CN105238756A - 一种脐带血单核细胞的制备方法 - Google Patents

一种脐带血单核细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脐带血单核细胞的制备方法：步骤一、脐带血筛选与保存：采集、筛选健康足月产妇志愿者脐带血，置于低温下保存；步骤二、脐带血分离：对所述保存后的脐带血进行离心，得血浆；步骤三、加液：向所述血浆中加入淋巴细胞分离液，离心，得单核细胞层；步骤四、收集单核细胞：取所述单核细胞层，离心，即得单核细胞；步骤五、细胞培养：取所述单核细胞进行培养，调整细胞密度至设定值；步骤六、单核细胞冻存：向培养后的单核细胞中加入冷冻保护液，预冷后冻存，即可。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、系统监控，以实现脐带血单核细胞分离、冷冻的标准产品。

Description

一种脐带血单核细胞的制备方法
技术领域
本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种脐带血单核细胞的制备方法。
背景技术
脐带血是造血干细胞的来源之一，造血干移植已成为治疗多种血液病、某些恶性实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。临床应用已证明造血干细胞移植对于重建或者改善骨髓造血功能有良好的疗效。单核细胞(包括单核细胞、淋巴细胞、干细胞等)是造血干细胞移植的有效成分。单核细胞的分离是干细胞移植和进一步研究的关键，它直接关系到分离后样本体积、造血干/祖细胞或间充质干细胞分离率、细胞活性维持及移植的成败。
脐带血单核细胞冻存更是解决了空间的问题。低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。
脐带血单核细胞冻存也是为细胞治疗标准化提供了基础，使用统一浓度的细胞进行冻存，便于检测细胞冻存前后各项指标，为实现产业化标准化提供数据支持。
中国发明专利CN200810089682.2公开了一种分离单个核细胞的方法和装置，其步骤包括诸如：将人脐带血使用Ficoll-Hypaque分层法，通过密度梯度离心去除红细胞，获得单核细胞，洗涤，离心以及将细胞接种于培养基内进行培养等。
但目前公开的脐带血单核细胞制备方法虽均能获得单核细胞，但都不进行冷冻，很难实现标准化。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备冷冻完成的全过程进行统一、系统监控，以实现单核细胞的标准产品。尽管目前细胞冷冻技术比较成熟，但是将其应用脐带血单核细胞存在很大的技术难题和非凡的意义。
脐血干细胞(UCB)是干细胞移植的重要来源之一，具有来源丰富、采集简单，免疫排斥发病率低，移植成功率高且不受伦理学限制等优点。但单条脐带血干细胞含量有限，如果能够建立完善的脐血库，使复苏后的细胞尽可能地保证各种生物学特性不受损伤，那么就可以彻底解决脐血样本不足的问题。
目前冻存细胞多应用于自体脐带血保存，冻存时保留了大量红细胞，不适于异体移植。且红细胞裂解后释放出血红蛋白易引起患者一过性血红蛋白尿，有引起急性肾功衰竭的危险。HSC冻存后复苏应用于临床不仅有利于节约人力物力，避免资源浪费，而且也为质控检测提供了充足的时间保证。
同时，要分离1份脐血需要至少2.5h，直接使用的时候，考虑到细胞检测周期，通常需要准备2-3份，以保证临床使用，细胞使用后多余的都直接废弃了。造成资源的浪费，成本累积。使用新鲜培养的细胞无法满足细胞周期需求，在使用的时候存在风险，分离后需要做无菌检测，细菌污染检测结果需要7天，真菌检测结果需要14天，这个周期比较长，而新鲜培养的脐带血只能存放7天。
发明内容
针对现有技术的缺陷和难题，本发明提供一种脐带血单核细胞的制备方法，本发明的方法是一种节约成本、安全可控的方法，本发明制备方法在脐带血采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，之后进行分离培养，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种脐带血单核细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、脐带血筛选与保存：将分离、筛选的脐带血置于低温下保存；
步骤二、脐带血分离：对所述保存后的脐带血进行离心，得血浆；
步骤三、加液：向所述血浆中加入淋巴细胞分离液，离心，得单核细胞层；
步骤四、收集单核细胞：取所述单核细胞层，离心，即得单核细胞；
步骤五、细胞培养：取所述单核细胞进行培养，调整细胞密度至设定值；
步骤六、单核细胞冻存：向培养后的单核细胞中加入冷冻保护液，预冷后冻存，即可。
优选地，步骤一中，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史；
所述脐带血是从健康足月产妇志愿者中采集、筛选而来；
所述保存具体是置于血袋中保存的；
所述低温具体指温度范围为8～10℃。
优选地，步骤二中，所述脐带血的分离需要于低温保存6小时内进行；
所述离心的条件为1700～2000g、10～15min；
本步骤中，将所得到的血浆血浆分装至4.5ml冻存管(冻存管量程)，每管4ml。
优选地，步骤三中，所述淋巴细胞分离液为市售产品；
所述血浆与所述淋巴细胞分离液的体积比为2:1；
所述离心的条件为650～750g、19～20min。
优选地，步骤四中，所述离心的条件为650～750g、8～10min。
优选地，所述方法还包括在步骤四之后合并、收集单核细胞的步骤；所述收集具体方式为300～350g离心8～10min。
优选地，所述方法还包括根据实际需要对红细胞进行裂解的步骤；
进一步地，所述裂解用的红细胞裂解液为市售产品、裂解时间不超过30秒，裂解终止采用生理盐水；
所述裂解之后离心即可；所述离心的条件为300～350g、8～10min。
优选地，步骤五中，所述培养采用的培养基为市售完全培养基、培养时间为3～4天；所述设定值为0.8～1.6×108/T75瓶。
优选地，步骤六中，所述冷冻保护液为体积分数为5％血浆的DMSO溶液，用于保护冷冻细胞的活性；
所述预冷条件为4℃、30min以上，DMSO在常温下有毒，为降低试剂对细胞的毒性伤害，需进行预冷，根据相关文献，在4℃毒性比较小；
所述的血浆为自体血浆或异体血浆，如果选用异体血浆则需对血浆进行病毒、微生物等相关检测；
所述冷冻保护液的使用终浓度5％，体积分数。
优选地，所述冻存具体指预冷后将细胞转入-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮保存。
优选地，步骤六还包括对培养后的单核细胞上清液进行无菌检测、支原体检测；
所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；
所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
优选地，所述方法包括在所述单核细胞冻存之后对单核细胞进行复苏的步骤；
优选地，所述复苏的步骤具体包括：取冷冻的单核细胞，解冻，生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并用复方电解质溶液混匀。
进一步优选地，所述解冻的条件为37～40℃，2min内；
所述洗涤的次数为2遍；
所述离心的条件为300～350g、8～10min；
所述复方电解质溶液可以购买20％白蛋白溶液用盐水稀释10倍得到，也可以购买(华兰生物可以购买)，也可以使用自体血浆作为溶液使用终浓度为2％。
优选地，所述内毒素检测包括用鲎试剂(厦门鲎试剂厂，0.25EU/ML)进行检测；所述细菌检测包括用革兰氏染色液进行检测。
本发明在实施过程中，对冷冻保护液的组分进行了筛选，相比之下，5％DMSO+血浆比5％DMSO+右旋糖酐、5％DMSO+培养基要效果好，在复苏后细胞活率无明显变化。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、全过程全面质量监控，从脐带血采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；
2、无血清培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险；
3、低浓度冻存保护剂，保持细胞的活性及干细胞的干性，使复苏后的细胞尽可能地保证各种生物学特性不受损伤，
4、复苏后内毒素、革兰氏染色、活率的检测，保证细胞的稳定性及安全性；
5、本申请还包括裂解红细胞的步骤，解决了现有技术不适于异体移植的问题，避免了异体移植引起急性肾功衰竭等负面作用；
6、本发明方法克服了新鲜脐带血干细胞使用过程中保存期短、检测耗时长、细胞源浪费的问题，是一种节约成本的方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐带血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于采血袋中8℃保存，并于6小时内进行分离处理；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、脐带血分离：将脐带血转移到离心管中，每管25～40ml，并留取血样计血液成分。2000g，离心10min；血浆分装至4.5ml冻存管，每管4ml；
步骤三、脐带血缓慢加上淋巴细胞分离液上，脐带血添加量与分离液分别是30ml和15ml，700g离心19～20min；
步骤四、收集单核细胞：离心后细胞分层，取单核细胞层，750g离心10min；
步骤五、合并单核细胞，300g离心10min；
步骤六、根据需求选择是否进行红细胞裂解。加裂解液2～4ml，时间不超过30s，使用生理盐水终止裂解，取样计数，300g离心10min；
步骤七、细胞培养：根据计数结果，调整细胞密度至0.8～1.6×108/T75瓶；
步骤八、单核细胞冻存：细胞培养3-4天，收集细胞计数和活率，冷冻保护液为5％的血浆和DMSO混合溶液，4℃预冷60min，按1～4×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
步骤九、单核细胞细胞复苏：取冷冻细胞，40℃，2min内迅速解冻，复苏后用生理盐水洗涤两遍，300g离心10min，计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并用复方电解质溶液混匀。
实施例2
本实施例提供一种单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐带血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于采血袋中9℃保存，并于6小时内进行分离处理；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、脐带血分离：将脐带血转移到离心管中，每管25～40ml，并留取血样计血液成分。1700g，离心10min；血浆分装至4.5ml冻存管，每管4ml；
步骤三、脐带血缓慢加上淋巴细胞分离液上，脐带血添加量与分离液分别是30ml和15ml，650g离心19～20min；
步骤四、收集单核细胞：离心后细胞分层，取单核细胞层，650g离心10min；
步骤五、合并单核细胞，300g离心10min；
步骤六、根据需求选择是否进行红细胞裂解。加裂解液2～4ml，时间不超过30s，使用生理盐水终止裂解，取样计数，350g离心10min；
步骤七、细胞培养：根据计数结果，调整细胞密度至0.8～1.6×108/T75瓶；
步骤八、单核细胞冻存：细胞培养3～4天，收集细胞计数和活率，冷冻保护液为5％的血浆和DMSO混合溶液，4℃预冷90min，按1～4×107/ml/管进行冷冻保存(-80℃过夜，第二天转入液氮保存)；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
步骤九、单核细胞细胞复苏：取冷冻细胞，37℃，2min内迅速解冻，复苏后用生理盐水洗涤两遍，300g离心10min，计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并用复方电解质溶液混匀。
实施例3
本实施例提供一种单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐带血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于采血袋中10℃保存，并于6小时内进行分离处理；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、脐带血分离：将脐带血转移到离心管中，每管25～40ml，并留取血样计血液成分。1850g，离心10min；血浆分装至4.5ml冻存管，每管4ml；
步骤三、脐带血缓慢加上淋巴细胞分离液上，脐带血添加量与分离液分别是30ml和15ml，750g离心19～20min；
步骤四、收集单核细胞：离心后细胞分层，取单核细胞层，750g离心10min；
步骤五、合并单核细胞，350g离心10min；
步骤六、根据需求选择是否进行红细胞裂解。加裂解液2～4ml，时间不超过30s，使用生理盐水终止裂解，取样计数，300g离心10min；
步骤七、细胞培养：根据计数结果，调整细胞密度至0.8～1.6×108/T75瓶；
步骤八、单核细胞冻存：细胞培养3～4天，收集细胞计数和活率，冷冻保护液为5％的血浆和DMSO混合溶液，4℃预冷200min，按1～4×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
步骤九、单核细胞细胞复苏：取冷冻细胞，40℃，2min内迅速解冻，复苏后用生理盐水洗涤两遍，350g离心10min，计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并用复方电解质溶液混匀。
性能测试
对实施例1～3制备的单核细胞进行标准检测，检测结果如下表所述：
表1
实施例1 实施例2 实施例3
人类免疫缺陷病毒 阴性 阴性 阴性
HIV-RNA荧光定性 阴性 阴性 阴性
HTLV-Ⅰ/Ⅱ型抗体 阴性 阴性 阴性
乙肝表面抗原定性 阴性 阴性 阴性
乙肝表面抗体定性 阴性 阴性 阴性
乙肝e抗原定性 阴性 阴性 阴性
乙肝e抗体定性 阴性 阴性 阴性
乙肝核心抗体定性 阴性 阴性 阴性
丙肝病毒抗体 阴性 阴性 阴性
丙肝病毒RNA定性 阴性 阴性 阴性
CMV-IgM抗体 阴性 阴性 阴性
梅毒螺旋体特异抗体 阴性 阴性 阴性
细菌、真菌血培养 无菌生长 无菌生长 无菌生长
支原体培养 阴性 阴性 阴性
内毒素检测 阴性 阴性 阴性
革兰氏染色 合格 合格 合格
细胞数(分离后) 1.34×108 1.54×108 1.35×108
细胞活率(分离后) 90％ 88％ 91％
细胞数(复苏后) 1.00×108 1.04×108 1.30×108
细胞活率(复苏后) 89％ 88％ 90％
检测结果显示，本发明制备方法制备所得的单核细胞的各项标准均符合应用要求。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、脐带血筛选与保存：将分离、筛选的脐带血置于低温下保存；
步骤二、脐带血分离：对所述保存后的脐带血进行离心，得血浆；
步骤三、加液：向所述血浆中加入淋巴细胞分离液，离心，得单核细胞层；
步骤四、收集单核细胞：取所述单核细胞层，离心，即得单核细胞；
步骤五、细胞培养：取所述单核细胞进行培养，调整细胞密度至设定值；
步骤六、单核细胞冻存：向培养后的单核细胞中加入冷冻保护液，预冷后冻存，即可。
2.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤一中，所述脐带血是从健康足月产妇志愿者中采集、筛选而来；
所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史；
所述低温具体指温度范围为8～10℃。
3.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤二中，所述脐带血的分离需要于低温保存6小时内进行；
所述离心的条件为1700～2000g、10～15min。
4.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤三中，所述血浆与所述淋巴细胞分离液的体积比为2:1；
所述离心的条件为650～750g、19～20min。
5.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤四中，所述离心的条件为650～750g、8～10min。
6.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述方法还包括在步骤四之后合并、收集单核细胞的步骤。
7.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述方法还包括根据实际需要对红细胞进行裂解的步骤。
8.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤六中，所述冷冻保护液为体积分数为5％血浆的DMSO溶液；
所述冷冻保护液的使用终浓度5％，体积分数。
9.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述冻存具体指预冷后将细胞转入-80℃过夜，然后转入液氮保存。
10.根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述方法包括在所述单核细胞冻存之后对单核细胞进行复苏的步骤。
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