CN201222947Y - 针刺式组织片玻璃化冷冻载体 - Google Patents
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Abstract
一种针刺式组织片玻璃化冷冻载体，由冻存管和针刺装置组成，所述针刺装置包括针头和安装在针头上的用于穿组织片的针；组合后，针位于冻存管内，针头为冻存管的管塞将冻存管开口端封闭。使用本实用新型所述载体，可将多个组织片(如卵巢组织片、肝脏组织片)相隔有间距地穿在针上串成一排进行玻璃化冷冻的各项操作和储存，因而可将组织片表面附着的冷冻保护剂体积降至最低，有效提高降温速率和降低冷冻保护剂的毒性，在多样本组织同时进行玻璃化冷冻时，操作简单、高效，可使各样本以同样的条件脱水和冷冻。
Description
技术领域
本实用新型属于玻璃化冷冻保存领域，特别涉及卵巢、肝脏等器官或组织的玻璃化冷冻载体。
背景技术
玻璃化冷冻法是近年提出的超快速冷冻方法，比程序化冷冻耗时短，方便廉价，无冰晶损伤。但玻璃化冷冻存在的缺点是：所需冷冻保护剂浓度较高，导致细胞毒性增加，限制了其在人体组织、器官保存中的应用。改善冷冻载体或方法来提高冷冻速率以降低冷冻保护剂的浓度，是近年来学者对玻璃化冷冻研究探索的主要内容。
在对哺乳动物卵巢组织玻璃化冷冻中，传统的玻璃化冷冻方法是采取冷冻管作为载体(麦管或冷冻小管)，将卵巢组织切成片状或条状，采用高浓度的冷冻保护剂脱水后，将组织连同保护剂一起吸入或放入冷冻管，再直接放入液氮中，该方法冷冻保护剂体积较大，降温速率较慢，因此，近年来被直接与液氮接触的冷冻方法所取代。如对人和小鼠卵巢组织的研究中，采用电镜铜网或聚酯纤维薄膜作为载体(见Hasegawa A，HamadaY，Mehandjiev T and Koyama K(2004)In vitro growth and maturation as well as fertilizationof mouse preantral oocytes from vitrified ovaries.Fertil Steril 81，824-830.；Isachenko E，Isachenko V，Rahimi G and Nawroth F(2003)Cryopreservation of human ovarian tissue bydirect plunging into liquid nitrogen.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 108，186-193.)；有研究将卵巢组织块放入冷冻管中，将少量液氮直接覆盖于卵巢组织来增加组织与液氮接触面积，以加快降温速率(见Chen SU，Chien CL，Wu MY，Chen TH，Lai SM，Lin CW andYang YS(2006)Novel direct cover vitrification for cryopreservation of ovarian tissuesincreases follicle viability and pregnancy capability in mice.Hum Reprod 21，2794-2800chen et al，2006)，也有研究采用无载体的玻璃化冷冻(见Yeoman RR，Wolf DP andLee DM(2005)Coculture of monkey ovarian tissue increases survival aftervitrification and slow-rate freezing.Fertil Steril 83，1248-1254；Li YB，ZhouCQ，Yang GF，Wang Q and Dong Y(2007)Modified vitrification method for cryopreservationof human ovarian tissues.Chin Med J(Engl)120，110-114)。这些载体及其配套的方法或者不能使组织充分接触液氮，或者组织表面的冷冻保护剂残留会降低冷冻速率，特别是多样本同时进行冷冻时，会增加操作难度，难以保证各样本以同样的条件脱水和冷冻。
发明内容
本实用新型的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，使用此种载体，不仅可提高降温速率，降低冷冻保护剂浓度和毒性，在多样本同时进行冷冻时，使各样本能以同样的条件脱水和冷冻，而且操作简单、高效。
本实用新型所述针刺式组织片玻璃化冷冻载体由一端封闭、一端开口的冻存管和针刺装置组成；所述针刺装置包括针头和安装在针头上的用于穿组织片的针，针头上设置有与冻存管开口端的内部形状和尺寸匹配的部段；针刺装置与冻存管组合后，用于穿组织片的针位于冻存管内，针头为冻存管的管塞将冻存管开口端封闭。
为防止载体放于空气中因液氮挥发引起的压力骤变使冻存管爆裂，冻存管内设置有隔板，该隔板与开口端之间的空间用于装液氮和穿在针上的组织，该隔板与封闭端和它们之间的管壁围成的空间装有减压填料，隔板、冻存管的封闭端壁或/和它们之间的管壁上开有减压孔。隔板安装位置的优选方案：隔板与冻存管封闭端的间距L1是隔板与冻存管开口端的间距L2的五分之一至四分之一。减压填料为棉绳或棉纱或其它纤维等软性材料。
用于穿组织片的针至少为一根(即一根或多根)，为了了避免组织的损伤，所述针的直径不大于0.2mm，优选0.12～0.18mm。
为了便于操作，针刺装置可设置手柄，所述手柄与针头连接。为了既便于操作，又节约储存空间，本实用新型将手柄设计成长手柄和短手柄，长手柄和短手柄可以是一体化结构，在长手柄与短手柄的分界处设置易于折断的收缩结构；长手柄和短手柄也可以是两个构件，采用插装式连接。这样在将装有液氮和被冷冻组织的载体放入液氮罐储存前能方便、快速地去掉长手柄。
本实用新型所述载体中，瓶塞或短手柄可以采用不同的颜色，便于样本的分组；瓶管侧壁和手柄侧壁都可以采用耐低温记号笔作标记，以方便区分不同样本。
本实用新型所述载体可用于卵巢、肝脏等多种组织片的玻璃化冷冻。
使用本实用新型所述载体对卵巢组织进行玻璃化冷冻的操作步骤如下：
(1)将手术获得的人卵巢皮质片在盛有标本收集液的培养皿中分割成卵巢组织片，然后将至少4片卵巢组织片相隔有间距地穿在针上；
(2)将穿有卵巢组织片的针转移至冷冻保护剂中脱水后，用消毒吸水材料吸去卵巢组织片表面的冷冻保护剂，再将穿有卵巢组织片的针放入盛有液氮的容器中；
(3)将冻存管放入盛有液氮的容器中，使液氮进入冻存管，然后在液氮中将穿有卵巢组织片的针放入冻存管，针头作为管塞将冻存管的开口端封闭；
(4)将步骤(3)组装的装有液氮和卵巢组织片的冷冻载体转移至液氮罐进行储存；或去掉长手柄后，将步骤(3)组装的装有液氮和卵巢组织片的冷冻载体转移至液氮罐进行储存。
本实用新型具有以下有益效果：
1、使用本实用新型所述载体，在多样本组织同时进行玻璃化冷冻时，不仅操作简单、高效，而且可使各样本以同样的条件接触冷冻保护剂和液氮。
2、由于本实用新型所述载体可将多个卵巢组织片相隔有间距地穿在针上串成一排进行玻璃化冷冻的各项操作和储存，使多个组织片以相同的条件脱水和冷冻，防止样本逐一冷冻由于脱水时间不一致而造成的冻存效果不稳定。
3、使用本载体操作，可以将卵巢组织表面附着的冷冻保护剂体积降至最低，有效提高降温速率和降低冷冻保护剂残留的不利影响，并使卵巢组织各部位均能直接接触液氮，目前现有的玻璃化冷冻方法，尚不能同时满足组织全面接触液氮和最小化冷冻保护剂体积的要求。
4、使用本实用新型所述载体，由于玻璃化冷冻降温速率的明显提高，可以采用较低浓度的冷冻保护剂进行脱水(例如，人类卵巢组织玻璃化冷冻，可采用目前最低浓度冷冻保护剂15％二甲基亚枫和15％乙二醇，v/v)，因而具有低浓度保护剂低毒性的优点，具备临床应用前景。
5、实验表明，使用本实用新型所述载体及其配套的玻璃化冷冻方法，可以良好保存卵泡的形态和活力，且对卵巢多细胞成分的保存(如间质细胞和细胞外基质成分的保存)优于程序化慢冻和无载体玻璃化冷冻法；通过小鼠冻融卵巢的同种异体异位移植的动物模型表明：卵巢移植物的发育潜和功能恢复较其他冷冻方法保存效果更佳，与新鲜组最为接近。
6、本实用新型所述载体将冻存管与针刺装置有机组合，使操作和储存功能更加完善，使用更加方便；针头和手柄结构便于穿刺样本和冷冻操作，针头兼作冻存管瓶塞，既简化了结构，又方便于存放样本和取出样本。
7、本实用新型所述载体中冻存管所设计的减压结构，可防止载体放于空气中因液氮挥发引起的压力骤变而使冻存管爆裂，因而使用更加安全。
8、本实用新型所述载体中，将手柄设计为短手柄和易于去除的长手柄，既方便操作，又便于在将装有液氮和被冷冻组织的载体放入液氮罐储存前去掉长手柄，节约储存空间。
附图说明
图1是本实用新型所述针刺式组织片玻璃化冷冻载体的一种结构简图；
图2是本实用新型所述针刺式组织片玻璃化冷冻载体的又一种结构简图；
图3是针刺装置的第一种结构图；
图4是针刺装置的第二种结构图；
图5是针刺装置的第三种结构图；
图6是图5中三根针在针头上的一种安装方式示意图；
图7是图5中三根针在针头上的又一种安装方式示意图；
图8是针刺装置的第四种结构图；
图9是图8的侧视图；
图10是针刺装置的第五种结构图；
图11是图10中四根针在针头上的一种安装方式示意图；
图12是使用本实用新型所述载体对卵巢组织片进行玻璃化冷冻的操作示意图。
图中，1—冻存管、2—隔板、3—减压孔、4—减压填料、5—长手柄、6—短手柄、7—针头、8—针、9—盛有液氮的容器、10—长柄镊、11—组织片。
具体实施方式
实施例1
本实施例中，针刺式组织片玻璃化冷冻载体的结构如图1所示，由冻存管1和针刺装置组成。冻存管1为圆管，一端封闭、一端开口，用PE(聚乙烯)材料制作，长度40mm，内径6mm。针刺装置的结构如图8、图9所示，由针头7和用于穿组织片的针8组成，针头7的下部段为与冻存管1开口端的内部形状和尺寸匹配的圆锥状，其上部段为矩形板状(玻璃化冷却操作的夹持部位)，针8为两根，用不锈钢制作，其直径0.14
mm、长度30mm，相隔一定间距安装在针头7的下端。冻存管1与针刺装置的组合方式如图1所示，组合后，针8从冻存管1的开口端插入冻存管1内，针头7为冻存管1的管塞，将冻存管1的开口端封闭。
实施例2
本实施例中，针刺式组织片玻璃化冷冻载体的结构如图2所示，由冻存管1和针刺装置组成。冻存管1为圆管，一端封闭、一端开口，用PE(聚乙烯)材料制作，长度50mm，内径6mm，冻存管内设置有隔板2，所述隔板与封闭端之间的间距L1为10mm，与开口端之间的间距L2为40mm，隔板2、封闭端和它们之间的管壁围成的空间装有减压填料棉绳4，隔板2、冻存管1的封闭端壁开有孔径为1.5mm的减压孔3。针刺装置的结构如图3所示，由长手柄5、短手柄6、针头7和用于穿组织片的针8组成，长手柄5和短手柄6为一体化结构，长手柄5与短手柄6的分界处为易于折断的收缩结构，针头7的下部段为与冻存管1开口端的内部形状和尺寸匹配的圆锥状，其上端与短手柄6固连，针8为一根，用不锈钢制作，其直径0.18mm、长度35mm，安装在针头7的下端。冻存管1与针刺装置的组合方式如图2所示，组合后，针8从冻存管1的开口端插入冻存管1内，针头7为冻存管1的管塞，将冻存管1的开口端封闭。
实施例3
本实施例中，针刺式组织片玻璃化冷冻载体由冻存管1和针刺装置组成。冻存管1与实施例1相同；针刺装置的结构如图4所示，由长手柄5、短手柄6、针头7和用于穿组织片的针8组成，长手柄5和短手柄6为两个构件，长手柄5的下部段为圆锥体，短手柄6的上部段设置有与长手柄5相匹配的圆锥孔，长手柄5与短手柄6为插装式连接。针头7的下部段为与冻存管1开口端的内部形状和尺寸匹配的圆锥状，其上端与短手柄6固连，针8为一根，用不锈钢制作，其直径0.16mm、长度35mm。组合后，针8从冻存管1的开口端插入冻存管1内，针头7为冻存管1的管塞，将冻存管1的开口端封闭。
实施例4
本实施例中，针刺式组织片玻璃化冷冻载体由冻存管1和针刺装置组成。冻存管1的形状和结构结构形式与实施例2相同，与实施例2不同之处是：冻存管1长度60mm内径12mm，隔板与封闭端之间的间距L1为10mm，与开口端之间的间距L2为50mm；针刺装置的结构如图5、图6所示，与实施例2不同之处是用于穿组织片的针8为三根，长度42mm，相隔一定间距呈“三角”状安装在针头7的下端。三根针也可隔一定间距呈“一字”状安装在针头7的下端，如图7所示。
实施例5
本实施例中，针刺式组织片玻璃化冷冻载体由冻存管1和针刺装置组成。冻存管1的形状和结构结构形式与实施例2相同，与实施例2不同之处是：冻存管1的内径12mm；针刺装置的结构如图10、图11所示，由针头7和用于穿组织片的针8组成，针头7的下部段为与冻存管1开口端的内部形状和尺寸匹配的圆锥状，其上部段为矩形板状(玻璃化冷却操作的夹持部位)，针8为四根，用不锈钢制作，其直径0.12mm、长度35mm，相隔一定间距呈“矩形”状安装在针头7的下端。
实施例6
本实施例使用实施例2所述针刺式组织片玻璃化冷冻载体对冻卵巢组织进行玻璃化冷冻，操作方式如图12所示，操作步骤如下：
(1)将手术获得的人卵巢皮质片在盛有标本收集液(Leibovitz-15培养基添加10％的胎牛血清或白蛋白或合成血清替代成分)的培养皿中分割成面积1～4mm2的卵巢组织片，然后将4-6片卵巢组织片相隔2～5mm间距穿在不锈钢针8上；
(2)手持长手柄5将穿有卵巢组织片的不锈钢针8依次转移至第一种冷冻保护剂7.5％(v/v)二甲基亚枫和7.5％(v/v)乙二醇中脱水10分钟、第二种冷冻保护剂15％(v/v)二甲基亚枫和15％(v/v)乙二醇中脱水2分钟，然后用消毒纱布吸去卵巢组织片表面的冷冻保护剂，再将穿有卵巢组织片的不锈钢针8放入盛有液氮的容器9中；
(3)用长柄镊10将冻存管1倾斜放入盛有液氮的容器9中，使液氮进入冻存管1，然后手持长手柄5在液氮中将穿有卵巢组织片的不锈钢针8放入冻存管1，针头7作为管塞将冻存管1的开口端封闭；
(4)折去长手柄5后，将步骤3组装的装有液氮和卵巢组织片的冷冻载体转移至液氮罐进行储存。
Claims (10)
1、一种针刺式组织片玻璃化冷冻载体，包括一端封闭、一端开口的冻存管(1)，其特征在于还包括针刺装置，所述针刺装置包括针头(7)和安装在针头上用于穿组织片的针(8)，针头(7)上设置有与冻存管(1)开口端的内部形状和尺寸匹配的部段；针刺装置与冻存管(1)组合后，针(8)位于冻存管(1)内，针头(7)为冻存管(1)的管塞将冻存管开口端封闭。
2、根据权利要求1所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于所述冻存管(1)内设置有隔板(2)，该隔板与封闭端和它们之间的管壁围成的空间装有减压填料(4)，隔板(2)、冻存管(1)的封闭端壁或/和它们之间的管壁上开有减压孔(3)。
3、根据权利要求2所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于隔板(2)与冻存管(1)封闭端的间距L1是隔板(2)与冻存管(1)开口端的间距L2的五分之一至四分之一；减压填料(4)为棉绳或棉纱。
4、根据权利要求1至3中任一权利要求所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于用于穿组织片的针(8)至少为一根，其直径不大于0.2mm。
5、根据权利要求1至3中任一权利要求所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于针刺装置还包括手柄，所述手柄与针头(7)连接。
6、根据权利要求4所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于针刺装置还包括手柄，所述手柄与针头(7)连接。
7、根据权利要求5所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于所述手柄由长手柄(5)和短手柄(6)组成，长手柄(5)和短手柄(6)为一体化结构，长手柄(5)与短手柄(6)的分界处为易于折断的收缩结构。
8、根据权利要求6所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于所述手柄由长手柄(5)和短手柄(6)组成，长手柄(5)和短手柄(6)为一体化结构，长手柄(5)与短手柄(6)的分界处为易于折断的收缩结构。
9、根据权利要求5所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于所述手柄由长手柄(5)和短手柄(6)组成，长手柄(5)与短手柄(6)为插装式连接。
10、根据权利要求6所述的针刺式组织片玻璃化冷冻载体，其特征在于所述手柄由长手柄(5)和短手柄(6)组成，长手柄(5)与短手柄(6)为插装式连接。
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