CN114181957B - 一种基于病毒加帽酶的稳定t7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法 - Google Patents

一种基于病毒加帽酶的稳定t7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法。所述稳定T7表达系统包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。所述方法包括将T7 RNA聚合酶整合到宿主基因组，将T7启动子启动的转录单元构建到载体或基因组，利用病毒加帽酶为T7 RNA聚合酶合成的mRNA加5′Cap结构，帮助T7 RNA聚合酶转录的mRNA运输到细胞质，并在细胞质与核糖体结合，完成翻译和高水平表达目标蛋白质。本发明的基于病毒加帽酶的T7表达系统不随宿主细胞的分裂而丢失，在真核生物中高效稳定地表达外源蛋白。

Description

一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其在真核生物中表 达蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统，所述稳定T7表达系统包含T7RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，该系统可用于在真核细胞中持续、稳定、高效地表达蛋白。
背景技术
T7系统是来自于大肠杆菌T7噬菌体的转录系统，该系统由T7 RNA聚合酶和其特异性识别的由T7启动子诱导转录的转录单元构成。目前，尽管在锥虫类原生动物中构建了稳定表达的T7系统，但是其基于RNA加工的反式剪切机制，在非锥虫类原生动物中不是常见的RNA加工机制。所以，在真核生物，特别是酵母菌、哺乳动物细胞等中，T7系统仍存在无法持续、稳定、高效地表达蛋白的问题。其中，在酵母菌株中只检测到T7 RNAP(即，T7 RNA聚合酶)的表达，没有检测到T7启动子控制的目的蛋白的合成。而对于人细胞、小鼠细胞、非洲爪蟾卵母细胞、植物细胞构建的T7蛋白表达系统，其只能实现瞬时蛋白表达，或者局限在植物质体细胞器中表达蛋白，无法在基因组DNA指导下基于细胞质蛋白合成系统，稳定表达蛋白(参见，非专利文献1-4)。
真核生物细胞核内转录获得的mRNA，需经过5′端添加Cap结构、3′端添加poly(A)尾巴、去除内含子等加工程序，才能跨越核膜转运至细胞质，翻译合成蛋白质。但是，原核生物来源的T7 RNAP产生的mRNA没有5′Cap结构和3′poly(A)尾巴结构，造成T7 RNAP转录产物不能有效运出细胞核和翻译，因此T7系统无法在真核细胞中高效表达蛋白质。
有研究利用IRES结构帮助无5′Cap结构的mRNA在细胞质中翻译合成蛋白质，也有在T7启动子启动的转录单元中添加真核多聚腺苷酸化序列帮助T7 RNAP转录产物产生3′poly(A)尾巴(参见，非专利文献5-6)，但是，这些研究均未解决如何给无5′Cap结构的mRNA添加5′Cap结构，进而将其高效地从细胞核运输到细胞质的问题。
还有研究尝试通过将T7 RNAP与真核生物加帽酶系统融合表达，给T7 RNAP转录产物添加5′Cap结构，但未获成功(参见，非专利文献7和8)。
现有技术文献：
非专利文献1：Elroy-Stein O,Fuerst T R,Moss B.Cap-independenttranslation of mRNA conferred by encephalomyocarditis virus 5'sequenceimproves the performance of the vaccinia virus/bacteriophage T7 hybridexpression system.Proceedings of the National Academy of Sciences,1989,86(16):6126-30.
非专利文献2：Benton B M,Eng W-K,Dunn J J,et al.Signal-mediated importof bacteriophage T7 RNA polymerase into the Saccharomyces cerevisiae nucleusand specific transcription of target genes.Molecular and Cellular Biology,1990,10(1):353-60.
非专利文献3：Tokmakov A A,Matsumoto E,Shirouzu M,Yokoyama S.Coupledcytoplasmic transcription-and-translation—a method of choice forheterologous gene expression in Xenopus oocytes.Journal of Biotechnology,2006,122(1),5-15.
非专利文献4：McBride K E,Schaaf D J,Daley M and Stalker D M,Controlledexpression of plastid transgenes in plants based on a nuclear DNA-encoded andplastid-targeted T7 RNA polymerase.Proceedings of the National Academy ofSciences,1994,91,7301-7305.
非专利文献5：Elroy-Stein O,Moss B.Cytoplasmic expression system basedon constitutive synthesis of bacteriophage T7 RNA polymerase in mammaliancells.Proceedings of the National Academy of Sciences,1990,87(17):6743-6747.
非专利文献6：Dower K.,Rosbash M.T7 RNA polymerase-directed transcriptsare processed in yeast and link 3′end formation to mRNA nuclear export.RNA,2002,8:686-697.
非专利文献7：Natalizio B J,Robson-Dixon N D.and Garcia-Blanco M A.Thecarboxyl-terminal domain of RNA polymerase II is not sufficient to enhancethe efficiency of pre-mrna capping or splicing in the context of a differentpolymerase.Journal of Biological Chemistry,2009,284,8692-8702.
非专利文献8：Decroly E,Ferron F,Lescar J,Canard B.Conventional andunconventional mechanisms for capping viral mRNA.Nature Reviews Microbiology,2012,10(1),51-65.
发明内容
发明要解决的问题
本发明主要解决如何构建在真核生物中表达蛋白质的稳定T7表达系统的问题。具体而言，如何将带有核定位序列的T7 RNAP整合到宿主基因组上，同时引入病毒加帽酶，为T7 RNAP转录的mRNA添加5′Cap结构，使其高效运出细胞核，达到在真核生物中构建稳定、高效地表达重组蛋白的T7表达系统的目的。
用于解决问题的方案
为解决上述问题，本发明提供了具有如下特征的稳定T7表达系统以及使用该系统在真核生物中表达蛋白质的方法。
[1]、一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统，其特征在于，所述稳定T7表达系统包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。
[2]、根据[1]所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶带有核定位序列，任选地带有或不带有内含肽。
[3]、根据[2]所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因用于构建整合型载体，并转化真核菌株或真核细胞，构建基因组上携带有T7RNA聚合酶基因的宿主细胞或宿主菌株。
[4]、根据[1]所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述病毒加帽酶用于构建具有核定位序列的加帽酶基因的载体，并且将包含目标基因片段的所述T7转录单元插入所述载体，得到含有所述病毒加帽酶基因和目标基因的载体，所述病毒加帽酶任选地带有或不带有内含肽。
[5]、根据[1]～[4]中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶为融合型或游离型。
[6]、根据[1]所述的稳定T7表达系统，其特征在于，将[4]中的含有所述病毒加帽酶基因和目标基因的载体转化到[3]中的所述真核菌株或真核细胞中，由此构建所述稳定T7表达系统。
[7]、根据[1]～[6]中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶转录的终止子。
[8]、根据[1]～[7]中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述病毒加帽酶选自由呼吸道合胞病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、口炎疱疹病毒加帽酶和乳酸克鲁维酵母线性质粒加帽酶组成的组中的至少一种。
[9]、根据[1]～[8]中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述核定位序列选自由SV40T-Antigen核定位序列、Nucleoplasmin核定位序列、EGL-13核定位序列、c-Myc核定位序列和TUS-protein核定位序列组成的组中的至少一种。
[10]、一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶的稳定T7表达系统，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。
[11]、根据[10]所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)合成带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因序列，并将其构建到整合型载体中，所述T7 RNA聚合酶任选地带有或不带有内含肽，以构建融合型或游离型的T7 RNA聚合酶和病毒加帽酶；
2)将所述整合型载体直接转化或线性化后转化真核菌株或真核细胞株，得到基因组上整合了带有所述核定位序列的T7 RNA聚合酶基因的真核菌株或真核细胞株；
3)构建带有核定位序列的病毒加帽酶基因的载体，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含有所述T7转录单元的目标蛋白DNA片段，回收所述在T7转录单元中包含目标基因的片段，将其插入带有所述核定位序列的病毒加帽酶基因的载体中，得到含有所述病毒加帽酶基因和目标基因的载体；
4)将3)中得到的所述载体转化到2)中的所述整合后的真核菌株或真核细胞株中，构建基于所述病毒加帽酶的稳定T7表达系统；和
5)使用所述稳定T7表达系统，用报告基因在所述重组的真核菌株或细胞株中表达目标蛋白。
[12]、根据[10]或[11]所述的方法，其特征在于，使用编码Nanoluc萤光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为报告基因验证所述表达系统表达的目标蛋白。
[13]、根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其特征在于，所述真核生物为酵母菌、丝状真菌、哺乳动物或昆虫。
发明的效果
本发明通过构建基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统，将T7 RNAP整合到宿主基因组，利用病毒加帽酶为T7 RNAP转录产物添加5′Cap，实现基于稳定T7表达系统的重组蛋白在真核细胞内的稳定、高效的表达。
附图说明
图1为pS-T7RNAP质粒的示意图。
图2为pS-T7RNAP整合酵母基因组验证的电泳图。其中，泳道1是对照菌BY4741基因组的PCR结果；泳道2是BY4741(HO::NLS-T7RNAP)基因组的PCR结果。
图3为pS-IntC-T7RNAP质粒的示意图。
图4为pS-IntC-T7RNAP整合酵母基因组验证的电泳图。其中，泳道1是是BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS)基因组的PCR结果。
图5为pS-NP-IntN-Nano质粒的示意图。
图6为pS-RL-IntN-Nano质粒的示意图。
图7为游离型和融合型病毒加帽酶的稳定T7表达系统的萤光素酶表达效果图。
图8为pS-NP-IntN-EGFP质粒的示意图。
图9为基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在酿酒酵母中表达Nanoluc萤光素酶的稳定性效果图。
图10为pSneo-NP-Nano质粒的示意图。
图11为pShyg-T7RNAP1质粒的示意图。
图12为基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在CHO-K1细胞中表达Nanoluc萤光素酶的效果图。
图13基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在CHO-K1细胞中表达Nanoluc萤光素酶的稳定性效果图。
具体实施方式
以下对本发明的基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其对于蛋白的稳定表达进行详细介绍。
<基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统>
在本发明中，术语“稳定T7表达系统”是指不会随着细胞的分裂而丢失的T7表达系统。优选地，具有该稳定T7表达系统的真核菌株或者真核细胞株至少连续转接5次后仍存在，并且能稳定地表达目标蛋白。更优选地，该稳定T7表达系统转接5次后，以Nanoluc萤光素酶的平均发光强度表示的目标蛋白表达量降低0.1～50％。最优选地，该稳定T7表达系统转接5次后，以Nanoluc萤光素酶的平均发光强度表示的目标蛋白表达量仅降低0.5～30％。
与其相对，术语“瞬时T7表达系统”是指随着细胞分裂而快速丢失的T7表达系统，无法实现继代培养中稳定地表达目标蛋白。更为具体地，具有该瞬时T7表达系统的真核菌株或者真核细胞株在1～5次转接中消失，或者以Nanoluc萤光素酶的平均发光强度表示的目标蛋白表达量降低80～100％。
本发明的基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统，包含T7 RNA聚合酶、病毒加帽酶和T7转录单元。所述T7转录单元包含T7启动子、T7终止子和目标基因。
所述T7 RNA聚合酶带有核定位序列，任选地带有或不带有内含肽。
所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因用于构建整合型载体，并转化真核菌株或真核细胞株，构建基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主，且经所述宿主系统转录、翻译，合成所需的蛋白。
在本发明中，术语“整合型载体”是指能够整合到宿主基因组上的质粒载体。
本发明中使用的核定位序列不受限制，可根据需要选择适合于T7 RNA聚合酶基因和病毒加帽酶基因的核定位序列。优选地，可使用SV40 T-Antigen核定位序列、Nucleoplasmin核定位序列、EGL-13核定位序列、c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列。
本发明的病毒加帽酶用于构建具有核定位序列的加帽酶基因的载体，并且将包含目标基因片段的T7转录单元插入所述载体，得到含有所述含病毒加帽酶基因和目标基因的载体，所述病毒加帽酶任选地带有或不带有内含肽。
所述内含肽通过介导蛋白自组装，可以将彼此分离的游离型加帽酶和T7 RNAP组装成融合型加帽酶和T7 RNAP，以期提高加帽酶和T7 RNAP之间的物质传递效率，达到提高蛋白质表达效率的目的。Sce VMA、Ssp DnaE、Npu DnaE等内含肽均适用于T7 RNA聚合酶，其中Npu DnaE内含肽的催化效率最高。
优选地，本发明使用Npu DnaE内含肽。
在本发明中，术语“游离型”是指加帽酶和T7 RNAP没有形成融合蛋白，而是彼此独立的两种蛋白。
在本发明中，术语“融合型”是指加帽酶和T7 RNAP通过内含肽形成融合蛋白。
在本发明中，所述病毒加帽酶不受限制，只要其有助于构建稳定T7表达系统以稳定表达真核生物中蛋白质。优选地，可使用呼吸道合胞病毒(Respiratory SyncytialVirus)加帽酶(RSVL)[Genebank No.:ACO83300.1]、非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus)加帽酶(NP868R)[Genebank No.:22220330]、口炎疱疹病毒(Vesicular StomatitisVirus)加帽酶(VSVL)[Genebank No.:M29788.1]、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)线性质粒加帽酶(ORF3)[Genebank No.:CAA30604.1]等。
本发明选取真核生物的启动子作为表达T7 RNA聚合酶和病毒加帽酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达T7 RNA聚合酶和病毒加帽酶转录终止子。
本发明的真核生物范围较广，原则上用于构建T7转录系统的真核生物均适用于本发明。现有的T7表达系统由于T7 mRNA缺乏真核mRNA相应的结构，因此限制了其在真核生物中的应用。本发明通过病毒加帽酶的加帽功能，为T7 RNAP转录产物添加5′Cap结构，由此构建适合于真核生物的蛋白质表达的稳定T7表达系统。
本发明的真核生物可以为酵母菌、丝状真菌、哺乳动物或昆虫等。优选地，可使用酿酒酵母菌株作为真核菌株。优选地，可使用CHO-K1细胞作为哺乳动物细胞。
<使用基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法>
需要说明的是，本发明中涉及的常规的质粒和载体的构建、蛋白的表达方法以及细胞转化等方法，可参照本领域公知的分子生物学及遗传学方法，例如，可参照“本领域的常规生物学方法”、“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in MolecularBiology，Wiley出版)”、“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
本发明的基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法主要包括以下步骤：
1)合成带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因序列，并将其构建到整合型载体中。
所述T7 RNA聚合酶任选地可带有或不带有内含肽，以构建融合型或游离型的T7RNA聚合酶和加帽酶。通过构建游离型和融合型两种系统，可比较这两种稳定T7表达系统表达目标蛋白的效率。
2)将整合型载体直接转化或线性化后转化真核菌株或真核细胞株，得到基因组上整合了带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因的真核重组菌株或细胞株。
本发明在酿酒酵母和CHO-K1细胞中初步建立了基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统。
3)构建具有核定位序列的病毒加帽酶基因的载体，以含有目标蛋白基因的质粒为模板扩增包含有T7转录单元的目标蛋白DNA片段，回收在T7转录单元中包含目标蛋白的片段，将其插入具有核定位序列的病毒加帽酶基因的载体中，得到含有所述病毒加帽酶基因和目标蛋白基因的载体。
本发明通过在宿主细胞中引入病毒加帽酶，将其加帽功能和T7系统的转录功能耦合，构建稳定T7表达系统。
4)将3)中得到的载体转化到2)中的真核重组菌株或细胞株中，构建基于病毒加帽酶的T7表达系统；和
5)使用所述T7表达系统，用报告基因在所述真核重组菌株或细胞株中表达目标蛋白。
本领域常用的报告基因均可用于本发明。优选地，使用Nanoluc萤光素酶或绿色荧光蛋白作为报告基因，验证T7表达系统表达的目标蛋白。
本发明的质粒和载体的构建以及蛋白的表达也可参考CN111534533A中的相关记载。
<基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统的蛋白表达稳定性的检测>
在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母使用所述稳定T7表达系统，并对目标重组蛋白进行表达和检测。
在本发明的另一种实施方式中，对哺乳动物细胞使用所述T7表达系统，并对目标重组蛋白进行稳定表达和检测。
本发明通过报告基因在重组真核菌株或者真核细胞中的继代培养表达来检测基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统表达重组蛋白的稳定性，报告基因可使用NanoLucTM萤光素酶(Nluc)、绿色荧光蛋白(EGFP)等。通过生物发光强度的对比来表征作为目标蛋白的报告基因的表达，通过连续转接具有基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统的目标菌株或细胞株，测定其目标蛋白表达的稳定性，表征目标真核菌株或真核细胞中T7系统的稳定性。
<实验材料>
载体：pMRI 31(GenBank:KJ502281.1)；pESC-URA(GenBank:AF063585.2)；pcDNA3.1和pcDNA 3.1/Hygro，购自Invitrogen公司。
菌株：酿酒酵母菌株BY4741，购自Invitrogen公司。
细胞株：CHO-K1，购自ThermoFisher公司。
培养基：YPD培养基和SD-URA培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；HycloneCDM4PERMAb培养基，购自ThermoFisher公司。
试剂：10×PBS缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；Nano-GloTM萤光素酶活性测定试剂盒，购自Promega公司；SfiⅠ核酸内切酶，购自New England Biolabs(NEB)公司；无缝克隆试剂盒(Infusion)，购自中美泰和生物技术(北京)有限公司；山梨醇，半乳糖，卡纳霉素，遗传霉素，潮霉素B，新霉素，均购自北京索莱宝科技有限公司。
以下结合实施例进一步解释本发明，需要说明的是，以下实施例仅用于描述本发明，本发明不限于此。
<实施例1>基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在酿酒酵母中的构建和表达
1.带有核定位序列的T7 RNAP的整合型质粒载体的构建
基于pMRI 31质粒载体，构建带有核定位序列的T7 RNAP的整合型质粒载体pS-T7RNAP；pS-T7RNAP的完整DNA序列如SEQ ID No：1所示，其结构如图1所示，按以下顺序其主要包括：
(1)酿酒酵母HO基因的5′基因组侧翼区；
(2)pBR322质粒复制起始位点(pBR322 ori)；
(3)卡纳霉素/遗传霉素抗性标记基因(KanMX)，卡纳霉素用于大肠杆菌菌株，遗传霉素用于酿酒酵母菌株；
(4)细胞色素C1(CYC1)终止子(TCYC1)；
(5)T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)基因；
(6)来源于病毒SV40的核定位序列(NLS)，位于T7 RNAP的C末端；
(7)半乳糖1和10启动子(Pgal1,10)；
(8)酿酒酵母HO基因的5′基因组侧翼区。
还可参照CN111534533A中pS-T7 RNAP质粒构建部分的内容。
2.基因组插入带有核定位序列的T7 RNAP的酵母菌基因工程菌株的构建
将质粒pS-T7RNAP使用Sfi I核酸内切酶线性化。回收线性化质粒片段，将质粒电转入酿酒酵母菌株BY4741，通过遗传霉素G418抗性选择得到基因组整合了T7RNAP基因的酿酒酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP)。为确保其为阳性转化子，提取该酿酒酵母菌株和空白菌株的基因组，并使用特定引物HOF3和HOR3来验证T7 RNAP基因是否正确插入到酿酒酵母基因组的HO区域上，验证结果如图2所示。
HOF3和HOR3的核苷酸序列如下：
HOF3:CGTGCCTGCGATGAGATAC(SEQ ID No：2)
HOR3:GGCGTATTTCTACTCCAGCA(SEQ ID No：3)
对照组扩增出2947bp的片段，表明没有插入片段，而实验组扩增出7672bp的片段，说明所述T7RNAP基因成功插入酿酒酵母BY4741染色体上。
还可参照CN111534533A中酿酒酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP)构建部分的内容。
3.具有内含肽和核定位序列的T7 RNAP的整合型质粒载体的构建
基于pS-T7RNAP质粒载体，构建具有内含肽和核定位序列的T7 RNAP的整合型质粒载体pS-IntC-T7RNAP。pS-IntC-T7RNAP的完整DNA序列如SEQ ID No：4所示，其结构如图3所示，按以下顺序主要包括：
(1)酿酒酵母HO基因的5′基因组侧翼区；
(2)pBR322质粒复制起始位点(pBR322 ori)；
(3)卡纳霉素/遗传霉素抗性标记基因(KanMX)，卡纳霉素用于大肠杆菌菌株，遗传霉素用于酿酒酵母菌株；
(4)细胞色素C1(CYC1)终止子(TCYC1)；
(5)来源于病毒SV40的核定位序列(NLS)，位于T7 RNAP的C末端；
(6)T7 RNA聚合酶基因(T7 RNAP)；
(7)内含肽IntC蛋白基因，位于T7 RNAP的N末端，用于与加帽酶C末端内含肽IntN相互作用，形成加帽酶-T7 RNAP融合蛋白。IntC蛋白基因序列如SEQ ID No：5所示，IntN蛋白基因序列如SEQ ID No：6所示；
(8)半乳糖1和10启动子，启动具有内含肽和核定位序列的T7 RNAP基因的转录；
(9)酿酒酵母HO基因的5′基因组侧翼区。
此外，在构建上述质粒的过程中使用如下Npu DnaE内含肽基因序列(GenBank:CP001037.1)。
4.基因组上整合了带有核定位序列和内含肽的T7 RNAP序列的酵母基因工程菌的构建
将质粒pS-IntC-T7RNAP使用Sfi I核酸内切酶线性化，回收线性化质粒片段，将质粒电转入酿酒酵母菌株BY4741，获得基因组上整合了带有核定位序列和内含肽的T7 RNAP序列的酵母基因工程菌BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS)。重组菌株的选择和验证步骤参照BY4741(HO::NLS-T7RNAP)，验证结果如图4所示。
5.含有病毒加帽酶和目标基因的质粒的构建
基于pESC-URA质粒，构建pS-NP-IntN-Nano质粒，pS-NP-IntN-Nano的完整DNA序列如SEQ ID NO：7所示，结构参见图5，该质粒按以下顺序主要包括：
(1)T7启动子启动的萤光素酶转录单元，包括T7启动子(PT7)、萤光素酶(Nanoluc)、细胞色素C1终止子(TCYC1)、T7终止子(TT7)，其中Nanoluc mRNA的5′端前碱基为acccc，是非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R的特异性识别序列，TCYC1终止子用于给NanolucmRNA添加poly(A)尾巴；
(2)Pgal启动子启动的转录单元，包括Pgal启动子、非洲猪瘟病毒加帽酶(NP868R)，酵母乙醇脱氢酶1终止子(TADH1)，其中NP868R蛋白N端为核定位序列NLS，C端为内含肽IntN，内含肽IntN与NP868R间为连接蛋白(G4S)2，(G4S)2为连续4个甘氨酸加1个丝氨酸，重复2次；
(3)NP868R中的内含肽IntN用于与T7 RNAP的N末端内含肽IntC相互作用，形成加帽酶-T7 RNAP融合蛋白。
基于pESC-URA质粒，构建pS-RL-IntN-Nano质粒。pS-RL-IntN-Nano的完整DNA序列如SEQ ID NO：8所示，其结构如图6所示，该质粒按以下顺序主要包括：
(1)T7启动子启动的萤光素酶转录单元，包括T7启动子(PT7)、萤光素酶(Nanoluc)、细胞色素C1终止子(TCYC1)、T7终止子(TT7)，其中Nanoluc mRNA的5′端前碱基为ggggcaaat，是呼吸道合胞病毒加帽酶RSVL的特异性识别序列，TCYC1终止子用来给Nanoluc mRNA添加poly(A)尾巴；
(2)Pgal启动子启动的转录单元，包括Pgal启动子、呼吸道合胞病毒加帽酶(RSVL)，酵母乙醇脱氢酶1终止子(TADH1)，其中RSVL蛋白N端为核定位序列NLS，C端为内含肽IntN，内含肽IntN与RSVL间有一个连接蛋白(G4S)2，(G4S)2为连续4个甘氨酸加1个丝氨酸，重复2次；
(3)RSVL中的内含肽IntN用于与T7 RNAP的N末端内含肽IntC相互作用，形成加帽酶-T7 RNAP融合蛋白，IntN蛋白基因序列如前所述。
6.基于病毒加帽酶的T7表达系统表达目标基因的酵母基因工程菌的构建
将前述目标质粒pS-NP-IntN-Nano、pS-RL-IntN-Nano分别转入酿酒酵母菌BY4741(HO::NLS-T7RNAP)、BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS)，得到酿酒酵母重组菌株BY4741(HO::T7RNAP-NLS,pS-NP-IntN-Nano)、BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS,pS-NP-IntN-Nano)、BY4741(HO::T7RNAP-NLS,pS-RL-IntN-Nano)、BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS,pS-RL-IntN-Nano)，具体操作参照以下酿酒酵母感受态的制备及转化步骤。
酿酒酵母感受态的制备过程如下：
(1)从平板上挑单一酵母菌落于5mL的YPD液体培养基中，30℃下培养12h。然后，吸取500μL培养液至50mL的YPD液体培养基中，继续30℃培养18-24h至OD600＝2左右。
(2)菌液转至灭菌的50ml离心管，5000rpm下离心5min后去上清，然后用30ml的预冷灭菌水重悬菌体，5000rpm下离心5min去上清。
(3)用20ml预冷灭菌的1M山梨醇重悬菌体，去上清，然后用200μl～500μl的1M山梨醇重悬细胞转移至1.5ml离心管，得到酿酒酵母感受态细胞。需要说明的是，每次酵母转化均需制备新鲜的感受态以保证高转化率。
酿酒酵母电转化步骤如下：
(1)取3～5μL的线性质粒(浓度≥300ng/μl)和40μL的酿酒酵母感受态细胞于预冷过的1.5mL离心管中混合均匀，转移至2mm的电转杯中，冰上预冷5min。
(2)用纸擦净电转杯上的水滴，采用电转仪在1500V的电击强度下电击。
(3)在电转杯中加入1mL的YPD培养基，轻轻悬浮转移至灭菌的1.5mL离心管中，30℃下静置复苏2h。待复苏后，用灭菌水清洗3遍，涂适量的细胞于相应的平板上，30℃下培养2～3天直至出现单菌落。
7.NanoLucTM萤光素酶(Nluc)报告基因在重组酿酒酵母菌株中的表达检测
本实验中使用前述制备的酵母菌株BY4741(HO::T7RNAP-NLS,pS-NP-IntN-Nano)、BY4741(IntC-T7RNAP-NLS,pS-NP-IntN-Nano)、BY4741(HO::T7RNAP-NLS,pS-RL-IntN-Nano)、BY4741(IntC-T7RNAP-NLS,pS-RL-IntN-Nano)。
将上述菌株分别进行如下操作：在SD-URA液体培养基中培养24h后，以1％的接种量转接到SG-URA液体培养基中培养至一定浓度后，离心收集菌体，用过滤除菌的PBS洗涤3次，重悬于无菌的PBS。
检测方法：将Nano-GloTM底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并与酵母细胞PBS重悬液以1:10混合，转移200μl样品至白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的Luminescence模式测定生物发光强度，此外，另将200μl样品转移至96孔透明板中测定OD600。然后，用生物发光强度除以OD600获得平均生物发光强度，以此来表达不同菌之间的差异。需要说明的是，样品在测定之前需稀释至合适的浓度(OD600＝0.3～0.8)。
上述菌株的基因型和简称分别如下表1所示。
表1
图7为游离型和融合型病毒加帽酶的稳定T7表达系统的萤光素酶表达效果图，各菌株的基因型如表1所示。从图7中可以看出，NP868R加帽酶组菌和RSVL加帽酶组菌的平均萤光强度显著高于对照菌株，说明加帽酶成功地为T7 RNAP转录的mRNA添加了5′Cap结构，促使T7 RNAP转录的mRNA运出细胞核并翻译合成蛋白质。NP868R加帽酶组菌(yf-NP868R和yF-NP868R)的平均萤光强度高于RSVL加帽酶组菌(yf-LRSV和yF-LRSV)，说明NP868R的加帽酶活性强于RSVL。在同组加帽酶内，RSVL和T7RNAP的融合型(yF-LRSV)平均萤光强度高于二者的游离型(yf-LRSV)，差异显著。NP868R和T7RNAP的融合型(yF-NP868R)平均萤光强度高于二者的游离型(yf-NP868R)，但二者间无明显差异。
8.绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因在重组酿酒酵母菌株中的表达检测
参照实施例1中1～6的步骤构建质粒和酿酒酵母重组菌株，得到酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP，pESC-URA)、BY4741(HO::NLS-T7RNAP，pS-NP-IntN-EGFP)，其中，pS-NP-IntN-EGFP的完整DNA序列如SEQ ID NO：9所示，pS-NP-IntN-EGFP的质粒结构参见图8。
对上述菌株分别进行如下操作：在SD-URA液体培养基中培养24h后，按1％的接种量转接到SG-URA液体培养基中培养至一定浓度后，离心收集菌体，用无菌水洗涤3次，重悬于无菌水，通过多功能酶标仪检测荧光基因的表达，结果如表2所示。
表2
表2中，control代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP，pESC-URA)菌株，yEGFP代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP，pS-NP-IntN-EGFP)菌株。
从表2可以看出基于NP868R加帽酶的游离型酿酒酵母T7系统的绿色荧光蛋白(EGFP)的表达效果。yEGFP菌株的荧光强度显著高于对照菌株，说明加帽酶NP868R提高了荧光蛋白(EGFP)的跨细胞核膜运输能力和在细胞质中的翻译能力，实现了重组蛋白的高效表达。
9.基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在酿酒酵母中表达Nanoluc萤光素酶的稳定性检测
挑取yf-NP868R、yF-NP868R、yf-LRSV和yF-LRSV菌株，接于5mL SD-URA培养基中，培养24h后将菌体浓度调整至OD600为1左右，以1:1000的比例接于5mL SG-URA培养基中培养，每过24h重新接种一次并检测萤光素酶的表达水平，持续5天，结果如图9所示。
由图9可以看出，基于病毒加帽酶的酿酒酵母T7系统在5次转接中Nanoluc萤光素酶的表达水平相对稳定。5次转接后，yf-NP868R的平均发光强度降低18.4％，yF-NP868R降低16.9％，yf-LRSV降低12.5％，yF-LRSV降低13.5％。说明该T7表达系统具有良好的表达目标蛋白的稳定性，克服了瞬时T7表达系统随细胞分裂而逐渐丧失表达能力的缺点。
<实施例2>基于病毒加帽酶的T7表达系统在CHO-K1细胞中的构建和表达
1.基于病毒加帽酶的T7表达系统的哺乳动物细胞转化载体的构建
利用pcDNA3.0质粒载体，利用无缝克隆技术构建基于病毒加帽酶的T7表达系统载体pSneo-NP-Nano。pSneo-NP-Nano的完整DNA序列如SEQ ID No：10所示，其结构如图10所示，按以下顺序主要包括：
(1)CMV启动子(PCMV)；
(2)SV40的核定位序列(NLS)；
(3)非洲猪瘟病毒加帽酶(NP868R)基因；
(4)连接蛋白(G4S)2，(G4S)2为连续4个甘氨酸加1个丝氨酸，重复2次；
(5)内含肽IntN；
(6)T7启动子(PT7)；
(7)萤光素酶基因(accccNanoluc)，其中Nanoluc的mRNA 5′端前的碱基为acccc，是非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R的特异性识别序列；
(8)牛生长激素多聚腺苷酸化位点(BGHpA)；
(9)T7终止子(TT7)；
(10)SV40启动子(SV40 promoter)；
(11)新霉素抗性标记基因(NeoR)；
(12)SV40多聚腺苷酸化位点(SV40 pA)。
利用pcDNA3.0质粒载体，利用无缝克隆技术构建基于病毒加帽酶的T7表达系统载体pShyg-T7RNAP1。首先将pcDNA3.0中的新霉素抗性标记基因(NeoR)替换为潮霉素抗性标记基因(HygB)，最终得到pShyg-T7RNAP1质粒载体。pShyg-T7RNAP1的完整DNA序列如SEQ IDNo：11所示，其结构如图11所示，该质粒按以下顺序主要包括：
(1)CMV启动子(PCMV)；
(2)内含肽IntC；
(3)T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)；
(4)SV40的核定位序列(NLS)；
(5)牛生长激素多聚腺苷酸化位点(BGHpA)；
(6)SV40启动子(SV40 promoter)；
(7)潮霉素抗性标记基因(HygB)；
(8)SV40多聚腺苷酸化位点(SV40 pA)。
2.pShyg-T7RNAP1和pSneo-NP-Nano共转染CHO-K1细胞
用以上构建的载体pShyg-T7RNAP1和pSneo-NP-Nano电转化CHO-K1细胞，分步添加潮霉素和新霉素，获得目标转化子，然后利用多功能酶标仪选择荧光强度高的细胞株，最终得到稳定高效表达萤光素酶的细胞株。宿主细胞的复苏、电转化和目标细胞株的获得，参见如下操作。
(1)CHO-K1细胞的复苏
在Hyclone CDM4PERMAb培养基中进行细胞传代培养，2～4天转接一次，接种密度为3×105/ml，在方瓶中，37℃、5％CO2下连续传代30次，以细胞密度和细胞存活率计算细胞倍增时间，获得电转化细胞。
(2)CHO-K1细胞的电转化
取驯化后的CHO-K1细胞200μl，约1.0×107个细胞，与15μg pShyg-T7RNAP1和15μgpSneo-NP-Nano质粒均匀混合，转入电转杯，250V/cm，20ms电击两次，电击间隔时间为5s。随后，将电击细胞转入30ml Hyclone CDM4PERMAb培养基，37℃、5％CO2下培养24h，选择目标细胞株。
(3)目标CHO-K1细胞的选择
将目标细胞稀释适当的倍数，按照每孔100μL铺96孔板，先后加入潮霉素和新霉素，37℃、5％CO2下进行目标细胞株的培养，随后进行目标细胞株表达Nanoluc萤光素酶的检测。
(4)Nluc报告基因在CHO-K1细胞中的表达检测和高Nanoluc萤光素酶活性细胞株的获得
以非转化的CHO-K1细胞株作为对照，将对照细胞和转化细胞用无菌PBS洗涤3次，并将细胞重悬于无菌PBS。
检测方法：将Nano-底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并按1:10的比例与细胞混合，转移200μl样品至白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的luciferase模式测定生物发光强度，结果如图12所示。
从图12可以看出，对照CHO-K1细胞株(以W表示)基本没有检测到生物发光信号。基于病毒加帽酶的T7表达系统的CHO-K1细胞株(以W-NP-T7RP表示)则检测出很强的发光信号，说明在CHO-K1细胞中，病毒加帽酶NP868R为T7RNAP转录的mRNA添加了5′Cap结构，促使T7RNAP转录的mRNA运出细胞核并翻译合成蛋白质。
图13显示了基于病毒加帽酶NP868R的稳定T7表达系统的CHO-K1细胞株(以W-NP-T7RP表示)表达Nluc的稳定性。可以看出，基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统的CHO-K1细胞株连续转接5次后，Nanoluc萤光素酶的平均发光强度仅降低0.7％，表达水平很稳定。说明通过基因组整合构建基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统的CHO-K1细胞株可稳定表达外源蛋白，T7表达系统未随细胞分裂而逐渐丧失表达能力。
产业上的可利用性
本发明开发了一种用于真核生物生产蛋白质的稳定T7表达系统，其通过将T7RNAP整合到宿主基因组，以及使用病毒加帽酶为T7 RNAP转录产物5′端添加Cap结构，实现了在真核生物中稳定高效地表达重组蛋白的目的。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法
<130> 6504-181522I
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcttcga gaacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 60
gatatcagat ccacggatca ctaaagggaa caaaagctgg agctggcctt gtatcgagat 120
cacttttcgt gatccgctaa tcagcgacgg tcacattagg tttgccaagt cagggtatga 180
accatacgat cagttttcgt gaacctggta cgtatattgt ggcgtttgtg tatattttca 240
ttctttgaca acaatcaata ccaacctcaa ataggaaaag taataagttt ggcgttacac 300
cccaaaagac gccaaacgga tcgaacttac tcaatagcaa ttagcgagac aaaacctacg 360
ttaagacctg taaccgattt atcaaagcac tctgcggttc tttcttggga atattacctg 420
gacattttgt gccctcaaga aacgaggctc tacgagcctg ttggagcccc tcagacatta 480
gccgccacga atcaaacttt ttacgcgatt cggcccatga ggcccgcgga cagcatcaaa 540
ctgtaagatt ccgccacatt ttatacactc tggtccttta actggcaaac cttcgggcgt 600
aatgcccaat ttttcgcctt tgtcttttgc ctttttcact tcacgtgctt ctggtacata 660
cttgcaattt atacagtgat gaccgctgaa tttgtatctt ccatagcatc tagcacatac 720
tcgattttta ccactccaat ctttataaaa atacttgatt ccctttctgg gacaagcaac 780
acagtgtttt agattctttt tttgtgatat tttaagctgt tctcccacac agcagcctcg 840
acatgatttc acttctattt tgttgccaag caagaaattt ttatggcctt ctatcgtaag 900
cccatataca gtactctcac cctggaaatc atccgtgaag ctgaaatata cgggttccct 960
ttttataatt ggcggaactt ctcttgtttt gtgaccactt cgacaatatg acaaaacatt 1020
ctgtgaagtt gttcccccag caacattaca gtcgtatgta aattgacatt ggacttttct 1080
tccttcaatg atttcctccc tagctgacct ggtcgtcttg taggcctctt cgctattacg 1140
ccagctgaat tggagcgacc tcatgctata cctgagaaag caacctgacc tacaggaaag 1200
agttactcaa gaataagaat tttcgtttta aaacctaaga gtcactttaa aatttgtata 1260
cacttatttt ttttataact tatttaataa taaaaatcat aaatcataag aaattcgctt 1320
atttagaagt gtcaacaacg tatctaccaa cgatttgacc cttttccatc ttttcgtaaa 1380
tttctggcaa ggtagacaag ccgacaacct tgattggaga cttgaccaaa cctctggcga 1440
agaattgtta attaagagct cagatcttat cgtcgtcatc cttgtaatcc atcgatacta 1500
gtgcggccgc cctttagtga gggttgaatt cgaattttca aaaattctta cttttttttt 1560
ggatggacgc aaagaagttt aataatcata ttacatggca ttaccaccat atacatatcc 1620
atatacatat ccatatctaa tcttacttat atgttgtgga aatgtaaaga gccccattat 1680
cttagcctaa aaaaaccttc tctttggaac tttcagtaat acgcttaact gctcattgct 1740
atattgaagt acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc 1800
ctccgtgcgt cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc 1860
actgctccga acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat 1920
tggcagtaac ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat 1980
gataatgcga ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt 2040
tttgatctat taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt 2100
caacattttc ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt 2160
gttaatatac ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac atgcccaaga agaagcggaa 2220
ggtcatgaac acgattaaca tcgctaagaa cgacttctct gacatcgaac tggctgctat 2280
cccgttcaac actctggctg accattacgg tgagcgttta gctcgcgaac agttggccct 2340
tgagcatgag tcttacgaga tgggtgaagc acgcttccgc aagatgtttg agcgtcaact 2400
taaagctggt gaggttgcgg ataacgctgc cgccaagcct ctcatcacta ccctactccc 2460
taagatgatt gcacgcatca acgactggtt tgaggaagtg aaagctaagc gcggcaagcg 2520
cccgacagcc ttccagttcc tgcaagaaat caagccggaa gccgtagcgt acatcaccat 2580
taagaccact ctggcttgcc taaccagtgc tgacaataca accgttcagg ctgtagcaag 2640
cgcaatcggt cgggccattg aggacgaggc tcgcttcggt cgtatccgtg accttgaagc 2700
taagcacttc aagaaaaacg ttgaggaaca actcaacaag cgcgtagggc acgtctacaa 2760
gaaagcattt atgcaagttg tcgaggctga catgctctct aagggtctac tcggtggcga 2820
ggcgtggtct tcgtggcata aggaagactc tattcatgta ggagtacgct gcatcgagat 2880
gctcattgag tcaaccggaa tggttagctt acaccgccaa aatgctggcg tagtaggtca 2940
agactctgag actatcgaac tcgcacctga atacgctgag gctatcgcaa cccgtgcagg 3000
tgcgctggct ggcatctctc cgatgttcca accttgcgta gttcctccta agccgtggac 3060
tggcattact ggtggtggct attgggctaa cggtcgtcgt cctctggcgc tggtgcgtac 3120
tcacagtaag aaagcactga tgcgctacga agacgtttac atgcctgagg tgtacaaagc 3180
gattaacatt gcgcaaaaca ccgcatggaa aatcaacaag aaagtcctag cggtcgccaa 3240
cgtaatcacc aagtggaagc attgtccggt cgaggacatc cctgcgattg agcgtgaaga 3300
actcccgatg aaaccggaag acatcgacat gaatcctgag gctctcaccg cgtggaaacg 3360
tgctgccgct gctgtgtacc gcaaggacaa ggctcgcaag tctcgccgta tcagccttga 3420
gttcatgctt gagcaagcca ataagtttgc taaccataag gccatctggt tcccttacaa 3480
catggactgg cgcggtcgtg tttacgctgt gtcaatgttc aacccgcaag gtaacgatat 3540
gaccaaagga ctgcttacgc tggcgaaagg taaaccaatc ggtaaggaag gttactactg 3600
gctgaaaatc cacggtgcaa actgtgcggg tgtcgataag gttccgttcc ctgagcgcat 3660
caagttcatt gaggaaaacc acgagaacat catggcttgc gctaagtctc cactggagaa 3720
cacttggtgg gctgagcaag attctccgtt ctgcttcctt gcgttctgct ttgagtacgc 3780
tggggtacag caccacggcc tgagctataa ctgctccctt ccgctggcgt ttgacgggtc 3840
ttgctctggc atccagcact tctccgcgat gctccgagat gaggtaggtg gtcgcgcggt 3900
taacttgctt cctagtgaaa ccgttcagga catctacggg attgttgcta agaaagtcaa 3960
cgagattcta caagcagacg caatcaatgg gaccgataac gaagtagtta ccgtgaccga 4020
tgagaacact ggtgaaatct ctgagaaagt caagctgggc actaaggcac tggctggtca 4080
atggctggct tacggtgtta ctcgcagtgt gactaagcgt tcagtcatga cgctggctta 4140
cgggtccaaa gagttcggct tccgtcaaca agtgctggaa gataccattc agccagctat 4200
tgattccggc aagggtctga tgttcactca gccgaatcag gctgctggat acatggctaa 4260
gctgatttgg gaatctgtga gcgtgacggt ggtagctgcg gttgaagcaa tgaactggct 4320
taagtctgct gctaagctgc tggctgctga ggtcaaagat aagaagactg gagagattct 4380
tcgcaagcgt tgcgctgtgc attgggtaac tcctgatggt ttccctgtgt ggcaggaata 4440
caagaagcct attcagacgc gcttgaacct gatgttcctc ggtcagttcc gcttacagcc 4500
taccattaac accaacaaag atagcgagat tgatgcacac aaacaggagt ctggtatcgc 4560
tcctaacttt gtacacagcc aagacggtag ccaccttcgt aagactgtag tgtgggcaca 4620
cgagaagtac ggaatcgaat cttttgcact gattcacgac tccttcggta ccattccggc 4680
tgacgctgcg aacctgttca aagcagtgcg cgaaactatg gttgacacat atgagtcttg 4740
tgatgtactg gctgatttct acgaccagtt cgctgaccag ttgcacgagt ctcaattgga 4800
caaaatgcca gcacttccgg ctaaaggtaa cttgaacctc cgtgacatct tagagtcgga 4860
cttcgcgttc gcgtaaatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct 4920
aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa 4980
tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc 5040
ttgagaaggt tttgggacgc tcgaagatcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc 5100
gcgctcgaca acccttaata taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tattaggtct 5160
agtagcttgc ctcgtccccg ccgggtcacc cggccagcga catggaggcc cagaataccc 5220
tccttgacag tcttgacgtg cgcagctcag gggcatgatg tgactgtcgc ccgtacattt 5280
agcccataca tccccatgta taatcatttg catccataca ttttgatggc cgcacggcgc 5340
gaagcaaaaa ttacggctcc tcgctgcaga cctgcgagca gggaaacgct cccctcacag 5400
acgcgttgaa ttgtccccac gccgcgcccc tgtagagaaa tataaaaggt taggatttgc 5460
cactgaggtt cttctttcat atacttcctt ttaaaatctt gctaggatac agttctcaca 5520
tcacatccga acataaacaa ccatgggtaa ggaaaagact cacgtttcga ggccgcgatt 5580
aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca 5640
atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa 5700
acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct 5760
gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg 5820
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<212> DNA
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ttgatgcggg ttgataattt gccgaattga actaaagggc ggccgcacta gtatcgatgg 4260
attacaagga tgacgacgat aagatctgag ctcttaatta acaattcttc gccagaggtt 4320
tggtcaagtc tccaatcaag gttgtcggct tgtctacctt gccagaaatt tacgaaaaga 4380
tggaaaaggg tcaaatcgtt ggtagatacg ttgttgacac ttctaaataa gcgaatttct 4440
tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta tacaaatttt 4500
aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct ttcctgtagg 4560
tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctccaat tcagctggcg taatagcgaa 4620
gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggacgcgc 4680
cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4740
ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4800
ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4860
tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4920
cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4980
tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 5040
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attttaacaa aatattaacg tttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 5160
gtgcggtatt tcacaccgca tagggtaata actgatataa ttaaattgaa gctctaattt 5220
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catccacggt tctatactgt tgacccaatg cgtctccctt gtcatctaaa cccacaccgg 5460
gtgtcataat caaccaatcg taaccttcat ctcttccacc catgtctctt tgagcaataa 5520
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ccttccttcg ttcttccttc tgttcggaga ttaccgaatc aaaaaaattt caaagaaacc 6240
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catggaatgg gataatatca caggaggtac tagactacct ttcatcctac ataaatagac 6720
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tatacaggca acacgcagat ataggtgcga cgtgaacagt gagctgtatg tgcgcagctc 6840
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acatttttta tgtttatctc tagtattact ctttagacaa aaaaattgta gtaagaacta 7200
ttcatagagt gaatcgaaaa caatacgaaa atgtaaacat ttcctatacg tagtatatag 7260
agacaaaata gaagaaaccg ttcataattt tctgaccaat gaagaatcat caacgctatc 7320
actttctgtt cacaaagtat gcgcaatcca catcggtata gaatataatc ggggatgcct 7380
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caggcttttt ttatggaaga gaaaatagac accaaagtag ccttcttcta accttaacgg 7500
acctacagtg caaaaagtta tcaagagact gcattataga gcgcacaaag gagaaaaaaa 7560
gtaatctaag atgctttgtt agaaaaatag cgctctcggg atgcattttt gtagaacaaa 7620
aaagaagtat agattctttg ttggtaaaat agcgctctcg cgttgcattt ctgttctgta 7680
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acaaaaatga agcacagatt cttcgttggt aaaatagcgc tttcgcgttg catttctgtt 7800
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ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 9480
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caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 9708
<210> 8
<211> 9936
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240
ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300
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gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac 1260
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cctacaggaa agagttactc aagaataaga attttcgttt taaaacctaa gagtcacttt 1980
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ctggacaaca ttaaaaactg gaaaaacatt agctggacca atagtcaaaa ccaaataaac 3060
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tttgataatt aagtccttca ggatgtattc aatagaaatt ttacaaccag tagaggagaa 3600
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cgctactaac atctacgttt tgcaccaaga cttggctgaa ccagctaagg aaatctctga 3000
aaaggttcac caaatctacg gtttcccaaa ggaaggtgct tcttctatcg tttctaactt 3060
gttcatccac tacttgatga agaacactca acaagttgaa aacttggctg ttttgtgtca 3120
caagttgttg caaccaggtg gtatggtttg gttcactact atgttgggtg aacaagtttt 3180
ggaattgttg cacgaaaaca gaatcgaatt gaacgaagtt tgggaagcta gagaaaacga 3240
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gcgacagaca gccggctaca acctggacca agtccttgaa cagggaggtg tgtccagttt 4080
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ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 8460
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catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 9089
<210> 11
<211> 8458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
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tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 7680
aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 7740
gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 7800
gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 7860
ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 7920
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 7980
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 8040
gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 8100
tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 8160
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 8220
agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 8280
aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 8340
ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 8400
gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 8458

Claims (10)

1.一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统，其特征在于，所述稳定T7表达系统包含T7RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，
所述T7 RNA聚合酶的基因带有核定位序列，用于构建整合型载体，并转化真核菌株或真核细胞，构建基因组上携带有所述T7 RNA聚合酶的基因的宿主菌株或宿主细胞，
所述病毒加帽酶用于构建带有核定位序列的所述病毒加帽酶的基因的载体，并将包含所述目标基因的片段的所述T7转录单元插入所述载体，得到含有所述病毒加帽酶的基因和所述目标基因的载体，
将含有所述病毒加帽酶的基因和所述目标基因的载体转化到所述真核菌株或真核细胞中，由此构建所述稳定T7表达系统。
2.根据权利要求1所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶带有内含肽。
3.根据权利要求1或2所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述病毒加帽酶带有内含肽。
4.根据权利要求1或2所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶为融合型或游离型。
5.根据权利要求1或2所述的稳定T7表达系统，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶的启动子，使用所述真核生物的终止子作为表达所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶转录的终止子。
6.根据权利要求1或2所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述病毒加帽酶选自由呼吸道合胞病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、口炎疱疹病毒加帽酶和乳酸克鲁维酵母线性质粒加帽酶组成的组中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述核定位序列选自由SV40 T-Antigen核定位序列、Nucleoplasmin核定位序列、EGL-13核定位序列、c-Myc核定位序列和TUS-protein核定位序列组成的组中的至少一种。
8.一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶的稳定T7表达系统，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，
所述方法包括：
1) 合成带有核定位序列的所述T7 RNA聚合酶的基因的序列，并构建到整合型载体中，所述T7 RNA聚合酶任选地带有或不带有内含肽，以构建融合型或游离型的所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶；
2) 将所述整合型载体直接转化或线性化后转化所述真核菌株或真核细胞，得到所述基因组上整合了带有核定位序列的所述T7 RNA聚合酶的基因的真核菌株或真核细胞；
3) 构建带有核定位序列的所述病毒加帽酶的基因的载体，以含有所述目标基因的质粒为模板扩增包含有所述T7转录单元的目标蛋白DNA片段，回收在所述T7转录单元中包含所述目标基因的片段，将其插入带有所述核定位序列的所述病毒加帽酶的基因的载体中，得到含有所述病毒加帽酶的基因和所述目标基因的载体；
4) 将3)中得到的所述载体转化到2)中的所述整合后的所述真核菌株或真核细胞中，构建所述基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统；和
5) 使用所述稳定T7表达系统，用报告基因在重组的所述真核菌株或细胞中表达目标蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，使用编码Nanoluc萤光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为所述报告基因验证所述表达系统表达的所述目标蛋白。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述真核生物为酵母菌、丝状真菌、哺乳动物或昆虫。
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