CN112438252B - 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法。本发明所述的方法可以解决目前缺少适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冻存方法这一问题，填补目前的技术空白，将有力地促进单细胞测序技术在模式动物中的广泛应用；本发明所述方法采用瞬时速冻技术，在极短的瞬间将组织样本冷冻，避免梯度降温过程中因为细胞仍然具有一定活性而造成冻存过程中转录组发生改变，结果更加准确可靠；本发明所述的方法避免进行解离、梯度冻存的复杂操作，在40分钟内即可完成组织样本的冻存，时间大大缩短，提高效率，便于开展大量样本的冻存。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种冷冻及解冻技术，具体涉及一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，以及适用于小鼠心脏组织单细胞测序的冻存液和组合试剂。
背景技术
单细胞测序技术通过解析单个细胞的转录组，来构建组织的细胞相互作用网络，正日益成为生命科学研究的基础技术手段。保持高的样本细胞活性是开展单细胞测序实验的前提条件，因此组织保存液是开展单细胞测序的重要保障。
目前单细胞测序样本可以通过冻存的方式来保存。通过在保存液中加入DMSO等冷冻保护剂，将样本保存于超低温冰箱(-80℃)、液氮或干冰中，可以维持细胞活性，保证后续实验顺利开展。《Single Cell Transcriptome Conservation in Cryopreserved Cellsand Tissues》对该方案进行了检验，证明这一方法适用于单细胞测序流程。但其方法仍未解决的主要问题有两个：第一，梯度降温时间较长，过程中细胞仍保有一定的代谢活性，会引发细胞转录组的改变，引起“失真”，降低结果的准确性和可靠性，这一点已在文献《Systematic assessment oftissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq work flows》中得到证实；第二，该方法仅适用于细胞样本，组织样本必须首先经过解离后才能进行冻存，增加了操作的复杂度，难以进行大量样本的采集。
小鼠是医学研究、生物学基础研究常用的动物模型，但目前仍缺少适用于单细胞测序的小鼠组织冻存液，特别是对于心脏等较为“坚硬”的组织，应用传统的小鼠胚胎瞬时冻存技术时(Cryopreservation of Mammalian Embryos，Methods in MolecularBiology,vol.368:Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols,Second Edition)，解冻后的活细胞比例较低，且细胞结团比例等指标无法满足后续单细胞测序实验的要求，因此目前仍然缺少适用于进行单细胞测序的心脏组织的瞬时冷冻保存方法，亟需开发一种新的适用于单细胞测序实验的组织冻存液。
发明内容
现有技术中对于胚胎组织单细胞测序研究比较多，虽然心脏和胚胎都是生物组织，但在生物学特性、理化特性上具有比较大的差异，适用于胚胎的冻存方法并不能简单适用于心脏组织。本发明在大量的深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，及相应的组织冻存液配方和解冻液配方。
本发明提供了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，包括如下具体步骤：
(1)配置平衡液及冻存液：开始取材前，先分别配置平衡液与冻存液，并将配置好的溶液预冷；
(2)制备样本：将小鼠心脏组织置于离心管中，离心管置于冰上并使用DMEM培养基进行漂洗，然后剪碎，再用DMEM培养基进行漂洗，得组织块；
(3)平衡样本：向步骤(2)得到的组织块中加入平衡液，并在摇床上孵育平衡组织块；
(4)冻存液渗透：将平衡液吸出，加入冻存液，然后在摇床上孵育渗透组织块；
(5)瞬时冷冻及转移保存：将冻存液吸出，组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻；然后将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存；
(6)解冻试剂准备：开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4，并分别预热四种解冻液；
(7)取出冻存样本：将-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管取出，打开管盖，加入解冻液1，室温下放置；
(8)解冻液孵育：将组织块转移到离心管中，向冻存管中再加入解冻液1，室温下，摇床上孵育；然后将解冻液1吸出，加入解冻液2，室温下，摇床上孵育；将解冻液2吸出，加入解冻液3，室温下，摇床上孵育；将解冻液3吸出，加入解冻液4，室温下，摇床上孵育。
本发明的创造性手段主要在于溶液的配方，特别是冻存液的配方：即配方是特异性的适用于小鼠心脏组织单细胞测序的冻存和解冻的，同时冻存和解冻的操作过程对溶液能够发挥功效也具有关键的决定作用。此外，由于生物材料的特性，决定了组织冻存和解冻必须遵循本发明中提到的依次进行平衡和渗透的步骤。另外，就小鼠心脏组织单细胞测序而言，本发明中涉及的各溶液的配方以及操作步骤，在本发明之前均未见报道。
步骤(1)中，优选地，所述平衡液包含以下成份(终浓度)：20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
步骤(1)中，所述冻存液包含以下成份(终浓度)：1.5mol/L蔗糖、20％～30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基；优选地，为1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
步骤(1)中，所述成份分别购自：乙二醇(Sigma-Aldrich，V900208)；甘油(Sigma-Aldrich，G5516)；FBS(Thermo Fisher Scientific,10100139C)；蔗糖(Sigma-Aldrich，V900116)；DMEM培养基(ATCC，30-2002)。
步骤(1)中，所述预冷的温度为0～5℃；优选地，为放置冰上预冷。
步骤(2)中，进行DMEM培养基冲洗的目的是将样本上的血液充分洗涤。
步骤(2)中，所述DMEM培养基冲洗的次数为1-3次；优选地，为3次。
步骤(2)中，加入的DMEM培养基用量为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(2)中，所述小鼠心脏组织，为离体后不超过30分钟的组织样本；优选地，为离体后5分钟以内的组织。
步骤(2)中，所述小鼠为0～4周大的小鼠；优选地，为2～3周。
步骤(2)中，所述冰是指制冰机产生的碎冰，装于适当大小的泡沫盒中，离心管插于碎冰内。
步骤(2)中，所述DMEM培养基为事先预冷的，其温度为0～5℃；优选地，为冰上预冷。
步骤(2)中，所述组织块的厚度不超过5mm；优选地，为2～3mm。
步骤(3)中，所述孵育的温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(3)中，所述加平衡液的体积为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(3)中，所述平衡的时间为10～30分钟；优选地，为25分钟。
步骤(3)中，所述摇床的转速为50～100rpm；优选地，为60rpm。
步骤(4)中，所述孵育的温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(4)中，所述加冻存液的体积为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(4)中，所述孵育的时间为10～20分钟；优选地，为15分钟。
步骤(5)中，优选地，液氮中冷冻时间至少为10分钟。
步骤(5)中，优选地，过程中始终保持将冻存管浸泡在液氮中。
步骤(5)中，-80℃冰箱或者液氮罐中保存的时间为1～60天；优选地，为不超过30天。
步骤(6)中，优选地，所述解冻液1包含以下成份(终浓度)：1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
步骤(6)中，优选地，所述解冻液2包含以下成份(终浓度)：0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
步骤(6)中，优选地，所述解冻液3包含以下成份(终浓度)：0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
步骤(6)中，优选地，所述解冻液4包含以下成份(终浓度)：20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
步骤(6)中，所述解冻液1的预热的温度为35～37℃；优选地，为37℃；进一步优选地，解冻液1预热在37℃水浴中进行。
步骤(6)中，所述解冻液1预热的时间为20～30分钟；优选地，为30分钟。
步骤(6)中，所述解冻液2、3、4预热的温度分别为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(6)中，所述解冻液2、3、4预热的时间分别为20～30分钟；优选地，为30分钟。
步骤(7)中，优选地，冻存管置于室温下不超过30秒。
步骤(7)中，加入解冻液1的体积为1～2mL；优选地，为2mL。
步骤(7)中，室温下放置5～10分钟；优选地，为5分钟。
步骤(8)中，加入解冻液1的体积为8～9mL；优选地，为8mL。
步骤(8)中，所述加入解冻液1孵育的温度为35～37℃；优选地，为37℃。
步骤(8)中，所述加入解冻液1孵育的时间为10～20分钟；优选地，为10分钟。
步骤(8)中，所述加入解冻液1摇床的转速为50～100rpm；优选地，为60rpm。
步骤(8)中，加入解冻液2的体积为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(8)中，所述加入解冻液2孵育的温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(8)中，所述加入解冻液2孵育的时间为10～20分钟；优选地，为10分钟。
步骤(8)中，所述加入解冻液2摇床的转速为50～100rpm；优选地，为60rpm。
步骤(8)中，加入解冻液3的体积为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(8)中，所述加入解冻液3孵育的温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(8)中，所述加入解冻液3孵育的时间为10～20分钟；优选地，为10分钟。
步骤(8)中，所述加入解冻液3摇床的转速为50～100rpm；优选地，为60rpm。
步骤(8)中，加入解冻液4的体积为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(8)中，所述加入解冻液4孵育的温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(8)中，所述加入解冻液4孵育的时间为10～20分钟；优选地，为10分钟。
步骤(8)中，所述加入解冻液4摇床的转速为50～100rpm；优选地，为60rpm。
在一个具体的实施方式中，本发明所述方法的具体步骤为：
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，先分别配置平衡液与冻存液。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
将配置好的溶液置于冰上进行预冷。
2)清洗样本。
将新鲜取材的小鼠心脏组织置于15mL离心管中，离心管中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
待组织块自然沉降，将DMEM培养基上清液吸出。加入新的冰上预冷的DMEM培养基对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于DMEM培养基中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
将-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟。
15)解离、镜检、单细胞测序等。
依照解离试剂盒、台盼蓝染色、10x Genomics试剂盒说明书进行操作。
本发明还提供了所述方法在小鼠心脏组织单细胞测序中的应用。
本发明还提供了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的冻存液，所述冻存液由以下组分组成：1.5mol/L蔗糖、20％～30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基；优选地，所述冻存液为30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、1.5mol/L蔗糖、DMEM；或，所述冻存液为20％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、1.5mol/L蔗糖、DMEM。
本发明还提供了所述的冻存液在小鼠心脏组织单细胞测序中的应用。
本发明还提供了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组合试剂，所述组合试剂包括平衡液和如上所述的冻存液；其中，所述平衡液由以下组分组成：20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
本发明还提供了所述的组合试剂在小鼠心脏组织单细胞测序中的应用。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果如下：
第一，填补了目前的技术空白：目前缺少适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冻存方法，阻碍单细胞测序技术的应用。本发明提供的技术方案(包括平衡液、冻存液、解冻液配方，以及相关的冻存和解冻操作)能够解决这一问题，将有力地促进单细胞测序技术在模式动物中的广泛应用。
第二，样本保存过程中转录模式不会发生变化，结果更加准确可靠。本发明提供的技术方案采用瞬时速冻技术，在极短的瞬间将组织样本冷冻，避免了梯度降温过程中因为细胞仍然具有一定活性而造成冻存过程中转录组发生改变。
第三，样本保存过程的操作更加简便，时间大为缩短。现有技术方案需要先将组织解离为单细胞悬液，再进行冻存，由于解离过程较为繁琐，耗时在2小时以上。而本发明提供的技术方案，在40分钟内即可完成组织样本的冻存。避免了进行解离、梯度冻存的复杂操作，大大缩短了时间，提高效率，便于开展大量样本的冻存。
本发明主要克服的技术难点在于：通过对比不同冻存液配方，寻找到适用于小鼠心脏单细胞测序的配方，这一配方的冻存液及相关的平衡液和解冻液，可以有效的保证冻存后组织中的细胞活性，使相关指标达到单细胞测序的要求，保证后续实验的顺利开展。
附图说明
图1是冻存样本细胞活性镜检图。
图2是小鼠新鲜心脏组织单细胞测序与冻存心脏组织单细胞测序细胞聚类对比图。
图3是小鼠新鲜心脏组织单细胞测序与冻存心脏组织单细胞测序细胞类群比例对比图(从上至下分别与右侧1-15对应)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将DMEM培养基分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mLDMEM培养基，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的DMEM培养基中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将DMEM培养基上清液吸出。加入新的经冰上预冷的DMEM培养基对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于DMEM培养基中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离(Miltenyi Biotech，Neonatal Heart Dissociation Kit,mouse and rat，130-098-373)，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。细胞计数采用0.4％的台盼蓝与细胞悬液按1:1混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞个数。光镜下死细胞会被染成蓝色，活细胞为透亮且轮廓清晰的圆(图1)。
17)单细胞测序。
依照10x Genomics公司说明书：Chromium Next GEM Single Cell 3’ReagentKit v3.1，CG000204REV C，进行单细胞测序操作。
结果及分析：
结果显示，通过本发明技术方案，在-80℃冰箱中保存了5周的小鼠心脏组织样本，经解冻步骤后，细胞以台盼蓝进行染色，活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)。单细胞测序结果显示冻存效果良好，细胞类型鉴定结果与新鲜解离组织一致(图2，图3)。
图2左侧为小鼠新鲜心脏组织进行单细胞测序后鉴定到的细胞聚类图，右侧为经本发明技术方案于-80℃冰箱冻存5周的小鼠心脏组织样本的单细胞测序聚类结果。tSNE聚类图可以明显看出新鲜组织和冻存组织的聚类结果相似，二者均能鉴定到15个类群的细胞，说明冻存对细胞转录模式不会产生影响，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
图3左侧为小鼠新鲜心脏组织进行单细胞测序后各类群细胞数量的相对比例，右侧为经本发明技术方案于-80℃冰箱冻存5周的小鼠心脏样本的单细胞测序细胞相对比例结果。图中可以明显看出新鲜组织和冻存组织的细胞比例一致，说明冻存对细胞转录模式不会产生影响，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
实施例2
除了将冻存液中的乙二醇浓度变换为20％(v/v)之外，其余试剂成份、浓度、操作步骤等与实施例1完全一致。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、20％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将DMEM培养基分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mLDMEM培养基，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的DMEM培养基中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将DMEM培养基上清液吸出。加入新的经冰上预冷的DMEM培养基对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于DMEM培养基中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1没有区别(表1)。
对比实施例1
除了将冻存液中的乙二醇浓度变换为10％(v/v)之外，其余试剂成份、浓度、操作步骤等与实施例1完全一致。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、10％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将DMEM培养基分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mLDMEM培养基，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的DMEM培养基中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将DMEM培养基上清液吸出。加入新的经冰上预冷的DMEM培养基对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于DMEM培养基中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例不能达到10x Genomics公司单细胞测要求，无法进行后续单细胞测序(表1)。
对比实施例2
除了将平衡液、冻存液、解冻液1、2、3、4中的DMEM培养基替换为PBS之外，其余试剂成份、浓度、操作步骤等与实施例1完全一致。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于PBS缓冲液中(Corning,Cellgro 21-040-CV)。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将PBS缓冲液分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mL PBS缓冲液，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的PBS缓冲液中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的PBS缓冲液对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将PBS缓冲液上清液吸出。加入新的经冰上预冷的PBS缓冲液对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于PBS缓冲液中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，但活细胞比例不如实施例1中添加DMEM培养基的技术方案(表1)，开展单细胞测序实验有一定风险。
对比实施例3
除了将平衡液及冻存液中的乙二醇分别替换为10％DMSO及20％DMSO之外，其余试剂成份、浓度、操作步骤等与对比实施例2完全一致。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有10％(v/v)DMSO、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、20％(v/v)DMSO、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将PBS缓冲液分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mL PBS缓冲液，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的PBS缓冲液中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的PBS缓冲液对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将PBS缓冲液上清液吸出。加入新的经冰上预冷的PBS缓冲液对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于PBS缓冲液中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度基本能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，但总体效果较实施例1和2中的技术方案低(表1)，开展单细胞测序实验有较高失败风险。
对比实施例4
除了将平衡液及冻存液中的乙二醇替换为丙二醇之外，其余试剂成份、浓度、操作步骤等与对比实施例2完全一致。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)丙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)丙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将PBS缓冲液分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mL PBS缓冲液，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的PBS缓冲液中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的PBS缓冲液对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将PBS缓冲液上清液吸出。加入新的经冰上预冷的PBS缓冲液对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于PBS缓冲液中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度基本能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，但各项指标相比实施例1和2较差(表1)，开展单细胞测序实验有较高失败风险。
对比实施例5
除了将平衡液、冻存液、解冻液1、2、3、4中的FBS去除之外，其余试剂成份、浓度、操作步骤等与对比实施例4完全一致。该方案中平衡液及冻存液配方参考常规小鼠胚胎瞬时冷冻技术所用配方：Cryopreservation ofMammalian Embryos，Methods in MolecularBiology,vol.368:Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols,Second Edition。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)丙二醇、20％(v/v)甘油，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)丙二醇、30％(v/v)甘油，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将PBS缓冲液分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mL PBS缓冲液，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的PBS缓冲液中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的PBS缓冲液对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将PBS缓冲液上清液吸出。加入新的经冰上预冷的PBS缓冲液对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖，将上述成份溶于PBS缓冲液中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖，将上述成份溶于PBS缓冲液中。
解冻液4为PBS缓冲液中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例、细胞结团比例无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表1)，无法开展后续单细胞测序实验。
对比实施例6
采用本发明实施例1的技术方案对小鼠胚胎组织进行冻存。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将DMEM培养基分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mLDMEM培养基，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的DMEM培养基中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将DMEM培养基上清液吸出。加入新的经冰上预冷的DMEM培养基对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于DMEM培养基中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
各项指标基本能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，但相比本发明实施例1和2较低(表1)，开展单细胞测序实验有较高失败风险。
对比实施例7
采用本发明实施例1的技术方案对小鼠皮肤组织进行冻存。
1)配置平衡液及冻存液。
开始取材前，按如下配方成份分别配置平衡液与冻存液，各20mL于50mL离心管中。
平衡液含有20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
冻存液含有1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS，将上述成份溶于DMEM培养基中。
将配置好的平衡液与冻存液置于冰上进行预冷。
将DMEM培养基分装100mL至2个50mL离心管中，置于冰上预冷。
2)清洗样本。
在15mL离心管中加入预冷的10mLDMEM培养基，将离体的小鼠心脏组织立刻投入经预冷的DMEM培养基中。
将离心管置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
3)剪碎样本。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。
4)清洗及自然沉降。
将离心管静置1～2分钟，等待剪碎的组织块自然沉降，将DMEM培养基上清液吸出。加入新的经冰上预冷的DMEM培养基对组织块进行漂洗，重复沉降和弃上清液步骤，共进行3次漂洗，至看不到明显血液残留为止。
5)平衡样本。
向组织块中加入刚配置好的预冷的平衡液，室温25℃下摇床上孵育平衡组织块，摇床转速60rpm，孵育25分钟。
6)冻存液渗透。
将平衡液吸出，加入刚配置好的预冷的冻存液，室温25℃下摇床上孵育渗透组织块，摇床转速60rpm，孵育15分钟。
7)瞬时冷冻。
将离心管中的冻存液吸出，将组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻。冻存管在液氮中至少10分钟，以保证组织完全被冷冻。
8)转移保存。
将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存。转移过程中冻存管应始终浸泡于液氮中，以防止温度变化对组织块造成影响。
9)解冻试剂准备。
开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4四种溶液。
解冻液1含有1.5mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。将配置好的溶液置于37℃水浴中预热30分钟。
解冻液2含有0.75mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液3含有0.25mol/L蔗糖、20％(w/v)FBS，将上述两种成份溶于DMEM培养基中。
解冻液4含有20％(w/v)FBS，溶于DMEM培养基中。
将配置好的解冻液2、3、4置于室温25℃下预热30分钟。
10)取出冻存样本。
根据保存记录找到-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管，将其取出，30秒内打开管盖，加入2mL预热的解冻液1，室温下放置5分钟。
11)解冻液1孵育。
将组织块转移到15mL离心管中，向冻存管中再加入8mL预热的解冻液1，37℃摇床上60rpm孵育10分钟。
12)解冻液2孵育。
将解冻液1吸出，加入10mL预热的解冻液2，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
13)解冻液3孵育。
将解冻液2吸出，加入10mL预热的解冻液3，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
14)解冻液4孵育。
将解冻液3吸出，加入10mL预热的解冻液4，25℃室温下，摇床上60rpm孵育10分钟孵育。
15)组织解离。
将解冻液4吸出，加入组织解离液，依照美天旎公司试剂盒说明书操作步骤进行解离，制备单细胞悬液。
16)细胞活性检测。
通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度。
结果及分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例、细胞浓度均无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表1)。
进一步地，根据本发明表1提供的关于本发明实施例1和2的实验结果，说明本发明所提供的冻存液配方及冻存方法能够满足10x Genomics单细胞测序实验各项质量指标的要求，顺利完成小鼠心脏组织的单细胞测序实验；
为了进一步证实本发明所述的冻存液配方适用于小鼠心脏组织单细胞测序。本发明进行了一系列对比实验，配方及结果如下表1中对比实施例1～7所示。对比实施例1显示10％的乙二醇对细胞活性的保存效果较差，无法达到单细胞测序要求。对比实施例2将DMEM培养基替换为PBS，对细胞活性有一定的影响，活细胞比例较实施例1和2偏低，开展单细胞测序实验有一定风险。对比实施例3及4将乙二醇分别替换为DMSO及丙二醇，结果显示各项指标较实施例1和2明显偏低，开展单细胞测序实验有较高失败风险。对比实施例5，其配方为现有技术中针对胚胎的冻存配方，活细胞比例及结团比例无法满足单细胞测序要求，说明适用于胚胎的冻存配方及冻存方法并不能简单适用于心脏组织。对比实施例6为本发明所述技术方案在小鼠胚胎组织中的应用，结果显示各项指标较实施例1和2偏低，开展单细胞测序实验有较高失败风险。对比实施例7为本发明所述技术方案在小鼠皮肤组织中的应用，结果显示各项指标均无法满足单细胞测序要求。以上对比实验结果表明采用本发明所述的技术方案可以有效的保证小鼠心脏组织冻存后的细胞活性，使相关指标达到单细胞测序的要求，保证后续单细胞测序实验的顺利完成。
此外，本发明用于小鼠心脏组织单细胞测序的方法中用到的平衡液及冻存液之间是一一对应关系的，即，冻存液及平衡液存在配伍关系。如，本发明实施例1提到的平衡液及冻存液，当二者同时、依次序使用，才能有效的保证冻存后的组织能够达到单细胞测序的相关要求。
表1不同冻存液配方冻存效果的比较
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (10)
1.一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）配置平衡液及冻存液：开始取材前，先分别配置平衡液与冻存液，并将配置好的溶液预冷；
其中，所述平衡液包含以下成份：20%乙二醇、20%甘油、20%FBS、DMEM培养基；所述冻存液包含以下成份：1.5mol/L蔗糖、20%~30%乙二醇、30%甘油、20%FBS、DMEM培养基；
（2）制备样本：将小鼠心脏组织置于离心管中，离心管置于冰上并使用DMEM培养基进行漂洗，然后剪碎，再用DMEM培养基进行漂洗，得组织块；
（3）平衡样本：向步骤（2）得到的组织块中加入平衡液，并在摇床上孵育平衡组织块；
（4）冻存液渗透：将平衡液吸出，加入冻存液，然后在摇床上孵育渗透组织块；
（5）瞬时冷冻及转移保存：将冻存液吸出，组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻；然后将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存；
（6）解冻试剂准备：开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4，并分别预热四种解冻液；
其中，所述解冻液1包含以下成份：1.5mol/L蔗糖、20%FBS、DMEM培养基；所述解冻液2包含以下成份：0.75mol/L蔗糖、20%FBS、DMEM培养基；所述解冻液3包含以下成份：0.25mol/L蔗糖、20%FBS、DMEM培养基；所述解冻液4包含以下成份：20%FBS、DMEM培养基；
（7）取出冻存样本：将-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管取出，打开管盖，加入解冻液1，室温下放置；
（8）解冻液孵育：将组织块转移到离心管中，向冻存管中再加入解冻液1，室温下，摇床上孵育；然后将解冻液1吸出，加入解冻液2，室温下，摇床上孵育；将解冻液2吸出，加入解冻液3，室温下，摇床上孵育；将解冻液3吸出，加入解冻液4，室温下，摇床上孵育。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述预冷的温度为0~5℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述加入的DMEM培养基为事先预冷的，温度为0~5℃；和/或，所述DMEM培养基的用量为5~10mL；和/或，所述DMEM培养基冲洗的次数为1-3次；和/或，所述小鼠为0~4周大的小鼠；和/或，所述小鼠心脏组织，为离体后不超过30分钟的组织样本；和/或，所述组织块厚度不超过5mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述孵育的温度为20~25℃；和/或，所述加平衡液的体积为5~10mL；和/或，所述平衡的时间为10~30分钟；和/或，所述摇床的转速为50~100rpm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述孵育的温度为20~25℃；和/或，所述加冻存液的体积为5~10mL；和/或，所述孵育的时间为10~20分钟。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述液氮中冷冻的时间至少为10分钟；和/或，所述冻存管转移过程中始终保持将冻存管浸泡在液氮中；和/或，所述冻存管在-80℃冰箱或者液氮罐中保存时间为1~60天。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述解冻液1预热温度为35~37℃；和/或，所述解冻液1预热时间为20~30分钟；和/或，所述解冻液2、3、4的预热温度分别为20~25℃；和/或，所述解冻液2、3、4的预热时间分别为20~30分钟。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（7）中，所述冻存管置于室温下不超过30秒；和/或，所述加入解冻液1的体积为1~2mL；和/或，所述加入解冻液后室温下放置5~10分钟。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（8）中，所述加入解冻液1的体积为8~9mL；和/或，所述加入解冻液1孵育温度为35~37℃；和/或，所述加入解冻液1孵育时间为10~20分钟；和/或，所述加入解冻液1摇床转速为50~100rpm；和/或，所述加入解冻液2、3、4的体积分别为5~10mL；和/或，所述加入解冻液2、3、4的孵育温度分别为20~25℃；和/或，所述加入解冻液2、3、4的孵育时间分别为10~20分钟；和/或，所述加入解冻液2、3、4的摇床转速分别为50~100rpm。
10.如权利要求1-9之任一项所述的方法在小鼠心脏组织单细胞测序中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202011313130.2A CN112438252B (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法 |
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| 不同冻存液及降温方式对心脏瓣膜组织学及免疫原性的影响;宫妍婕等;《山东大学学报（医学版）》;20160831;第54卷(第8期);第44-54页 * |
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Denomination of invention: A tissue freezing and thawing method suitable for single-cell sequencing of mouse cardiac tissue Effective date of registration: 20220831 Granted publication date: 20210608 Pledgee: Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Xuhui sub branch Pledgor: SHANGHAI OE BIOTECH CO.,LTD. Registration number: Y2022310000222 |
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