得高滴度病毒浓缩液。病毒感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)应用Lenti-X GoStix(Clontech，TaKaRa，CA)进行检测。未重组目的基因的空质粒LentiCRISPR v2也同时被包装生产作为空载体对照组。

结果表明，慢病毒颗粒的MOI指数为10。

实施例4 mir-338基因沉默慢病毒转染脐带间充质干细胞

1、参照实施例2所述方法进行人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定，以及转染HUMSCs，并采用MTT检测细胞增殖实验。

2、结果

(1)慢病毒质粒转染细胞

在荧光显微镜和普通显微镜下观察慢病毒转染结果，结果如图4所示，表明LentiCRISPR v2-mir338质粒在脐带间充质干细胞中高表达绿色荧光蛋白。

(2)MTT检测细胞增殖实验结果

结果如表2所示，LentiCRISPR v2-mir338质粒转染组和丹参注射液诱导组一样细胞增殖较空白组和LentiCRISPR v2质粒转染组快。

表2稳转细胞株增殖检测结果(MTT)

实施例5西藏小型猪介入梗阻模型的制备及基因修饰(沉默mir-338)的脐带间充质干细胞对脑损伤的治疗

1、西藏小型猪介入梗阻模型的制备

21只西藏小型猪(3～4月龄，体重10～15kg)，编号后，采用完全随机方法分成4组，放入半开放环境中饲养：对照组(3只)、介入梗阻模型组(5只)、MSC细胞治疗组(5只)、pUC-MSC-mir-338治疗组(5只)、丹参注射液治疗组(3只)。室温28～ 30℃，监测心率、血压、血氧饱和度。颈外静脉内留置套管针作为静脉通道。

3％戊巴比妥钠(1mg/kg)，腹腔注射麻醉动物。新生猪仰卧位固定，钝性分离各层组织，暴露股动脉，仔细分离避免损神经，置线备用。于股动脉处用动脉夹夹闭，动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。全麻下经股动脉插管至小型猪的双侧咽升动脉进行血管造影，观察评估其脑血管解剖等的情况。实验过程中监测心率、血氧饱和度。

2、基因修饰(沉默mir-338)的脐带间充质干细胞对脑损伤的治疗

选择以左侧尾状核为目标区进行穿刺注射。小型猪脑缺血后24小时，经3％戊巴比妥钠(1mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪，头皮正中切开，分离骨膜，暴露前囟，于颅骨背侧前囟后1.0mm，左旁开3.5mm处钻一直径为2.0mm的小孔，小型猪严格按照立体定位图谱及铸形标本测量，前囟后1.0mm，左旁开3.5mm，进针深度5.0mm 位置进行穿刺。MSCs组和沉默mir-338组以0.2μL/min的速度恒速注射15mL脐带间充质干细胞，注射结束后，留针5min，缓缓移出针头。以同样方法注射等量PBS到对照组。

治疗后14天处死，通过行为学检测、Netin、CD116、GFAP免疫组织化学染色观察神经干细胞增殖、分化及在小型猪脑内分布情况，脑部HE染色的切片观察。

3、结果

(1)行为学检测

行为学结果显示：缺血缺氧模型组西藏小型猪出现明显的一侧偏瘫及抽搐的症状，无法站立行走。干细胞治疗组及脐带间充质干细胞经基因修饰组在治疗后7天小型猪出现明显的好转，抽搐停止，并可站立缓慢行走。综上，表明本发明所述沉默mir-338表达的脐带间充质干细胞可用于治疗西藏小型猪脑损伤，尤其对由脑缺血引起的脑损伤有较好的治疗效果。

(2)HE染色的病理结果

如图5所示，能够看出局部小脑皮层大面积坏死，残留组织松散，神经元大量减少，并伴有大量炎性细胞浸润，如黑色箭头所示。

(3)Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色结果

制备的细胞爬片培养约3d后，弃孔内旧培养基，PBS冲洗3次，预冷的4％多聚甲醛固定10min。分别加入Nestin、GFAP、CD11b抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，然后加入200μLFITC标记的二抗，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下孵育1h。PBS冲洗3次，然后加入DAPI染液，避光染核10min后用PBS冲洗，然后50％甘油封片后于荧光显微镜下观察。

结果如图6所示，阳性细胞数表达量明显增强。

综上所述，经沉默mir338基因表达的脐带间充质干细胞对西藏小型猪的脑损伤有显著的治疗效果，可用于制备治疗脑损伤的制剂或药物。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用

<140> 2018114476331

<141> 2018-11-29

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9393

<212> DNA

<213> 重组质粒mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1(Recombinant plasmid)

<400> 1

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

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agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

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tatttgttaa atatgtacta caaacttagt agt 9393

<210> 2

<211> 13015

<212> DNA

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<400> 2

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cctcagagct ttctgaagga cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag 5220

aaccggggca agagcgacaa cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac 5280

tggcggcagc tgctgaacgc caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag 5340

gccgagagag gcggcctgag cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg 5400

gaaacccggc agatcacaaa gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag 5460

tacgacgaga atgacaagct gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg 5520

gtgtccgatt tccggaagga tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac 5580

cacgcccacg acgcctacct gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct 5640

aagctggaaa gcgagttcgt gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc 5700

gccaagagcg agcaggaaat cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc 5760

atgaactttt tcaagaccga gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg 5820

atcgagacaa acggcgaaac cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc 5880

gtgcggaaag tgctgagcat gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca 5940

ggcggcttca gcaaagagtc tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga 6000

aagaaggact gggaccctaa gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct 6060

gtgctggtgg tggccaaagt ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag 6120

ctgctgggga tcaccatcat ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg 6180

gaagccaagg gctacaaaga agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc 6240

ctgttcgagc tggaaaacgg ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag 6300

ggaaacgaac tggccctgcc ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat 6360

gagaagctga agggctcccc cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac 6420

aagcactacc tggacgagat catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg 6480

gccgacgcta atctggacaa agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc 6540

agagagcagg ccgagaatat catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc 6600

gccttcaagt actttgacac caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg 6660

ctggacgcca ccctgatcca ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg 6720

tctcagctgg gaggcgacaa gcgacctgcc gccacaaaga aggctggaca ggctaagaag 6780

aagaaagatt acaaagacga tgacgataag ggatccggcg caacaaactt ctctctgctg 6840

aaacaagccg gagatgtcga agagaatcct ggaccgaccg agtacaagcc cacggtgcgc 6900

ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac 6960

taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg 7020

caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac 7080

ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc 7140

gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg 7200

gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcgga 7260

gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag 7320

gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc 7380

ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc 7440

acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgaacgcgtt aagtcgacaa tcaacctctg 7500

gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 7560

tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 7620

ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 7680

aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 7740

gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 7800

gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 7860

aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc 7920

acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 7980

cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 8040

cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcgtc gactttaaga ccaatgactt 8100

acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 8160

ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 8220

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 8280

gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 8340

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagggcccgt ttaaacccgc 8400

tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 8460

ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 8520

gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 8580

aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 8640

tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc 8700

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 8760

ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 8820

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 8880

gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 8940

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 9000

ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 9060

tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt 9120

ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 9180

aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 9240

gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 9300

cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 9360

ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt 9420

gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca 9480

ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 9540

ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct 9600

caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg 9660

ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag 9720

cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct 9780

ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg 9840

gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc 9900

ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtgc tacgagattt 9960

cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 10020

ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt 10080

tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 10140

atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 10200

ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 10260

gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 10320

agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 10380

tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 10440

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 10500

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 10560

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 10620

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 10680

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 10740

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 10800

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 10860

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 10920

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 10980

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 11040

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 11100

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 11160

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 11220

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 11280

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 11340

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 11400

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 11460

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 11520

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 11580

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 11640

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 11700

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 11760

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 11820

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 11880

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 11940

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 12000

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 12060

gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 12120

atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 12180

cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 12240

gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 12300

gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 12360

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatctccc 12420

gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 12480

ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca 12540

acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg 12600

ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa 12660

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 12720

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 12780

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 12840

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 12900

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 12960

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgg 13015

Claims (9)

1.一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建LentiCRISPR v2-mir338重组质粒；

S2.将S1所得LentiCRISPR v2-mir338重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；

S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的mir338基因沉默的脐带间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述慢病毒系统载体为LentiCRISPRv2。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述慢病毒颗粒的MOI指数为10。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，转染时间为4h。

6.权利要求1～5任一所述制备方法制备得到的基因工程化的mir338基因沉默的脐带间充质干细胞。

7.权利要求1中所述的LentiCRISPR v2-mir338重组质粒、慢病毒颗粒和/或mir338基因沉默的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。

8.mir-338基因在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述制剂沉默mir-338基因的表达。