CN102071213B - 分泌型碱性磷酸酶示踪ta克隆真核表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其是在真核表达启动子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆位点。本发明所述载体可利用培养基上清进行检测；可利用化学发光仪器进行检测，不仅灵敏度高而且可以根据标准碱性磷酸酶的对照进行定量；发明人把目的基因插入位点改造成TA克隆载体位点，因此可以把PCR产物直接插入到报告基因载体，既节省了时间又节省了科研成本。

Description

分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体，具体地说是一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体。

背景技术

真核基因在细胞内的临时表达对于研究基因在细胞内的功能具有重要意义，在当今大多数高水平的论著中多用真核表达质粒来实现，然而由于质粒转染真核细胞的效率与转染试剂、细胞类型、细胞状态等有很大的关系。其转染效率从低到小于1％到高达90％以上不等。而转染效率又直接影响到后续的研究结果。一般低于10％的转染效率就很难达到预期的效果，不仅浪费了材料而且导致研究失败。

目前现阶段转染效率很难估计，通常需要转染大量荧光蛋白基因用以分选转染细胞。同时由于在同一实验中不同的转染效率差异直接影响到结果的可比性，因此构建一个具有示踪作用的真核转染质粒具有重要意义。

分泌型碱性磷酸酶在科研上被广泛用于启动子研究的报告基因，是一个很好的真核转染示踪蛋白。目前被广泛应用的基因表达示踪蛋白为EGFP，可通过荧光显微镜直接观测转染效率，但不能进行定量分析。另外还有β-半乳糖苷酶基因，通过化学显色或ELISA进行半定量且操作复杂，还有荧光蛋白酶等。但所有上述现有技术都需要基于细胞或细胞裂解物进行研究。还有通过示踪基因载体和目的基因载体共转染的办法来评估细胞转染效率，而这种方法很不稳定。

发明内容

本发明目的在于提供一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体。

本发明的另一目的在于提供上述示踪载体的构建方法。

本发明的发明思路基于下述两方面的考虑。第一，在科学研究中，广泛使用真核表达载体进行瞬间转染来研究基因的功能，而载体的转染效率直接影响到研究的结果。好多真实的基因功能因为转染效率低或不一致而被掩盖，因此选择一个能清楚得知转染效率的示踪物非常重要。分泌型碱性磷酸酶作为示踪物正好能满足这一要求；第二，多数研究的基因是通过RT-PCR直接从组织细胞获得，而普通Taq酶具有3’末端腺嘌呤转移酶活性，因此PCR产物往往在其3’末端突出一个A，结果导致PCR产物不能直接插入平端质粒载体，而需要插入3’末端有T突出的载体即“T载体”。我们把分泌型碱性磷酸酶示踪真核表达载体构建成一个能把目的基因插入到由CMV启动子调控的TA克隆位点，从而构成一个分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体。为实现这一目标，我们将含双AhdI酶切位点的寡核苷酸插入到CMV启动子的下游，从而构建了一个分泌型碱性磷酸酶示踪的T载体。该TA克隆位点直接位于真核表达启动子(CMV)的下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游，因此当质粒被转入细胞后，CMV启动子可直接启动插入PCR序列全长的转录而实现目的基因的表达。

为了达成本发明上述目的，本发明采用如下具体技术方案：

本发明提供了一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，所述载体是在真核表达启动子下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆位点。

本发明所述载体的碱基序列如SEQ ID No.10所示。

本发明分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体是利用下述方法构建的，步骤为：

1、原核TA克隆载体：把TA位点引入pUC19载体构建成pUC19-TA载体；

所述步骤具体为：

1.1首先合成两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸，退火形成双链DNA；

TA-oligo-s：

5’P-AATTCACTAGTGGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCGG-3’；

TA-oligo-as：

5’P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’

EcoRI酶切pUC19质粒，与上述DNA双链连接形成前T载体；序列如SEQ IDNo.1所示；

1.2制备间隔DNA

引物：aspp2-xhoI-s：CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAG

      aspp2-xhoI-as：TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG

以本实验室构建的pcDNA4-ASPP2模板扩增，pcDNA4-ASPP2模板序列如SEQ ID No.11所示，扩增片段中不含常用的限制性酶切位点，扩增序列如SEQ IDNo.2所示；

1.3XhoI酶切步骤1.2制备的间隔DNA后，插入到前T载体中；

1.4设计突变引物AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT，AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pUC19-TA前T载体，序列如SEQ ID No.3所示。

1.5AhdI酶切pUC19-TA前T载体，回收大片段，即为pUC19-TA载体，第89碱基处为开放性T末端，序列如SEQ ID No.4所示。

2、把pUC19-TA载体的TA序列克隆入pcDNA4 His载体中得到pcDNA5-TA克隆载体；

所述步骤具体为：

2.1以pUC19-TA前T载体为模板，扩增片段如SEQ ID No.5所示，引物为：

TA-HindIII-S：GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTC

TA-XbaI-AS：GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC

2.2HindIII和XbaI双酶切SEQ ID No.5，定向连接到pcDNA4 His vector上，用引物

AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT，

AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT

把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5-TA前T载体，如SEQ ID No.6所示；

2.3AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T载体，回收大片段即为pcDNA5-TA载体，第946碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No.7所示。

3、把pcDNA5-TA克隆载体上的CMV-TA-poly A序列经PCR得到后克隆到pSEAP2-control载体中构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶(AP)的TA载体pcDNA5AP-TA。

3.1以pcDNA5-TA前T载体为模板，扩增片段，如SEQ ID No.8所示，引物为：

CMV-NotI：GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTT

polyA-NotI：AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT

3.2NotI酶切后，插入到pSEAP2-control载体上，测序验证反向插入的为正确克降，引物为

AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT

AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT

3.3把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5AP-TA前T载体，如SEQ ID No.9所示；

3.4AhdI酶切回收大片段，即为pcDNA5AP-TA载体，第5245碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No.10所示。

本发明可广泛用于基因功能的研究，使研究易于操作，结果更可靠，同时可潜在用于药物作用基因筛查的功能。

本发明的优点及有益效果：

(1)本发明提供的是一个分泌型碱性磷酸酶示踪载体，可利用培养基上清进行检测；

(2)可利用化学发光仪器进行检测，不仅灵敏度高而且可以根据标准碱性磷酸酶的对照进行定量；

(3)发明人把目的基因插入位点改造成TA克隆载体位点，因此可以把PCR产物直接插入到报告基因载体，既节省了时间又节省了科研成本。

附图说明

图1为将两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸退火形成的双链DNA酶切示意图；

图2为puc19-TA载体结构图；

图3为pcDNA5-TA载体结构图；

图4为pcDNA5AP-TA载体结构图；

图5为EGFP绿色荧光水平与SEAP-表达水平。

具体实施方式

实施例1pcDNA5AP-TA质粒的构建

pcDNA5AP-TA载体的构建步骤主要产生一个3’末端突出“T”的线性载体。传统的方法是在平末端的双链DNA 3’-末端通过DNA末端转移酶加入“T”。为了降低成本和便于操作，我们利用AhdI切割GACNNN/NNGTC的特点，引入正向重复序列，通过AhdI切割产生3’末端突出“T”的线性载体。但是由于在载体的氨苄抗性筛选基因的下游存在一个AhdI切点，我们首先通过DNA点突变的方法在不改变氨基酸编码的情况下突变掉AhdI切割位点。

具体步骤如下：

1、原核TA克隆载体：把TA位点引入pUC19载体构建成pUC19-TA载体；

1.1首先合成两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸，退火形成双链DNA；

TA-oligo-s：5’-P-AATTCACTAGTGGACATT/ATGTCTCGAGACATA/ATGTCGG-3’

TA-oligo-as：5’P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’

EcoRI酶切pUC19质粒，与上述DNA双链连接形成前T载体；序列如SEQ IDNo.1所示；如图1所示。

1.2制备间隔DNA

引物：aspp2-xhoI-s：CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAG

      aspp2-xhoI-as：TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG

以本实验室构建的pcDNA4-ASPP2(SEQ ID No.11所示)为模板扩增，扩增片段中不含常用的限制性酶切位点(BamH1，EcoRI，HindIII，NotI，XhoI，XbaI，ApaI等)，扩增序列如SEQ ID No.2所示；反应条件：94℃15秒，55℃30秒，72℃30秒扩增30个循环。

1.3XhoI酶切步骤1.2制备的间隔DNA后，插入到前T载体的XhoI位点，该位点位于两个AhdI切点的中间(CTCGAG)；

1.4设计突变引物AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT，AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pUC19-TA前T载体，序列如SEQ ID No.3所示。

1.5AhdI酶切pUC19-TA前T载体，回收大片段，即为pUC19-TA载体，第89碱基处为开放性T末端，序列如SEQ ID No.4所示。如图2所示。

2、把pUC19-TA载体的TA序列克隆入pcDNA4 His载体中得到pcDNA5-TA克隆载体；

2.1以pUC19-TA前T载体(SEQ ID No.3)为模板，扩增片段如SEQ ID No.5所示，引物为：

TA-HindIII-S：GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTC

TA-XbaI-AS：GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC

2.2HindIII和XbaI双酶切SEQ ID No.5，定向连接到pcDNA4 His vector上，用引物

AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT

AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT

把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5-TA前T载体，如SEQ ID No.6所示；

2.3AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T载体(SEQ ID No.6)，回收大片段即为pcDNA5-TA载体，第946碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No.7所示，结构如图3所示。

3、把pcDNA5-TA前T载体(SEQ ID No.6)上的CMV-TA-poly A序列经PCR(94℃15秒，55℃30秒，72℃1分30秒扩增30个循环)得到后克隆到pSEAP载体中构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶(AP)的TA载体pcDNA5AP-TA，具体步骤：

3.1以pcDNA5-TA前T载体为模板，扩增片段，如SEQ ID No.8所示，引物为：

CMV-NotI：GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTT

polyA-NotI：AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT

3.2NotI酶切后，插入到pSEAP2-control载体上，测序验证反向插入的为正确克隆，引物为

AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT

AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT

3.3把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5AP-TA前T载体，如SEQ ID No.9所示；

3.4AhdI酶切回收大片段，即为pcDNA5AP-TA载体，第5245碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No.10所示，结构如图4所示。

实施例2载体应用验证

1、所用引物：EGFP-s：TAGTGGAAGCTTGACCATGGTGAGCAAGGGCGAG，

          EGFP-as：GCTTGGGATCCAATTCTTACTTGTACAGCTCG

2、方法：应用rTaq酶，以pCMS-EGFP载体(clontech)为模板扩增EGFP编码片段。应用实施例1构建的pcDNA5AP-TA载体实现TA克隆连接，测序验证方向。转染293T细胞后，荧光倒置显微镜观察绿色荧光，可见光分析仪检测碱性磷酸酶分泌水平，发现两者水平呈正相关。

3、结果：如图5所示，图5为EGFP绿色荧光水平与SEAP-表达水平。从结果看出上清的SEAP化学发光水平与目的基因EGFP(细胞显绿色荧光)呈显著正相关。当DNA转染浓度为800ng时，60％的细胞有绿色荧光，同时SEAP的化学发光值较阴性对照升高了近24倍(5932288/250395)。

序列表

<110>首都医科大学附属北京佑安医院

<120>分泌型碱性磷酸酶示踪的TA克隆真核表达载体及其构建方法

<130>

<160>11

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>3055

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat    60

atcactagtg aattcactag tggacattat gtctcgagac ataatgtcgg aattcgcggc    120

cgcctgcagg tcgaccatat gggagagctc ccaacgcgtt ggatgcatag cttgagtatt    180

ctatagtgtc acctaaatag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat    240

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg    300

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag    360

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt    420

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg    480

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg    540

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag    600

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga    660

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct    720

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc    780

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg    840

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc    900

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca    960

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag    1020

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct    1080

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc    1140

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga    1200

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca    1260

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat    1320

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac    1380

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt    1440

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt    1500

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag    1560

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct    1620

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt    1680

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc    1740

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt    1800

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg    1860

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg    1920

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct    1980

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc    2040

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt    2100

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt    2160

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg    2220

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat    2280

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg    2340

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag    2400

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ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat    2700

cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg    2760

agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc    2820

acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtccatt    2880

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac    2940

gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt    3000

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta atacgactca ctata         3055

<210>2

<211>469

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccatcctcga gcccatcata cccatccaag tcagcttctg tgactgccag ctcagaaagc    60

ccagtagaaa tccagaatcc atatttacat gtggagcccg aaaaggaggt ggtctctctg    120

gttcctgaat cattgtcccc agaggatgtg gggaatgcca gtacagagaa cagtgacatg    180

ccagctcctt ctccaggcct tgattatgag cctgagggag tcccagacaa cagcccaaat    240

ctccagaata acccagaaga accaaatcca gaggctccac atgtgctaga tgtgtacctg    300

gaggagtacc ctccataccc acccccacca tacccatctg gggagcctga agggcccgga    360

gaagactcgg tgagcatgcg cccgcctgaa atcaccgggc aggtctctct gcctcctggt    420

aaaaggacaa acttgcgtaa aactggctca gagcgtatcg ctcgaggaa                469

<210>3

<211>3510

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat    60

atcactagtg aattcactag tggacattat gtctcgagcc catcataccc atccaagtca    120

gcttctgtga ctgccagctc agaaagccca gtagaaatcc agaatccata tttacatgtg    180

gagcccgaaa aggaggtggt ctctctggtt cctgaatcat tgtccccaga ggatgtgggg    240

aatgccagta cagagaacag tgacatgcca gctccttctc caggccttga ttatgagcct    300

gagggagtcc cagacaacag cccaaatctc cagaataacc cagaagaacc aaatccagag    360

gctccacatg tgctagatgt gtacctggag gagtaccctc catacccacc cccaccatac    420

ccatctgggg agcctgaagg gcccggagaa gactcggtga gcatgcgccc gcctgaaatc    480

accgggcagg tctctctgcc tcctggtaaa aggacaaact tgcgtaaaac tggctcagag    540

cgtatcgctc gagacataat gtcggaattc gcggccgcct gcaggtcgac catatgggag    600

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cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca    720

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca    780

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc    840

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt    900

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact    960

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aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta    1860

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtg gtgtagataa    1920

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac    1980

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa    2040

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag    2100

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg    2160

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag    2220

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg    2280

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc    2340

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat    2400

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata    2460

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa    2520

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca    2580

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc    2640

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc    2700

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg    2760

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac    2820

ctgatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggaaattg    2880

taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta    2940

accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt    3000

tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca    3060

aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa    3120

gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat    3180

ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag    3240

gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg    3300

ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg    3360

ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc    3420

tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac    3480

ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata                                     3510

<210>4

<211>3041

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat    60

atcactagtg aattcactag tggacattaa tgtcggaatt cgcggccgcc tgcaggtcga    120

ccatatggga gagctcccaa cgcgttggat gcatagcttg agtattctat agtgtcacct    180

aaatagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac    240

aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt    300

gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc    360

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg    420

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt    480

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa    540

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc    600

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag    660

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt    720

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg    780

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg    840

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg    900

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac    960

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg    1020

gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt    1080

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg    1140

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc    1200

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt    1260

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt    1320

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag    1380

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt    1440

ggtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc    1500

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc    1560

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg    1620

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac    1680

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg    1740

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc    1800

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact    1860

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc    1920

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat    1980

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc    2040

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac    2100

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa    2160

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact    2220

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg    2280

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg    2340

aaaagtgcca cctgatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca    2400

tcaggaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag    2460

ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac    2520

cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga    2580

ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc    2640

accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg    2700

gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa    2760

gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac    2820

caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tccattcgcc attcaggctg    2880

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa    2940

gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt    3000

tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat a                        3041

<210>5

<211>547

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gccgcgggaa gcttatatca ctagtgaatt cactagtgga cattatgtct cgagcccatc    60

atacccatcc aagtcagctt ctgtgactgc cagctcagaa agcccagtag aaatccagaa    120

tccatattta catgtggagc ccgaaaagga ggtggtctct ctggttcctg aatcattgtc    180

cccagaggat gtggggaatg ccagtacaga gaacagtgac atgccagctc cttctccagg    240

ccttgattat gagcctgagg gagtcccaga caacagccca aatctccaga ataacccaga    300

agaaccaaat ccagaggctc cacatgtgct agatgtgtac ctggaggagt accctccata    360

cccaccccca ccatacccat ctggggagcc tgaagggccc ggagaagact cggtgagcat    420

gcgcccgcct gaaatcaccg ggcaggtctc tctgcctcct ggtaaaagga caaacttgcg    480

taaaactggc tcagagcgta tcgctcgaga cataatgtcg gaattcgcgg ccgtctagag    540

gtcgacc                                                              547

<210>6

<211>5459

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg    60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt    240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt    540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg    780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc    900

gtttaaactt aagcttatat cactagtgaa ttcactagtg gacattatgt ctcgagccca    960

tcatacccat ccaagtcagc ttctgtgact gccagctcag aaagcccagt agaaatccag    1020

aatccatatt tacatgtgga gcccgaaaag gaggtggtct ctctggttcc tgaatcattg    1080

tccccagagg atgtggggaa tgccagtaca gagaacagtg acatgccagc tccttctcca    1140

ggccttgatt atgagcctga gggagtccca gacaacagcc caaatctcca gaataaccca    1200

gaagaaccaa atccagaggc tccacatgtg ctagatgtgt acctggagga gtaccctcca    1260

tacccacccc caccataccc atctggggag cctgaagggc ccggagaaga ctcggtgagc    1320

atgcgcccgc ctgaaatcac cgggcaggtc tctctgcctc ctggtaaaag gacaaacttg    1380

cgtaaaactg gctcagagcg tatcgctcga gacataatgt cggaattcgc ggccgtctag    1440

agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt    1500

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc    1560

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg    1620

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga    1680

tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc    1740

ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac    1800

cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc    1860

cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt    1920

tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg    1980

gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag    2040

tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt    2100

ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt    2160

taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc    2220

ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag    2280

tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc    2340

atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct    2400

ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct    2460

gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc    2520

ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcagcacg tgttgacaat taatcatcgg    2580

catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg gccaagttga    2640

ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg agcggtcgag ttctggaccg    2700

accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt cgccggtgtg gtccgggacg    2760

acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt gccggacaac accctggcct    2820

gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg gtcggaggtc gtgtccacga    2880

acttccggga cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg cgagcagccg tgggggcggg    2940

agttcgccct gcgcgacccg gccggcaact gcgtgcactt cgtggccgag gagcaggact    3000

gacacgtgct acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa    3060

tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct    3120

tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca    3180

caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca    3240

tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat    3300

ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag    3360

ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg    3420

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa    3480

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca    3540

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg    3600

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc    3660

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc    3720

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac    3780

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc    3840

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata    3900

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc    3960

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca    4020

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag    4080

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta    4140

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gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc    4260

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt    4320

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa    4380

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat    4440

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ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg    4680

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt    4740

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct    4800

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat    4860

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta    4920

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ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt    5220

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg    5280

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat    5340

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt    5400

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc    5459

<210>7

<211>4990

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg    60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt    240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt    540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg    780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc    900

gtttaaactt aagcttatat cactagtgaa ttcactagtg gacattaatg tcggaattcg    960

cggccgtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc    1020

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc    1080

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct    1140

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tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta    1440

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ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat    1620

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt    1680

taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt    1740

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca    1800

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt    1860

agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt    1920

ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg    1980

cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt    2040

gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa    2100

ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat    2160

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attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat    3960

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc    4020

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat    4080

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<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

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<213>人工序列

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cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta    4800

acaaaatatt aacgtttaca atttcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag    4860

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<210>11

<211>8425

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

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gagaccatct ctgtcccatc atacccatcc aagtcagctt ctgtgactgc cagctcagaa    3360

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aatctccaga ataacccaga agaaccaaat ccagaggctc cacatgtgct tgatgtgtac    3600

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Claims (6)

1.一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其特征在于，所述载体是在真核表达启动子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆位点，所述载体的碱基序列如SEQ ID No.10所示。

2.一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其特征在于，所述载体是在真核表达启动子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆位点，所述载体结构如图4所示。

3.根据权利要求1所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)原核TA克隆载体：把TA位点引入pUC19载体构建成pUC19-TA载体；

(2)把pUC19-TA载体的TA序列克隆入pcDNA4His载体中得到pcDNA5-TA克隆载体；

(3)把pcDNA5-TA克隆载体上的CMV-TA-polyA序列经PCR得到后克隆到pSEAP载体中构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶(AP)的TA载体pcDNA5AP-TA。

4.根据权利要求4所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)为：

1)首先合成两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸，退火形成双链DNA；

TA-oligo-s：

5’P-AATTCACTAGTGGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCGG-3’；

TA-oligo-as：

5’P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’

EcoRI酶切pUC19质粒，与上述DNA双链连接形成前T载体；序列如SEQ

ID No.1所示；

2)制备间隔DNA

引物：aspp2-xhoI-s：CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAG

aspp2-xhoI-as：TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG

以pcDNA-ASPP2质粒为模板扩增，如SEQ ID No.11所示，扩增片段中不含常用的限制性酶切位点，扩增序列如SEQ ID No.2所示；

3)XhoI酶切步骤2)制备的间隔DNA后，插入到前T载体中；

4)设计突变引物AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT，AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pUC19-TA前T载体，序列如SEQ ID No.3所示；

5)AhdI酶切pUC19-TA前T载体，回收大片段，即为pUC19-TA载体，第89碱基处为开放性T末端，序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求4所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)为：

1)以pUC19-TA前T载体为模板，扩增片段如SEQ ID No.5所示，引物为：TA-HindIII-S：GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTC

TA-XbaI-AS：GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC

2)HindIII和XbaI双酶切SEQ ID No.5，定向连接到pcDNA4His vector上，用引物

AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT

AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT

把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5-TA前T载体，如SEQ ID No.6所示；

3)AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T载体，回收大片段即为pcDNA5-TA载体，第946碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No.7所示。

6.根据权利要求4所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)为：

1)以pcDNA5-TA前T载体为模板，扩增片段，如SEQ ID No.8所示，引物为：

CMV-NotI：GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTT

polyA-NotI：AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT

2)NotI酶切后，插入到pSEAP2-control载体上，测序验证反向插入的为正确克隆，引物为

AhdI-mut-s：TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT

AhdI-mut-as：TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT

3)把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5AP-TA前T载体，如SEQ ID No.9所示；4)AhdI酶切回收大片段，即为pcDNA5AP-TA载体，第5245碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No.10所示。

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