CN108094411A - 一种pbmc细胞的冻存方法及复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PBMC细胞的冻存方法，包括：(1)PBMC细胞离心得到细胞沉淀，重悬，滴加2×冻存液，维持细胞悬液的密度为2×107/ml，分装到冻存管中；(2)放入程序降温仪，逐渐降温至‑90℃后转移至液氮中进行长期保存。本发明还公开了一种PBMC细胞的复苏方法，包括：(1)将保存有PBMC细胞的冻存管取出，迅速放入水浴中，反复震荡5～15次，震荡时间控制在3min以内；(2)细胞悬液用X‑VIVO无血清培养基洗涤，维持细胞密度在1～2×106/ml。本发明的冻存方法通过程序性降温仪精确控制降温速率，能有效避免冰晶的产生，降低细胞的损伤，显著提高PBMC细胞冻存复苏24h后的冻存复苏活率。

Description

一种PBMC细胞的冻存方法及复苏方法
技术领域
本发明涉及一种PBMC细胞的冻存方法及复苏方法，属于细胞生物学领域。
背景技术
外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。即：非骨髓血中的单核造血干细胞、骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，这样得到的干细胞称为外周血单个核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque(葡聚糖－泛影葡胺)密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
免疫治疗中使用的CIK，DC-CIK，NK，CAR-T等免疫细胞都从PBMC中通过不同的方式诱导而来，在细胞免疫治疗领域具有重要的地位。然而新鲜分离的PBMC由于其细胞种类复杂，冻存和复苏过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。因此，本领域需要有冻存、复苏PBMC的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂(实验证明二甲基亚砜更好)，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
影响冻存复苏活率的因素很多：冻存前的细胞质量，冻存细胞浓度，冻存液的种类，冻存中的温度控制，冻存复苏时的实验操作等都会影响冻存复苏活率。新鲜复苏的PBMC细胞的冻存复苏活率一般都在90％以上，但是24h之内会有细胞出现凋亡，因此，细胞的冻存复苏活率，很大程度上取决于细胞复苏后的24h之内的状况。细胞冻存的方法在现有技术中采用最多的是利用程序性降温盒置于超低温冰箱中放置24～72h，再转移至液氮中进行长期的保存。但程序性降温盒在逐渐降温的过程中无法精确控制降温速率，会导致冻存液中形成较多的冰晶，导致细胞受到较大的损伤。程序性降温仪作为可以由程序来控制温度的仪器，在细胞冻存过程中必将发挥越来越重要的作用。然而程序性降温仪的降温曲线，特别是针对PBMC 的降温曲线，并没有被科研工作者所充分关注。
发明内容
针对上述现有技术，本发明为了解决上述问题，经过深入的研究和创造性的劳动，对比了冻存密度对冻存复苏活率的影响，同时对比了常规使用的程序性降温盒和各种降温程序的程序性降温仪用来冻存PBMC细胞对冻存复苏活率的影响，找出了一种冻存复苏活率最高的程序，为PBMC在免疫治疗中的应用提供基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种PBMC细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)全血中分离得到的PBMC细胞，离心，得到细胞沉淀，将胎牛血清逐滴加入沉淀中重悬细胞制成细胞悬液，然后将等体积的2×冻存液逐滴加入到细胞悬液中，维持细胞悬液的密度为2×107/ml，分装到冻存管中(1ml/管)；注：此过程在冰上进行；
所述2×冻存液，是通过以下方法制备得到的：将二甲基亚砜逐滴加入到胎牛血清中，并混匀，4℃存放，备用，胎牛血清与二甲基亚砜的体积比为：4～9:1；
(2)将上述冻存管放入程序降温仪(程序降温仪能够更精确地控制降温速率，避免冰晶的产生，降低细胞的损伤)，逐渐降温至-90℃后转移至液氮中进行长期保存；所述程序降温仪的降温程序为：
4℃～-20℃，-0.3°/min；
-20℃～-40℃，-0.5°/min；
-40℃～-90℃，-5°/min；
-90℃，维持5min。
一种PBMC细胞冻存液，由以下组分组成：按体积百分数，全细胞培养液或者胎牛血清 90～95％；二甲基亚砜5～10％。
优选的，由以下组分组成：全细胞培养液或者胎牛血清90％；二甲基亚砜10％。
一种PBMC细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)将冻存管从液氮中取出，迅速放入水浴(优选水浴锅)中，水浴的温度为37℃±1℃，将冻存管在水浴中反复震荡5～15次，震荡时间控制在3min以内(优选控制在2min以内)，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴中取出；
(2)小心的将冻存管中融化的细胞悬液吸入离心管中(优选15ml离心管)，然后将预冷(4℃预冷)的X-VIVO无血清培养基逐滴加入到离心管中，预冷的X-VIVO无血清培养基的体积为细胞悬液的10倍；300g离心5min；倒掉培养基，重复用预冷的X-VIVO无血清培养基洗涤一次；洗涤后，向沉淀中加入X-VIVO无血清培养基，维持细胞密度在1～2×106/ml。
一种计算PBMC细胞冻存复苏活率的方法：PBMC细胞复苏后24h检测细胞活率，计算现有的活细胞数；具体操作为：4％台盼蓝染色，使台盼蓝的终浓度为1％，取20ul台盼蓝染色的PBMC混合液加入血球计数板，计算4个大方格之内的活细胞数和总细胞数，则24h后现有的活细胞总数＝(活细胞数/总细胞数)*细胞体积；PBMC细胞冻存复苏24h后冻存复苏活率＝24h后现有的活细胞总数/冻存前细胞数。
本发明的有益效果是：
1.与现有的程序性降温盒的方式冻存的PBMC细胞相比，程序性降温仪的方式冻存PBMC，并采用本发明的程序性降温程序，能大大提高PBMC细胞冻存复苏24h后冻存复苏活率。
2.与现有的冻存复苏活率的计算方法相比，本发明采用PBMC细胞冻存复苏24h后的活细胞数计算冻存复苏活率，考虑到了细胞复苏后的24h之内细胞的状态不稳定，容易出现凋亡的因素，更真实的反应了PBMC的冻存复苏活率。
本发明通过程序性降温仪的降温程序来控制细胞冻存过程中温度下降的速率，最大限度的减少了冻存复苏过程中可能出现的冰晶对细胞的损伤，特别是针对PBMC细胞的损伤，提高了冻存复苏活率，为PBMC在免疫治疗中的应用提供了更有力的保障。
附图说明
图1：不同冻存密度的PBMC复苏后0h冻存复苏活率图。
图2：不同冻存密度的PBMC复苏后24h冻存复苏活率图。
图3：不同降温方式的PBMC复苏后0h冻存复苏活率图。
图4：不同降温方式的PBMC复苏后24h冻存复苏活率图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：PBMC细胞的提取
将血样平均分装到50ml离心管中，每管分装体积不要超过45ml，2000rpm离心10min；离心后，吸取离心管内上层血浆置于50ml离心管中灭活以备用，吸至距分界面0.5cm处为止，用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞；分装人淋巴细胞分离液至50ml离心管，每支分装15ml，倾斜装有Ficoll的离心管，缓慢地将上一步稀释的血样加到Ficoll液面上，使其呈清晰界面，血样与Ficoll比例不超过2:1，1600rpm离心20min；离心后，吸弃上清，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，1500rpm离心10min；离心后，弃去上清，所剩沉淀加生理盐水至45ml，混匀，1500rpm离心10min；离心后，弃去上清，所剩沉淀即所需单个核细胞。
实施例2：PBMC不同的冻存密度对冻存复苏活率的影响
以体积比胎牛血清：二甲基亚砜＝4:1配制2×冻存液(将DMSO逐滴加入到胎牛血清中，并混匀)，并放置于4℃冰箱冷却备用。
将全血中分离的PBMC细胞离心得到细胞沉淀，将胎牛血清逐滴加入沉淀中重悬细胞制成细胞悬液，然后将配好置于4℃冰箱冷却备用的等体积2×冻存液逐滴加入到细胞悬液中，维持细胞悬液的密度分别为5×106/ml、1×107/ml 2×107/ml(此过程在冰上进行)。
将上述细胞与冻存液混合成的细胞悬液以1ml/管分装到冻存管中(此过程在冰上进行)。将冻存管放入装有异丙醇的程序性降温盒中，于-80℃超低温冰箱中过夜，次日转入液氮罐。
将从液氮中取出的冻存管迅速放入37℃水浴装置(优选水浴锅)中。
将冻存管在水浴装置中反复震荡5～15次，震荡时间控制在3min以内，直至看到冻存容器中只剩下一团冰晶后从水浴装置中取出。
小心的将融化的细胞悬液吸入离心管中，优选15ml离心管，然后将预冷的X-VIVO无血清培养基逐滴加入到离心管中，预冷的X-VIVO无血清培养基的体积为细胞悬液的10倍。300g 离心5min。倒掉培养基，重复用预冷的X-VIVO无血清培养基洗涤一次。向沉淀中加入X-VIVO 无血清培养基，维持细胞密度在1～2×106/ml。
即时检测细胞活率，计算新鲜复苏的PBMC(0h)的活细胞数。4％台盼蓝染色，使台盼蓝的终浓度为1％，取20ul台盼蓝染色的PBMC混合液加入血球计数板，计算4个大方格之内的活细胞数和总细胞数，则现有的活细胞总数＝(活细胞数/总细胞数)*细胞体积。PBMC细胞复苏0h冻存复苏活率＝现有的活细胞总数/冻存前细胞数。
24h后检测细胞活率，计算现有的活细胞数。4％台盼蓝染色，使台盼蓝的终浓度为1％，取20ul台盼蓝染色的PBMC混合液加入血球计数板，计算4个大方格之内的活细胞数和总细胞数，则24h后现有的活细胞总数＝(活细胞数/总细胞数)*细胞体积。PBMC细胞冻存复苏 24h后冻存复苏活率＝24h后现有的活细胞总数/冻存前细胞数。
如图1所示，0h时5×106/ml、1×107/ml、2×107/ml密度的冻存复苏活率的Mean±SD 分别为91.29±4.030、93.00±3.786、91.57±4.614，统计学分析显示各组之间无统计学意义。
如图2所示，24h时5×106/ml、1×107/ml、2×107/ml密度的冻存复苏活率的Mean±SD 分别为22.29±4.030、36.24±11.18、33.98±17.13。5×106/ml密度的冻存复苏活率最低。而统计学分析亦显示1×107/ml、2×107/ml组之间P值为0.7211，2组之间无统计学差异。综合考虑成本及工作量后确定冻存密度为2×107/ml。
实施例3：程序性降温仪的方式降温对PBMC冻存复苏活率的影响
以体积比胎牛血清：二甲基亚砜＝4:1配制2×冻存液(将DMSO逐滴加入到胎牛血清中，并混匀)，并放置于4℃冰箱冷却备用。
将全血中分离的PBMC细胞离心得到细胞沉淀，将胎牛血清逐滴加入沉淀中重悬细胞制成细胞悬液，然后将配好置于4℃冰箱冷却备用的等体积2×冻存液逐滴加入到细胞悬液中，维持细胞悬液的密度分别为2×107/ml(此过程在冰上进行)。
将上述细胞与冻存液混合成的细胞悬液以1ml/管分装到冻存管中(此过程在冰上进行)。
将上述装有细胞悬液的冻存管分别以以下5种方式冻存：
(1)程序性降温盒常规冻存：将冻存管放入装有异丙醇的程序性降温盒中，于-80℃超低温冰箱中过夜，次日转入液氮罐。
(2)程序性降温仪冻存，冻存程序为A：
4℃维持5min；
4℃---40℃，-1℃/min；
-40℃---90℃，-10℃/min；
-90℃，维持5min。
程序结束后转入液氮罐。
(3)程序性降温仪冻存，冻存程序为B：
4℃维持5min；
4℃---20℃，-0.3℃/min；
-20℃---40℃，-0.5℃/min；
-40℃---90℃，-5℃/min；
-90℃，维持5min。
程序结束后转入液氮罐。
(4)程序性降温仪冻存，冻存程序为C：
4℃维持5min；
4℃---4℃，-1℃/min；
-4℃---12℃，-25℃/min；
-12℃---40℃，-1℃/min；
-40℃---90℃，-10℃/min；
-90℃，维持5min。
程序结束后转入液氮罐。
(5)程序性降温仪冻存，冻存程序为D：
4℃---1℃，-2.5℃/min；
-1℃--0℃，1℃/min；
0℃，维持3min；
-0℃---10℃，-2℃/min；
-10℃，维持5min；
-10℃---45℃，-1℃/min；
-45℃，维持35min；
-45℃---90℃，-4.5℃/min；
-90℃，维持5min。
程序结束后转入液氮罐。
上述4种程序性降温仪冻存程序中，C、D程序为检索到的公开专利中的降温程序。
参照实施例2中的复苏方法分别复苏5种冻存方式冻存的PBMC细胞，计算PBMC细胞复苏0h及24h后冻存复苏活率。
如图3所示，程序性降温盒、程序性降温仪(程序A)、程序性降温仪(程序B)、程序性降温仪(程序C)、程序性降温仪(程序D)在冻存复苏0h后冻存复苏活率的Mean±SD分别为91.80±3.271、91.33±1.155、93.57±2.070、90.33±1.528、92.33±2.517。
如图4所示，程序性降温盒、程序性降温仪(程序A)、程序性降温仪(程序B)、程序性降温仪(程序C)、程序性降温仪(程序D)在冻存复苏0h后冻存复苏活率的Mean±SD分别为28.84±7.284、26.53±1.464、46.5±16.38、33.72±12.35、38.25±8.511。
结果显示，PBMC细胞复苏0h后冻存复苏活率都在90％以上，24h后冻存复苏活率会出现显著下降。而程序性降温仪(程序B)冻存后复苏24h后冻存复苏活率最高，比传统的程序性降温盒的冻存复苏活率高，也比检索到的公开专利中的降温程序的冻存复苏活率高。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (9)

1.一种PBMC细胞的冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)全血中分离得到的PBMC细胞，离心，得到细胞沉淀，将胎牛血清逐滴加入沉淀中重悬细胞制成细胞悬液，然后将等体积的2×冻存液逐滴加入到细胞悬液中，维持细胞悬液的密度为2×107/ml，分装到冻存管中；
所述2×冻存液，是通过以下方法制备得到的：将二甲基亚砜逐滴加入到胎牛血清中，并混匀，4℃存放，备用，胎牛血清与二甲基亚砜的体积比为：4～9:1；
(2)将上述冻存管放入程序降温仪，逐渐降温至-90℃后转移至液氮中进行长期保存；所述程序降温仪的降温程序为：
4℃～-20℃，-0.3°/min；
-20℃～-40℃，-0.5°/min；
-40℃～-90℃，-5°/min；
-90℃，维持5min。
2.根据权利要求1所述的PBMC细胞的冻存方法，其特征在于：所述步骤(1)的操作过程在冰上进行。
3.根据权利要求1所述的PBMC细胞的冻存方法，其特征在于：所述胎牛血清与二甲基亚砜的体积比为：4:1。
4.一种PBMC细胞冻存液，其特征在于：由以下组分组成：按体积百分数，全细胞培养液或者胎牛血清90～95％；二甲基亚砜5～10％。
5.根据权利要求4所述的PBMC细胞冻存液，其特征在于：由以下组分组成：全细胞培养液或者胎牛血清90％；二甲基亚砜10％。
6.一种PBMC细胞的复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将保存有PBMC细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入水浴中，水浴的温度为37℃±1℃，将冻存管在水浴中反复震荡5～15次，震荡时间控制在3min以内，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴中取出；
(2)小心的将冻存管中融化的细胞悬液吸入离心管中，然后将预冷的X-VIVO无血清培养基逐滴加入到离心管中，预冷的X-VIVO无血清培养基的体积为细胞悬液的10倍；300g离心5min；倒掉培养基，重复用预冷的X-VIVO无血清培养基洗涤一次；洗涤后，向沉淀中加入X-VIVO无血清培养基，维持细胞密度在1～2×106/ml。
7.根据权利要求6所述的PBMC细胞的复苏方法，其特征在于：所述震荡时间控制在2min以内。
8.根据权利要求6所述的PBMC细胞的复苏方法，其特征在于：所述冻存管，是指利用权利要求1或2或3的方法所得到的保存有PBMC细胞的冻存管。
9.一种计算PBMC细胞冻存复苏活率的方法，其特征在于：4％台盼蓝染色，使台盼蓝的终浓度为1％，取20ul台盼蓝染色的PBMC混合液加入血球计数板，计算4个大方格之内的活细胞数和总细胞数，则24h后现有的活细胞总数＝(活细胞数/总细胞数)*细胞体积；PBMC细胞冻存复苏24h后冻存复苏活率＝24h后现有的活细胞总数/冻存前细胞数。
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