CN115074315B - 一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法，包括：对猪耳进行初步采样，得到耳组织样本；提供一取样装置，取样装置包括木质基部，以及设置在木质基部上的穿刺针；将穿刺针平行穿入片状样本中；将片状样本和取样装置放入组织消毒液中浸泡消毒1分钟，然后取出片状样本和取样装置放入装有生理盐水的50ml冻存管中进行清洗；将清洗完成后的片状样本和取样装置装入内设有保存液的50ml冻存管中，然后冷藏。通过上述步骤规范了取样，并且其中保存液和消毒液的使用，使得片状样本纯净，活性较高；还便于进行消毒转移，避免多个样本放入布袋中，所带来的每次取样时耗时耗力，以及在样本在后期冻存过程取样的反复冻融，破环样本的风险。
Description
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法。
背景技术
目前，常采用EB病毒转化法、贴壁培养法和酶消化法进行畜禽细胞的体外大量培养，但对比试验结果表明：EB病毒转化法对于畜类品种的体外细胞培养并不适用，其培养的细胞活率及纯度均不能达到所需标准。酶消化法和贴壁培养法获得的原代细胞分别经传代后接种，细胞群体倍增时间(PDT)分别为35.9h和48h。
在一些相关技术中，对于畜类细胞保藏而言，细胞纯度及活性均有较高的要求，在对猪耳组织进行取样和冷冻保存过程中，若猪耳组织取样的样本处理不好会影响冷冻保存效果；另外在冷冻保存过程中，猪耳组织细胞免受溶液损伤和冰晶损伤，也会影响样本保存质量；
再者，对猪耳组织进行取样和冷冻保存过程中，一般是将样本切割后，多个样本放入布袋中放入保存，因为每个布袋中有多个样本，每次取样时耗时耗力，还存在样本因为反复冻融而破环样本的风险。因此为解决以上的问题，提出了一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法。
发明内容
本申请实施例提供一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法，以解决相关技术中对猪耳组织进行取样的过程不规范，以及将样本切割后，多个样本放入布袋中放入保存所导致的后序取样时耗时耗力和反复冻融破环样本的问题。
第一方面，提供了一种高质量猪耳组织取样方法，包括以下步骤：
对猪耳进行初步采样，得到耳组织样本；
提供一取样装置，所述取样装置包括木质基部，以及设置在木质基部上的穿刺针；
将所述耳组织样本切成片状，得到片状样本，并将所述穿刺针平行穿入片状样本中；
将所述片状样本和取样装置放入组织消毒液中浸泡消毒1分钟，然后取出片状样本和取样装置放入装有生理盐水的50ml冻存管中进行清洗；
将清洗完成后的片状样本和取样装置装入内设有保存液的50ml冻存管中，然后放入4摄氏度冰箱保存备用；其中50ml冻存管中的保存液包括生理盐水500ml，青霉素25万单位，链霉素0.25g。
一些实施例中，对猪耳进行初步采样具体包括以下步骤：
依次使用蒸馏水、双氧水和生理盐水冲洗猪耳，得到待采样猪耳；
使用酒精棉球擦拭待采样猪耳的采样部位，以及用于取样的耳号钳；
使用耳号钳在采样部位夹取，得到耳组织样本；耳组织样本块状或圆形组织，块状组织长度不低于1cm，圆形组织的面积为2-3cm2。
一些实施例中，所述消毒液按照生理盐水和碘伏按体积比1:1配置。
第二方面，提供了一种高质量猪耳组织长期高效保存方法，其包括以下步骤：
制备保护液P、冷冻液A和冷冻液B；
提供按照的高质量猪耳组织取样方法得到的保存在50ml冻存管内的片状样本；
吸取1～1.5ml保护液P到2ml的冻存管a，1～1.5ml冷冻液A到2ml的冻存管b，1～1.5ml冷冻液B到2ml的冻存管c；
将片状样本和取样装置转入装有保护液P的冻存管a中，平衡2～3min；然后移至冻存管b中平衡3～5min；
将冻存管b中的片状样本和取样装置转移至冻存管c中，然后迅速的放入液氮中保存。
一些实施例中，所述所述保护液P包括等比例混合的HTF溶液和5％HSA。
一些实施例中，所述冷冻液A由保护液P、8％乙二醇和8％二甲基亚砜等比例混合而成。
一些实施例中，所述冷冻液B由保护液P、16％乙二醇、14％二甲基亚砜、8mg/mlFicoll400和0.6mol/l蔗糖等比例混合而成。
一些实施例中，所述制备保护液P、冷冻液A和冷冻液B，在4℃～8℃下冷藏保存。
一些实施例中，在吸取保护液P、冷冻液A和冷冻液B时，可将分别装有保护液P、冷冻液A和冷冻液B的三个容器进行上下晃动。
一些实施例中，在将冻存管b中的片状样本和取样装置转移至冻存管c中之前还包括以下步骤：
在木质基部上穿设用于悬挂的抗冻细线。
本申请提供的技术方案带来的有益效果包括：
本申请实施例提供了一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法，规范了取样步骤，并且其中保存液和消毒液的使用，使得片状样本纯净，并且活性较高；取样装置的穿刺针和木质基部的使用，便于进行消毒转移，避免多个样本放入布袋中，所带来的每次取样时耗时耗力，以及在样本在后期冻存过程取样的反复冻融，破环样本的风险。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的取样装置的示意图；
图2为本申请实施例提供的猪耳部组织冻存信息表；
图3为本申请实施例提供的20066487原代细胞生长第9天(A/B)，传代后第2天(C/D)的示意图；
图4为本申请实施例提供的20066771原代细胞生长第11天(A/B)，传代后第3天(C/D)的示意图；
图5为本申请实施例提供的20066355原代细胞生长第10天(A/B)，传代后第3天(C/D)的示意图。
图中：1、木质基部；2、穿刺针。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例提供了一种高质量猪耳组织取样及长期高效保存方法，以解决相关技术中对猪耳组织进行取样的过程不规范，以及将样本切割后，多个样本放入布袋中放入保存所导致的后序取样时耗时耗力和反复冻融破环样本的问题。
请参阅图1-图2，一种高质量猪耳组织取样方法，包括以下步骤：
对猪耳进行初步采样，得到耳组织样本；
提供一取样装置，取样装置包括木质基部1，以及设置在木质基部1上的穿刺针2；
将耳组织样本切成片状，得到片状样本，并将穿刺针2平行穿入片状样本中；将片状样本和取样装置放入组织消毒液中浸泡消毒1分钟，然后取出片状样本和取样装置放入装有生理盐水的50ml冻存管中进行清洗；
将清洗完成后的片状样本和取样装置装入内设有保存液的50ml冻存管中，然后放入4摄氏度冰箱保存备用；其中50ml冻存管中的保存液包括生理盐水500ml，青霉素25万单位，链霉素0.25g。
其中，消毒液按照生理盐水和碘伏按体积比1:1配置，采样前应对耳号钳严格消毒，采样过程中每采集一个样本后，均需再次用酒精或酒精棉球对耳号钳进行严格冲洗或擦拭消毒，防止交叉污染。夹取的耳组织样本不能太小，避免样本只有皮肤，应该含有肌肉。
片状样本在冻存管的消毒液中浸泡和清洗时可适当摇晃以达到更好的消毒和清洗目的，同时避免组织保存液受污染。所有采集的样本需在24小时内通过放有冰袋的泡沫盒(泡沫盒的温度为4度左右)运到实验室进行后续实验，在冰袋上覆盖干毛巾避免冻存管与冰袋直接接触。
通过以上的方式，规范了取样步骤，并且其中保存液和消毒液的使用，使得片状样本纯净，并且活性较高。
在一些优选的实施例中，对猪耳进行初步采样具体包括以下步骤：
依次使用蒸馏水、双氧水和生理盐水冲洗猪耳，得到待采样猪耳；
使用酒精棉球擦拭待采样猪耳的采样部位，以及用于取样的耳号钳；
使用耳号钳在采样部位夹取，得到耳组织样本；耳组织样本块状或圆形组织，块状组织长度不低于1cm，圆形组织的面积为2-3cm2。
本申请还提出了一种高质量猪耳组织长期高效保存方法，其包括以下步骤：
制备保护液P、冷冻液A和冷冻液B；
提供按照如权利要求1-3任一项的高质量猪耳组织取样方法得到的保存在50ml冻存管内的片状样本；
吸取1～1.5ml保护液P到2ml的冻存管a，1～1.5ml冷冻液A到2ml的冻存管b，1～1.5ml冷冻液B到2ml的冻存管c；
将片状样本和取样装置转入装有保护液P的冻存管a中，平衡2～3min；然后移至冻存管b中平衡3～5min；
将冻存管b中的片状样本和取样装置转移至冻存管c中，然后迅速的放入液氮中保存，为后续对组织样进行解冻分离培养细胞。
其中，保护液P包括等比例混合的HTF溶液和5％HSA。。冷冻液A由保护液P、8％乙二醇和8％二甲基亚砜等比例混合而成(1:1:1)。冷冻液B由保护液P、16％乙二醇、14％二甲基亚砜、8mg/ml Ficoll400和0.6mol/l蔗糖等比例混合而成(1:1:1:1:1)。制备保护液P、冷冻液A和冷冻液B，在4℃～8℃下冷藏保存。在吸取保护液P、冷冻液A和冷冻液B时，可将分别装有保护液P、冷冻液A和冷冻液B的三个容器进行上下晃动(不要剧烈摇晃以免产生气泡)。
保护液P、冷冻液A和冷冻液B的作用：可保护组织样本中的细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。保护液P可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻剂可同组织样本中的水分子结合，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成。其中，冷冻液A为渗透性冷冻保护剂，其可以渗透到细胞内。冷冻液B既含可渗透到细胞内的小分子物质乙二醇和二甲基亚砜，又含有非渗透性冷冻保护剂(不能渗透到细胞内)的大分子物质蔗糖。通过标准操作，可以高效的保护组织样本中的细胞在超低温条件下免受破坏，适用于后期需要进行细胞培养的组织样本的保存。
在一些优选的实施例中，在将冻存管b中的片状样本和取样装置转移至冻存管c中之前还包括以下步骤：在木质基部1上穿设用于悬挂的抗冻细线。
取样装置的使用，木质基部1为圆形，侧面有一穿透圆孔，用于抗冻细线穿入，以方便片状样本放入液氮保存后随时拿取样本。取样穿刺针2为四根不锈刚针，穿刺针2并排直线固定在木质基部1上(1平方厘米大小，1.5cm厚)，尖端向外，用于穿刺固定片状样本，木质基部1能确保其漂浮于液体或液氮等样本保护液中。
工作流程：将新鲜组织或经过保护液预处理的片状样本(片状样本大小为0.5cm﹡1cm*1cm)，用穿刺针2的针状尖头平行刺入片状样本内部固定好样本，随后可放入冷冻液中处理，也可以在木质基部1侧面木质圆孔中穿入抗冻细线后直接放入液氮中保存样本，后续样本使用时方便拿取。
功能对比：目前动物样本取样过程中没有固定装置，一般是将样本切割后，多个样本放入布袋中放入液氮保存，因为每个布袋中有多个样本，每次取样时耗时耗力，还存在样本因为反复冻融而破环样本的风险。此外，该装置在木质基部1上编好样本号后，固定好片状样本就可以多个同时放入冷冻液中继续处理样本(实验人员可以离开现场，等到达处理时间后返回继续实验即可)，解决了之前只能用捏着等工具人为的在现场对每个样品操作，极大的提高了工作效率。
实施例一
采用上述高质量猪耳组织取样方法，可参考图2中所示，
结论：第一，此次共采集26头组织样本，每个组织样本有3-4块，每块样本偏小，双面创口，不符合采样要求，组织分离时可能增大污染率，每管按照1.5ml量进行冻存；
第二，每个样本采集3-4小块，但是总量还是比较偏少，只能冻存3管，达不到每个样本冻5管的要求。
实施例二
参考下表
采样猪组织细胞分离基本信息表
从冻存组织中进行细胞分离、保存基本信息表
耳部组织体外分离培养信息(参考附图3-5，其只给出了部分情况)
细胞类型：耳部成纤维细胞原代细胞分离方法：酶消化法
细胞接种器皿：12孔板原代细胞培养基组分：基础培基
原代细胞长出时间：第4天60％以上汇合天数：5-7天
原代细胞传代比例：2:3
耳部成纤维细胞体外扩增培养信息(参考附图3-5，其只给出了部分情况)
细胞培养基组分：基础培养基
扩增培养细胞接种器皿：12孔板
细胞传代比例：1:380％以上汇合天数：2-3天
耳部成纤维细胞冷冻复苏信息
冷冻培养基：基础培基+10％DMSO
冷冻细胞单位：1ml/管
冷冻细胞前接种器皿：12孔板细胞复苏第2天贴壁率：90％。
分离结果：采集的26头种猪耳部组织，首先进行组织冻存。两周后确认采样猪群健康状况良好，后对此批次20头组织样进行解冻分离培养细胞，经体外传代扩增后在细胞生长良好，80％汇合度时进行了冻存，所有细胞已转移液氮深低温保存。
耳部成纤维细胞体外扩增测试结果：
细胞生长特性(形态、生长速度等简述)：解冻的猪耳部组织采取酶消化法分离出原代细胞，分离的细胞培养3天可见爬出小三角形、梭形细胞，4-6天呈梭形、三角形的细胞呈优势生长，为典型的成纤维状，细胞汇合度80％以上进行传代，经过消化传代1-2次后即可得到富集的成纤维细胞。
在本申请的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
需要说明的是，在本申请中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种高质量猪耳组织取样方法，其特征在于，包括以下步骤：
对猪耳进行初步采样，得到耳组织样本；
提供一取样装置，所述取样装置包括木质基部（1），以及设置在木质基部（1）上的穿刺针（2）；
将所述耳组织样本切成片状，得到片状样本，并将所述穿刺针（2）平行穿入片状样本中；
将所述片状样本和取样装置放入组织消毒液中浸泡消毒1分钟，然后取出片状样本和取样装置放入装有生理盐水的50ml冻存管中进行清洗；
将清洗完成后的片状样本和取样装置装入内设有保存液的50ml冻存管中，然后放入4摄氏度冰箱保存备用；其中50ml冻存管中的保存液包括生理盐水500ml，青霉素25万单位，链霉素0.25g。
2.如权利要求1所述的高质量猪耳组织取样方法，其特征在于，对猪耳进行初步采样具体包括以下步骤：
依次使用蒸馏水、双氧水和生理盐水冲洗猪耳，得到待采样猪耳；
使用酒精棉球擦拭待采样猪耳的采样部位，以及用于取样的耳号钳；
使用耳号钳在采样部位夹取，得到耳组织样本；耳组织样本块状或圆形组织，块状组织长度不低于1cm，圆形组织的面积为2-3cm2。
3.如权利要求2所述的高质量猪耳组织取样方法，其特征在于：
所述消毒液按照生理盐水和碘伏按体积比1:1配置。
4.一种高质量猪耳组织长期高效保存方法，其特征在于，其包括以下步骤：
制备保护液P、冷冻液A和冷冻液B；
提供按照如权利要求1-3任一项所述的高质量猪耳组织取样方法得到的保存在50ml冻存管内的片状样本和取样装置；
吸取1~1.5ml保护液P到2ml的冻存管a，1~1.5ml冷冻液A到2ml的冻存管b，1~1.5ml冷冻液B到2ml的冻存管c;
将片状样本和取样装置转入装有保护液P的冻存管a中，平衡2~3min；然后移至冻存管b中平衡3~5min;
将冻存管b中的片状样本和取样装置转移至冻存管c中，然后迅速的放入液氮中保存；
所述保护液P包括等比例混合的HTF溶液和5%HSA；
所述冷冻液A由保护液P、8%乙二醇和8%二甲基亚砜等比例混合而成1:1:1；
所述冷冻液B由保护液P、16%乙二醇、14%二甲基亚砜、8mg/ml Ficoll400和0.6mol/l蔗糖按照等比例混合而成1:1:1:1:1。
5.如权利要求4所述的高质量猪耳组织长期高效保存方法，其特征在于：
所述制备保护液P、冷冻液A和冷冻液B，在4℃~8℃下冷藏保存。
6.如权利要求4所述的高质量猪耳组织长期高效保存方法，其特征在于：
在吸取保护液P、冷冻液A和冷冻液B时，可将分别装有保护液P、冷冻液A和冷冻液B的三个容器进行上下晃动。
7.如权利要求4所述的高质量猪耳组织长期高效保存方法，其特征在于，在将冻存管b中的片状样本和取样装置转移至冻存管c中之前还包括以下步骤：
在木质基部（1）上穿设用于悬挂的抗冻细线。
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