CN108641999B - 一种卵巢组织的冻存与复苏方法 - Google Patents

一种卵巢组织的冻存与复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卵巢组织的冻存与复苏方法，包括冻存方法和复苏方法，所述的冻存方法包括以下步骤：(1)预处理：将卵巢组织置于转移液中，去除髓质，保留皮质并切为组织片；(2)渗透平衡：将组织片转移到盛有冻存保护液的样本盒内，置于冰中平衡；(3)冻存：冻存管中加入一定量的冻存保护液，组织块放入冻存管中，然后逐步降温进行液氮冻存。本发明的逐步降温的液氮冻存方法能够减小对卵巢组织的损伤，同时冻存保护液和复苏保护剂配合使用，能够快速高效的冻存卵巢组织，并且能够提高复苏后的卵巢组织活率。

Description

一种卵巢组织的冻存与复苏方法
技术领域
本发明属于卵巢组织冷冻保存领域，具体地说，涉及一种卵巢组织的冻存与复苏方法，同时涉及冻存保护液和复苏液。
背景技术
中国每年新发癌症患者430万左右，而癌症患者五年存活率可以高达80-90％以上，70％以上的存活者有迫切的生育需求，但放化疗在挽救癌症患者生命的同时，却导致了70％-100％卵巢功能的损害，使其丧失生育能力，极大地影响患者的身心健康和家庭幸福；由于卵巢功能的极早衰退，导致患者各种慢性病如心血管疾病、糖尿病、骨质疏松、早老性痴呆及早死率明显增高，增加国家巨大的医疗负担。因此，在放化疗前对卵巢功能进行保护非常重要。
目前对生殖力保护的方法有几种：卵子冻存、胚胎冻存和卵巢组织冻存。胚胎冻存为试管婴儿的常规技术，卵子冻存，目前中国限于不孕不育IVF患者取精失败或卵巢过度刺激放弃周期的患者，不适用于青春期前女孩及大多急需放化疗的癌症患者，有很大的局限性。
而卵巢组织冻存与再移植技术是目前国际上最新的、最有前景的生殖力保护方法。在放化疗前取部分卵巢组织经特殊处理冻存起来，待其临床痊愈后移植回体内，不仅可以恢复患者的生育能力，还可以恢复其卵巢的内分泌功能，也是抗衰老的热点话题。在欧美发达国家，卵巢组织冻存与再移植技术已作为常规生殖力保护技术应用了十余年，而在我国尚无活产报道。
为了保证卵巢组织再移植回所有者体内后的活性，卵巢组织的冻存和复苏的试剂和方法至关重要。卵巢组织的冻存和复苏液和方法直接影响再移植后的活性，因此，需要提供一种能够适宜卵巢组织冻存、复苏，提高卵巢组织再移植活性的试剂及其方法。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种卵巢组织的冻存与复苏方法。本发明的冻存与复苏方法能够快速高效的冻存卵巢组织，减小对卵巢组织的损伤；同时配合相应的冻存保护液和复苏保护液，能够进一步提高复苏后的卵巢组织的活性。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明提供一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其中，包括冻存方法，所述的冻存方法包括以下步骤：
(1)预处理：将卵巢组织置于转移液中，去除髓质，保留皮质并切为组织片；
(2)渗透平衡：将组织片转移到盛有冻存保护液的样本盒内，置于冰中平衡；
(3)冻存：冻存管中加入一定量的冻存保护液，组织块放入冻存管中，然后逐步降温进行液氮冻存。
进一步的方案，冻存方法中，所述的逐步降温进行液氮冻存的过程包括：
(1)2℃平衡，维持15min；(2)以6℃/min的速度降至-2℃；(3)以4℃/min的速度降至-4℃；(4)以2℃/min的速度降至-7.5℃；(5)以0.5℃/min的速度降至-8℃；(6)以0.5℃/min的速度降至-11.5℃；(7)以0.1℃/min的速度降至-13℃；(8)以0.3℃/min的速度降至-42℃；(9)以50℃/min的速度降至-100℃。
本发明的卵巢组织的冻存方法中采用的逐步降温进行液氮冻存的过程，分为九级，各阶段以特定的速率进行降温。在降温冻存、复苏过程中，卵巢细胞的膜结构会因物质相变原因受到不同程度的溶质、冰晶损伤。本申请的降温冻存过程多级变化，在不同的降温阶段采用适宜的降温速度，能够缓慢的逐渐形成非常细小的冰晶，同时保证冻存管内各处结晶的均匀性，能够起到非常好的保护细胞膜结构的效果。具体的：
步骤(1)中，冻存管首先在2℃维持15min，以结束平衡时间，冻存管中溶液和组织块达到较为稳定的状态。接下来降温到植冰点的温度过程中，本申请采用了梯度逐渐降温的方式。首先以6℃/min的速度降至-2℃，在2℃降至-2℃的过程中，由于冻存保护液的成分和浓度的原因，达不到结晶条件，可以以较大的速度较快地降温，对卵巢组织基本没有影响。接下来，再以4℃/min的速度降至-4℃；以2℃/min的速度降至-7.5℃；降温速度越来越慢，基本等梯度慢速降温，避免冻存管内部产生晶核而局部快速结晶，使冻存管中仍然保持溶液状态，等待均匀结晶。而温度到达-7.5℃后，由-7.5℃降至-8℃过程中，以0.5℃/min的速度降至-8℃，降温速率极小，以保证能够精确达到植冰点的温度，保证接种结晶(seeding)时的精确温度。在-8℃时，冻存管中的溶液达到结晶的临界点，引晶后能够达到均匀结晶的效果。结晶后继续降温，-8℃到-11,5℃过程中，以0.5℃/min的速度降温能够使冻存管内各处晶核分布均匀，避免形成局部不均匀现象，避免造成卵巢组织的损坏。而-11.5℃到-13℃的过程中，进一步减小降温速率，冰晶接种后能够尽可能地形成均匀、细小的冰晶，尽可能减小对卵巢组织的损害，同时可有利于复苏过程中的快速溶解，有利于提高卵巢组织复苏后的活性。
如此，能够快速高效的冻存卵巢组织，减小对卵巢组织的损伤；同时配合相应的冻存保护液和复苏保护液，能够进一步提高复苏后的卵巢组织的活性。
另外，本申请的冻存保护液中除了Leibovitz L-15培养基，10V/V％DMSO，1V/V％HAS或10V/V％SSS，还含有牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸氨酸、维生素E以及维生素C，能够起到保护细胞膜结构的作用，形成的冻存保护液也更加适于在-8℃时达到临界温度，在该温度下能够达到临界状态，引晶时有利于快速形成结晶。
如此，能够快速高效的冻存卵巢组织，减小对卵巢组织的损伤；同时配合相应的冻存保护液和复苏保护液，能够进一步提高复苏后的卵巢组织的活性。
进一步的，卵巢组织取自不活跃的卵巢，而不是取自带有黄体素液的区域。因为那部分皮质的卵泡密度低且薄弱的组织易于破裂不利于后续工作。
进一步的方案，逐步降温进行液氮冻存的过程中，温度降至-8℃时达到植冰点，此时蘸取液氮置于冻存管壁的液面处，结晶启动。
进一步的方案，冻存方法中，卵巢组织的皮质剪切成4±0.5mm×8±0.6mm×1±0.2mm。
进一步的方案，冻存方法中，所述的冻存保护液包括Leibovitz L-15培养基，8-10V/V％DMSO以及0.5-1.0V/V％HSA或8-10V/V％SSS。
进一步的方案，所述的冻存保护液还包括牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸和维生素E中的至少一种，其中，牛磺酸的含量为0.5-5mM，氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM，维生素E的含量为0.1-10mM；
优选的，牛磺酸的含量为5mM，氮乙酰半胱氨酸的含量为5mM，维生素E的含量为3-5mM。
本发明提供的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，还包括复苏方法，所述的复苏方法包括以下步骤：
(1)将装有卵巢组织的冻存管从液氮中取出，溶解；
(2)将卵巢组织从冻存管中取出，依次加入复苏液1、复苏液2、复苏液3的溶液中分别保持一定时间，再放入洗脱液中洗脱，完成复苏。
进一步的方案，复苏方法中，复苏液1、复苏液2、复苏液3分别为：
(1)复苏液1：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.5-0.8mol/L蔗糖；
(2)复苏液2：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.3-0.5mol/L蔗糖；
(3)复苏液3：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.12-0.3mol/L蔗糖。
进一步的方案，复苏液1、复苏液2和复苏液3中还包括牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E中的至少一种；所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；所述的氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM；
优选的，氮乙酰半胱氨酸的含量为3-5mM，维生素E的含量为3-7mM；
更优选的，氮乙酰半胱氨酸的含量为5mM，维生素E的含量为5mM。
进一步的方案，卵巢组织在复苏液1、复苏液2和复苏液3中保持的时间依次降低；
优选的，卵巢组织在复苏液1、复苏液2、复苏液3中保持的时间分别为15min。
进一步的方案，所述的洗脱液包括90V/V％DPBS，10V/V％HSA；从复苏液3中取出的卵巢组织在洗脱液中清洗两次，依次在洗脱液中分别保持10min和5min。
进一步的方案，洗脱液还包括牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E中的至少一种；所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；所述的氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM。
本发明的第二目的是提供一种卵巢组织的冻存保护与复苏液，包括冻存保护液，所述的冻存保护液包括Leibovitz L-15培养基，8-10V/V％DMSO以及0.5-1.0V/V％HSA或8-10V/V％SSS。
本发明提供的卵巢组织的冻存保护液能够很好的冷冻保存生殖力。冻存保护液中成分简单明确，除了目前尚无法替代的渗透性保护液二甲基亚砜(DMSO)以及基础培养基Leibovitz L-15培养基，还含有SSS或者HSA。
进一步的方案，所述的冻存保护液包括Leibovitz L-15培养基，10V/V％DMSO，1V/V％HSA，
或者冻存保护液包括Leibovitz L-15培养基，10V/V％DMSO，10V/V％SSS。
进一步的方案，所述的冻存保护液还包括牛磺酸，所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；
优选的，牛磺酸的含量为3-5mM；更优选的，牛磺酸的含量为5mM。
牛磺酸添加到冻存保护液中，能够保持膜结构的稳定性、调节渗透压、调节细胞内钙离子水平，有利于保持超低温下卵巢组织的活性，有利于提高复苏后的卵巢组织的活率。
进一步的方案，所述的冻存保护液还包括氮乙酰半胱氨酸，所述的氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM；
优选的，氮乙酰半胱氨酸的含量为3-5mM；更优选的，氮乙酰半胱氨酸的含量为5mM。
氮乙酰半胱氨酸，也就是NAC可以作为一种抗氧化剂，一是能够清除游离环境中的羟自由基、过氧化氢以及次氯酸，能够改善细胞的微环境。同时，氮乙酰半胱氨酸还可以被转变为半胱氨酸，稳定细胞膜及膜内相结构。在使用时，氮乙酰半胱氨酸可以与牛磺酸协同作用，不仅改善微环境，还能够增加对温度降低的耐受性，保护细胞，提高复苏后的细胞活率。
进一步的方案，所述的冻存保护液还包括维生素E，所述的维生素E的含量为0.1-10mM；
优选的，维生素E的含量为3-7mM；更优选的，维生素E的含量为5mM。
维生素E单独使用或者分别与氮乙酰半胱氨酸和牛磺酸配合使用，能够提高细胞活率，促进生长，进而可提高其生产效力，增加培养基稳定性，最大程度降低有毒性氨的聚集，减少细胞毒性而对细胞生长有利。
进一步的方案，所述的冻存保护液还包括维生素C，所述的维生素C的含量为0.5-2.0mM；
优选的，维生素C的含量为2.0M。
本发明的一种卵巢组织的冻存保护与复苏液，还包括复苏液，所述的复苏液包括：80-90V/V％DPBS，10-20V/V％HSA和0.13mol/L-0.8mol/L蔗糖。
进一步的方案，所述的复苏液还包括牛磺酸，所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；
优选的，牛磺酸的含量为3-5mM；更优选的，牛磺酸的含量为5mM。
进一步的方案，所述的冻存保护液还包括氮乙酰半胱氨酸、维生素E中的至少一种；所述的氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM；
优选的，氮乙酰半胱氨酸的含量为3-5mM，维生素E的含量为3-7mM；
更优选的，氮乙酰半胱氨酸的含量为5mM，维生素E的含量为5mM。
进一步的方案，所述的复苏液还包括维生素C，所述的维生素C的含量为0.5-2.0mM；
优选的，维生素C的含量为2.0M。
进一步的方案，所述的复苏液包括：
(1)复苏液1：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.5-0.8mol/L蔗糖；
(2)复苏液2：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.3-0.5mol/L蔗糖；
(3)复苏液3：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.12-0.3mol/L蔗糖；
优选的，所述的复苏液包括：
(1)复苏液1：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.75mol/L蔗糖；
(2)复苏液2：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.375mol/L蔗糖；
(3)复苏液3：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，0.125mol/L蔗糖。
进一步的方案，所述的复苏液包括：
(1)复苏液1：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，5mM氮乙酰半胱氨酸和/或5mM牛磺酸和/或5mM维生素E，0.5-0.8mol/L蔗糖；
(2)复苏液2：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，5mM氮乙酰半胱氨酸和/或5mM牛磺酸和/或5mM维生素E，0.3-0.5mol/L蔗糖；
(3)复苏液3：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，5mM氮乙酰半胱氨酸和/或5mM牛磺酸和/或5mM维生素E，0.13-0.3mol/L蔗糖；
优选的，所述的复苏液包括：
(1)复苏液1：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，5mM氮乙酰半胱氨酸，0.75mol/L蔗糖；
(2)复苏液2：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，5mM氮乙酰半胱氨酸，0.375mol/L蔗糖；
(3)复苏液3：90V/V％DPBS，10V/V％HSA，5mM氮乙酰半胱氨酸，0.125mol/L蔗糖。
优选的，复苏液3中还包括维生素C，维生素C的含量为0.5mM。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明的卵巢组织的冻存方法中采用的逐步降温进行液氮冻存的过程，分为九级，各阶段以特定的速率进行降温。在温度降至-7.5℃之前，以较大的降温速率进行降温，此时低温程度相对不高，对卵巢组织的影响较小。-7.5℃降至-8℃时，以极小降温速率缓慢降低，能够精确达到植冰点的温度，保证结晶(seeding)时的精确温度。结晶完毕后，再以更小的降温速率降至-42℃，保证卵巢组织的损伤降至最小。-42℃后，卵巢组织的活性基本稳定，再快速降温至-100℃，在保证卵巢组织活性的前提下，大幅提高冻存效率，避免外界对卵巢组织的影响。如此，能够快速高效的冻存卵巢组织，减小对卵巢组织的损伤；同时配合相应的冻存保护液和复苏保护液，能够进一步提高复苏后的卵巢组织的活性。
2、本发明提供的卵巢组织的冻存保护液和复苏液能够使卵巢组织冻存、复苏的活率达到85％以上；能够很好的冷冻保存生殖力。冻存保护液中成分简单明确，除了目前尚无法替代的渗透性保护剂二甲基亚砜(DMSO)以及基础培养基Leibovitz L-15培养基，还含有SSS或者HSA。
3、本发明中的冻存保护液还包括有牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸和维生素E中的至少一种，能够提高抗氧化能力，相应的，复苏液中也添加相同的成分，冻存保护液与复苏液可以起到协同作用，进一步提高了冻存复苏后卵巢细胞的活率。
4、本发明复苏方法中，采用3种复苏液，2次洗脱液洗脱，梯度化降低糖类的浓度，复苏效果更加优化。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是本发明试验例1中卵巢组织活性检测的显微镜下观察的细胞图；
其中，图A1、B1、C1、D1和E1均为在Calcein-AM染色后荧光显微镜下的观察结果；A2、B2、C2、D2和E2均为同一视野下在普通光镜的观察结果，A1和A2为对照组，B1和B2为试验组2，C1和C2为试验组3，D1和D2为试验组1，E1和E2为试验组4；
图2是本发明试验例2中基质细胞凋亡试验的显微镜下观察的细胞图；
其中，左图a1-e1中为凋亡的基质细胞，中图a2-e2中为未凋亡的基质细胞，右图a3-e3为左图和中图的叠加。以上图片均为同一视野，放大倍数×400；
图a1和a2为对照组，图b1和b2为试验组2，图c1和c2为试验组3，图d1和d2为试验组1(NAC 5mM)，图e1和e2为试验组4；
图3是本发明试验例3中卵巢组织的活性氧水平比较图；
图4是本发明试验例4中卵巢组织的总抗氧化能力水平比较图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1-6卵巢组织冻存保护液的制备
以100ml冻存保护液的制备为例：分别按照表1中的各成分的量，量取LeibovitzL-15培养基、DMSO、HSA、SSS加入到试剂瓶内，轻摇混匀，用0.22um滤器过滤除菌，过滤纸经过高压灭菌的试剂瓶内，4℃保存备用，或者-20℃冻存，使用时移至4℃冰箱备用。
表1冻存保护液的成分1
Figure BDA0001608509670000081
实施例7-17卵巢组织冻存保护液的制备
以100ml冻存保护液的制备为例：分别按照表2中的各成分的量，量取LeibovitzL-15培养基、DMSO、HSA、SSS加入到试剂瓶内，轻摇混匀，然后加入相应量的牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E、维生素C。待固体完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌，过滤纸经过高压灭菌的试剂瓶内，4℃保存备用，或者-20℃冻存，使用时移至4℃冰箱备用。
表2冻存保护液的成分2
Figure BDA0001608509670000082
Figure BDA0001608509670000091
实施例18-20卵巢组织复苏液的制备
以100ml冻存保护液的制备为例：分别按照表2中的各成分的量，量取LeibovitzL-15培养基、DMSO、HSA、SSS加入到试剂瓶内，轻摇混匀，或者再加入相应量的牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E、维生素C。待固体完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌，过滤纸经过高压灭菌的试剂瓶内，4℃保存备用，或者-20℃冻存，使用时移至4℃冰箱备用。
表3复苏液的成分
Figure BDA0001608509670000092
Figure BDA0001608509670000101
实施例28卵巢组织的冻存方法
1、材料准备：镊子，解剖刀，刀柄，Punch，1.8ml冻存管，冻存管盖，大培养皿，110ml样本盒，冻存液，转移液，冰板，泡沫盒，冻存管架，1000微升加样枪，100微升枪头，四孔培养板，培养液(AIM-V)；其中，转移液可以为custodiol；
另外，冻存液可以为实施例1-26中任一种方案的冻存液，优选采用实施例1、2、4以及实施例7-13，实施例17的方案，优选的，采用是实施例7或实施例8或实施例9的方案。
2、准备工作
(1)准备冻存管；镊子，刀柄，持针器消毒；Punch，1.8ml冻存管，冻存管盖，大培养皿，110ml样本盒，1000微升加样枪，100微升枪头等均放入超净工作台，紫外线消毒。
(2)操作冰板、冻存液由-20度移至+4℃冰箱备用，转移液2份。
(3)CO2箱：4孔培养板加600ul AIM-V培养液(无血清细胞培养基)；DPBS(可保存28天)。
3、卵巢组织处理
1)泡沫盒装冰，将冻存液、冻存管架、转移液插入冰中，一旁待用。
2)4℃冰板消毒后放入超净工作台。
3)将2个培养皿打开，置于冰板上，右侧培养皿加入一份转移液，两个培养皿盖中各加半份转移液。
4)将镊子、解剖刀、Punch准备好，放在右上方培养皿盖子中。
5)取出组织样本盒，将组织与转移液一同倒入左侧培养皿中。
6)更换无菌手套。
7)初步处理组织，去除髓质，注意保护皮质的完整及湿润。将初步处理好的皮质移到右侧培养皿中。
8)将皮质尽可能多的切为4*8*1mm的组织片。
9)取110ml样本盒，加入约7ml冻存液，覆盖盒底即可。将切好的组织放入样本盒，插入冰中，充分平衡。
10)在每个冻存管中加入1.7ml冻存液，置于冻存管架，插入冷却盒中预冷。
12)提前5分钟转移组织：快速把组织放入对应的冻存管。冻存管直接插入泡沫盒冰中，然后准备液氮冻存。
4、组织冻存
(1)2℃平衡，维持15min；(2)以6℃/min的速度降至-2℃；(3)以4℃/min的速度降至-4℃；(4)以2℃/min的速度降至-7.5℃；(5)以0.5℃/min的速度降至-8℃；(6)以0.5℃/min的速度降至-11.5℃；(7)以0.1℃/min的速度降至-13℃；(8)以0.3℃/min的速度降至-42℃；(9)以50℃/min的速度降至-100℃。
其中，温度达到-8℃时，达到植冰点(seeding)，取少量液氮，用长棉签蘸取液氮置于冻存管壁的液面处，可见结晶启动。Seeding从最下面的冻存管开始，两个长棉签交替使用。Seeding后温度稍有上升，表示成功。
温度降到-100℃以下后，用长镊快速将冻存管移入液氮中保存。
实施例29卵巢组织的复苏方法
1、6孔培养板上标明1、2、3、W1、W2，细胞滤网置于1号孔中，注射器抽取复苏液1、复苏液2、复苏液3，依次分别加入对应的孔中，洗脱液加入W1、W2中。
其中，作为优选的方案，复苏液与冻存保护液配合使用；复苏液与冻存保护液的额外的添加成分基本保持一致。
例如，当使用实施例1-6中的冻存保护液时，复苏液采用实施例18的复苏液；当使用实施例7的冻存保护液时，采用实施例19的复苏液；当使用实施例8的冻存保护液时，采用实施例21的复苏液；当使用实施例9的冻存保护液时，采用实施例22的复苏液；当使用实施例10的冻存保护液时，采用实施例20的复苏液；当使用实施例11的冻存保护液时，采用实施例23的复苏液；当使用实施例13的冻存保护液时，采用实施例24的复苏液。
2、打开水浴箱，目标温度37℃；
3、泡沫盒中倒取液氮，将夹取需要的冻存管置于液氮中；
4、待水浴箱温度达到37度，夹出冻存管，放入110ml样本盒于室温溶解30秒，后放入水浴箱，用镊子保持其浸入水中约2分钟，拧开冻存管将组织倒入培养皿，再用镊子夹入1号孔。
6、此后开始计时，1、2、3号孔分别为15分钟，W1为10分钟，W2为5分钟。应及时用镊子夹取细胞滤网更换组织所在培养孔。
7、冻融及洗涤完毕后，用于移植的组织用于移植或活性检测。若用于检测活性，则将组织放入事先备好的AIM-V培养液中，及时消化、检测活性。
试验例1卵巢组织活性检测
卵巢组织活性检测的方法采用Calcein-AM染色法，在荧光显微镜下观察卵巢细胞和在同一视野下用普通光镜观察卵巢细胞情况并进行统计。
其中，对照组采用实施例1的冻存保护液，实施例18的复苏液，也就是不添加氮乙酰半胱氨酸(NAC)，采用实施例28的冻存方法和实施例29的复苏方法，对卵巢组织进行冻存和复苏，然后进行活性检测。试验组采用实施例8的冻存保护液、实施例21的复苏液，也就是采用添加了氮乙酰半胱氨酸的冻存保护液和复苏液，利用实施例28的冻存方法和实施例29的复苏方法，对卵巢组织进行冻存和复苏，然后进行活性检测。
其中，试验组包括试验组1-试验组4，试验组1-4的区别在于氮乙酰半胱氨酸(NAC)的浓度的不同，其它组分及含量均相同。具体的，试验组1中冻存保护液和复苏液中氮乙酰半胱氨酸(NAC)的浓度均为0.5mM，试验组2中氮乙酰半胱氨酸(NAC)的浓度均为1mM；试验组3中氮乙酰半胱氨酸(NAC)的浓度均为5mM；试验组4中氮乙酰半胱氨酸(NAC)的浓度均为25mM。
结果如图1中所示，其中图A1、B1、C1、D1和E1均为在Calcein-AM染色后荧光显微镜下的观察结果；A2、B2、C2、D2和E2均为同一视野下在普通光镜的观察结果，放大倍数×200。其中图A1和A2为对照组结果，即不含有NAC；图B1和B2为试验组2结果，NAC浓度均为0.5mM；图C1和C2为试验组3结果，即NAC浓度均为1.0Mm；图D1和D2为试验组1结果，即NAC浓度均为5mM；图E1和E2为试验组4结果，即NAC浓度均为25mM。由以上结果可以看出，对照组的冻存保护液和复苏液能够保持卵泡的活性，视野中活细胞数量较多；而添加了不同浓度的NAC的试验组中，试验组1-试验3的视野中活细胞数量稍有增加，能够保持卵泡的活性；而试验组4的卵泡活性最低，经统计学分析p<0.05，有显著差异，具有统计学意义。因此，本申请含有浓度0.5-5mM的NAC的冻存保护液和复苏液能够提高冻存复苏过程中卵泡的活性。
试验例2基质细胞凋亡试验
采用常用的检测基质细胞凋亡的试验方法来检测卵巢组织基质细胞的活细胞和死细胞，进行统计分析。另外，本试验例的对照组、试验组1-4均与试验例1中相同。
本试验例中基质细胞凋亡的检测结果如图2所示，其中，左图a1-e1中绿色的为凋亡的基质细胞(由于附图中为黑白色，颜色发白的为凋亡的基质细胞)；中图a2-e2中蓝色为未凋亡的基质细胞(由于附图中为黑白色，颜色浅的点状为未凋亡的基质细胞)；右图a3-e3为左图和中图的叠加。以上图片均为同一视野，放大倍数×400。
其中，图a1和a2为对照组，不含有NAC，图b1和b2为试验组1(NAC 0.1mM)，图c1和c2为试验组2(NAC 1mM)，图d1和d2为试验组3(NAC 5mM)，图e1和e2为试验组4(NAC 25mM)。对照组大部分基质细胞凋亡，试验组1-试验组3中与对照组的细胞凋亡差别不大，但略高。具体的，试验组和试验组的凋亡率用中位数和四分位数间距(％)表示为：对照组-NAC 0mM:2.721(1.103,6.308)；试验组1-NAC 0.5mM:2.737(1.969,8.986)；试验组2-NAC 1mM:2.222(1.575,7.528)；试验组3-NAC 5mM:2.621(1.477,6.060)；试验组4-NAC 25mM:0.043(0.000,2.588)。试验组4的基质细胞凋亡数最低。
试验例3活性氧水平试验
具体的活性氧水平试验(Reactive oxygen species(ROS)level)按照以下方法进行：
试验器材：组织破碎仪、离心机、移液器、多功能读板仪、96孔板
试验试剂：Tris-Hcl、DCHF-DA、BCA蛋白定量试剂盒
试验步骤：
1、本试验例的对照组、试验组1-4均与试验例1中相同。
2、卵巢组织裂解：每个组织片加入200ul蛋白提取液(50mM Tris-HCl at pH7.5)。样本至于冰上用组织破碎仪高速匀浆15S(匀浆5S，停5S)。4℃条件下3000g离心10min，分离上清液待测。
3、DCHF-DA溶液配制：DMSO溶解DCHF-DA到终浓度10mM，储存备用。
4、ROS检测：取20ul的组织裂解液加20ul稀释的DCHF-DA(50mM Tris-HCl稀释到0.5mM)，混匀后加入96孔板中室温避光保存30分钟。
5、信号检测：Molecular Device的M2多功能读板仪检测480激发/520发射荧光信号，得到Ex480/Em520数值。
6、蛋白浓度测定：
1)BCA标准品稀释
表4 BCA标准品稀释各组浓度
Figure BDA0001608509670000141
2)在96孔板中分别加入上述标准品稀释液25ul和蛋白稀释液25ul。
3)根据样品数量(每孔200ul)量配制工作液：50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
4)把3中配制好的工作液体加到96孔板中混匀，37℃孵育30分钟。
5)读取562nM吸光值，以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
6)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg)，除以样品稀释液总体积(100μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。
7、计算ROS：Ex480/Em520/蛋白浓度。
结果如图3所示，图中横坐标分别代表各对照组和试验组的冻存保护液和复苏液中氮乙酰半胱氨酸的浓度。由图中可以看出，与对照组(control组)、试验组1(NAC 0.5mM)、和试验组2(NAC 1mM)相比，试验组3(NAC 5mM)的活性氧水平(ROS水平)显著降低，经统计学分析，p<0.05，具有统计学意义。与试验组4(NAC 25mM)相比，ROS水平也有所降低，p＞0.05，说明加入氮乙酰半胱氨酸可有效降低人卵巢组织冻存/复苏后的活性氧水平。
试验例4总抗氧化能力水平
具体的总抗氧化能力水平试验(Reactive oxygen species(ROS)level)按照以下方法进行：
试验器材：组织破碎仪、离心机、移液器、多功能读板仪、96孔板
试验试剂：Tris-Hcl、ABTS、potassium persulphate、Trolox、BCA蛋白定量试剂盒；
试验步骤：
1、本试验例的对照组、试验组1-4均与试验例1中相同。
2、卵巢组织裂解：每个组织片加入200ul蛋白提取液(50mM Tris-HCl at pH7.5)。样本至于冰上用组织破碎仪高速匀浆15S(匀浆5S，停5S)。4℃条件下3000g离心10min，分离上清液待测。
3、ABTS溶液配制：19.5mgABTS+3.3mg potassium persulphate+7ml 0.1mol/LPBS(PH7.4).室温避光放置12小时。
4、TAC检测：PBS稀释(ABTS与PBS的比例大概为1:80)上述溶液使其734nM吸光值到1.0。取透明96孔板，每孔加15ul组织裂解液+200ul ABTS溶液混匀，测定734nM吸光值三分钟。
5、信号检测：Molecular Device的M2多功能读板仪检测734nM吸光值。
6、蛋白浓度测定：方法同试验例3中的蛋白浓度测定方法。
7、计算TAC水平：734nM/蛋白浓度
结果如图4所示，图中横坐标分别代表各对照组和试验组的冻存保护液和复苏液中氮乙酰半胱氨酸的浓度。由图中可以看出，与对照组(control组)、试验组2(NAC 1mM)和试验组4(NAC 25mM)相比，试验组3(NAC 5mM)的总抗氧化能力(TAC水平)显著提高，经统计学分析，p<0.05，具有统计学意义。与试验组1(NAC 0.5mM)相比，TAC水平也有所提高，p＞0.05，说明冻存保护液和复苏液中加入氮乙酰半胱氨酸可有效提升卵巢组织冻存/复苏后的抗氧化能力。
由试验例3和试验例4可以看出，在实施例的对照组的冻存保护液和复苏液的基础上，加入浓度为5mM的氮乙酰半胱氨酸，可有效降低人卵巢组织冻存/复苏后的活性氧水平，提升抗氧化能力。
试验例5
采用试验例1-4的方法对采用其他成分的冻存保护液和复苏液进行冻存、复苏卵巢组织，分别检测各项参数，具体结果如下：
对照组：冻存保护液-实施例1+复苏液-实施例18
组1：冻存保护液-实施例7+复苏液-实施例19
组2：冻存保护液-实施例8+复苏液-实施例21
组3：冻存保护液-实施例9+复苏液-实施例22
组4：冻存保护液-实施例10+复苏液-实施例20
组5：冻存保护液-实施例11+复苏液-实施例23
组6：冻存保护液-实施例12+复苏液-实施例24
组7：冻存保护液-实施例14+复苏液-实施例25
组8：冻存保护液-实施例16+复苏液-实施例26
组9：冻存保护液-实施例17+复苏液-实施例27
表5采用不同冻存保护液和复苏液进行冻存、复苏卵巢组织后的各项参数
活性卵泡计数(个) 基质细胞凋亡率％ ROS水平 TAC水平uM
对照组 27 0.117 4700 0.13
组1 24 0.290 2600 0.18
组2 15 0 2700 0.18
组3 40 0.807 2800 0.19
组4 35 0.399 2500 0.21
组5 36 0.386 2400 0.22
组6 22 0.062 2500 0.21
组7 56 0 2300 0.23
组8 23 0 2000 0.24
组9 17 0.693 2100 0.24
由上表可以看出，本发明的冻存保护液、复苏液配合冻存方法和复苏方法，能够快速高效的冻存卵巢组织，并且能够提高复苏后的卵巢组织活率及氧化环境。其中，分别添加了牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E的冻存保护液、复苏液能够显著改善卵巢组织的氧化环境，提高抗氧化能力，同时也能够提高卵巢组织活率。以上三种成分任意组合添加后，能够起到协同作用，进一步降低ROS水平，提高TAC水平。另外，在添加以上成分的基础上，再进一步添加维生素C，也能够起到协同作用，进一步降低ROS水平，提高TAC水平。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (8)

1.一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，包括冻存方法，所述的冻存方法包括以下步骤：
（1）预处理：将卵巢组织置于转移液中，去除髓质，保留皮质并切为组织片；
（2）渗透平衡：将组织片转移到盛有冻存保护液的样本盒内，置于冰中平衡；
（3）冻存：冻存管中加入一定量的冻存保护液，组织块放入冻存管中，然后逐步降温进行液氮冻存；
冻存方法中，所述的逐步降温进行液氮冻存的过程包括：
（1）2℃平衡，维持15min；（2）以6℃/min的速度降至-2℃；（3）以4℃/min的速度降至-4℃；（4）以2℃/min的速度降至-7.5℃；（5）以0.5℃/min的速度降至-8℃；（6）以0.5℃/min的速度降至-11.5℃；（7）以0.1℃/min的速度降至-13℃；（8）以0.3℃/min的速度降至-42℃；（9）以50℃/min的速度降至-100℃；逐步降温进行液氮冻存的过程中，温度降至-8℃时达到植冰点，此时蘸取液氮置于冻存管壁的液面处，结晶启动；
冻存方法中，所述的冻存保护液包括Leibovitz L-15培养基，8-10 V/V%DMSO以及0.5-1.0 V/V%HSA或8-10 V/V% SSS，5mM的氮乙酰半胱氨酸；
还包括复苏方法，所述的复苏方法包括以下步骤：
（1）将装有卵巢组织的冻存管从液氮中取出，溶解；
（2）将卵巢组织从冻存管中取出，依次加入复苏液1、复苏液2、复苏液3的溶液中分别保持一定时间，再放入洗脱液中洗脱，完成复苏；
所述的复苏液1、复苏液2、复苏液3分别为：
（1）复苏液1：90V/V%DPBS，10V/V%HSA，0.5-0.8mol/L蔗糖，5mM氮乙酰半胱氨酸；
（2）复苏液2：90V/V%DPBS，10V/V%HSA，0.3-0.5mol/L蔗糖，5mM氮乙酰半胱氨酸；
（3）复苏液3：90V/V%DPBS，10V/V%HSA，0.12-0.3mol/L蔗糖，5mM氮乙酰半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，所述的冻存保护液还包括牛磺酸和维生素E中的至少一种，其中，牛磺酸的含量为0.5-5mM，维生素E的含量为0.1-10mM。
3.根据权利要求2所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，牛磺酸的含量为5mM，维生素E的含量为3-5mM。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，复苏液1、复苏液2和复苏液3中还包括牛磺酸和维生素E中的至少一种；所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM。
5.根据权利要求4所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，维生素E的含量为3-7mM。
6.根据权利要求5所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，维生素E的含量为5mM。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，所述的洗脱液包括90V/V%DPBS，10V/V%HSA；从复苏液3中取出的卵巢组织在洗脱液中清洗两次，依次在洗脱液中分别保持10min和5min。
8.根据权利要求7所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，洗脱液还包括牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E中的至少一种；所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；所述的氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM。
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