CN103478118A - 一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法。它先将组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到含有蔗糖、DMSO和谷胱甘肽的冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。解冻时依次经过解冻液、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。本发明先将组织用匀浆机处理成乳糜状，有利于冷冻保护剂渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；同时冷冻液中添加的非渗透性保护剂蔗糖，也有利于组织细胞内的水分脱出；加入抗氧化物质谷胱甘肽，有助于减轻氧自由基对细胞内蛋白的破坏作用。解冻后组织块在培养瓶内直接接种，贴壁存活率在96%以上。

Description

一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及一种生物冷冻保存技术，具体是一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法。

背景技术

随着生物技术的快速发展，细胞培养技术已广泛应用于生物学、医学、畜牧学等生命科学领域，成为科研或生产中不可或缺的技术手段。目前，动物机体几乎所有的组织经简单机械或蛋白酶处理后接种到培养瓶中，在适宜的培养条件下都能增殖扩繁（Spier RE.Large-scale mammalian cell culture: methods, applications and products. Curr Opin Biotechnol. 1991 Jun;2(3):375-9）。然而研究表明，这些细胞在体外培养的传代次数不能过多，否则会出现细胞生长缓慢、老化以及生物学功能逐渐丧失等不良现象。因此，如果试验或生产中要重复进行、多次培养细胞时，那就需要不断采集新鲜组织。

由于细胞培养时所取组织应该尽可能无细菌或病毒污染、同时具有较强的增殖活性，所以取样时通常将组织放在含抗生素的液体如磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水中保存，尽快（3-4小时内）送回实验室处理。如果取样现场距离实验室较远或交通不方便的情况下，组织在液体中保存时间过长，那么会造成细胞活性降低，接种后细胞生长缓慢；而且由于取样通常并不是在无菌环境中，时间过长也会造成液体中细菌大量增殖，培养后容易发生污染。因此，如果能将组织进行冷冻保存，在下次细胞培养时直接解冻、复苏组织而不需再次取样，这样就极大地避免了麻烦及浪费，也能够最大限度地利用材料；而且如果所取样品为珍稀、甚至是濒危灭绝动物的稀缺组织，冷冻保存组织的意义就更不可估量。

组织冷冻保存时，渗透性冷冻保护剂如二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇或甘油等必须渗透进入细胞质中才能起到保护作用，防止组织细胞内冰晶的生成。然而如果组织过大，则不利于冷冻保护剂穿透进入，影响冷冻保存效果。尽管目前有组织块冷冻保存成功的报道（孙苏军，安志兴，彭新荣，张涌.山羊乳腺组织块冷冻保存实验，西北农林科技大学学报（自然科学版）,2005,33(4):5-8），但该冷冻方法操作过程非常繁琐、费时，具体表现为：先加基础液，冰上预冷15min，放入组织块后在摇床上平衡6h；分两次添加DMSO；冷冻时0℃平衡1h，-20℃平衡2h。同时保存组织块的数量较少（每管仅冻存6块），而且复苏后组织块的存活率（最高存活率为89.8%）还需进一步提高。

发明内容

 为了解决细胞培养时组织取样存在的问题，改善目前组织块冷冻保存方法存在的技术缺陷，本发明提供了一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法。本发明在冷冻前先将组织处理成小的组织块，这步处理实际上等同于细胞培养时的组织块剪碎处理，组织块解冻后就可直接接种到培养瓶内培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。该方法操作步骤简单、花费时间短，一次能冻存较多数量的组织块，复苏后组织块贴壁存活率高达96%以上。

本发明的技术方案是：一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法，其特征是，先将新取的动物组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。

具体包括以下步骤：

（1）冷冻液组分与配制

每100ml冷冻液含有：二甲基亚砜（DMSO）9-11ml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清（FBS）15-20 ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖1-2g 和DMEM/F12液75.2-67.5ml；冷冻液经0.22微米滤膜过滤后4℃保存；

      （2）组织匀浆处理

在无菌超净台内首先将组织放在平皿中修剪成1.0-1.2cm³的块状，然后用PBS液彻底冲洗5-8遍，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3-5下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，180-200转/分钟匀浆处理3-5分钟，这时组织块成乳糜状；

      （3）组织块的冷冻

      冷冻时，先用吸管将乳糜状组织块放入离心管内，根据组织块的体积加入8-10倍量的冷冻液混匀，然后按每管5毫升分装到冻存管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，次日将冻存管转入液氮中长期保存（注：从加入冷冻液到将冷冻保存盒放置在超低温冰箱中整个操作时间在5-8分钟内完成，且室温维持在22-25℃）。

解冻方法：解冻时依次经过解冻液、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。

（1）解冻液组分与配制

每100ml解冻液含有： FBS 10-15ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2-3g和DMEM/F12液90-85ml，经0.22微米滤膜过滤后4℃保存；

（2）解冻时，先将冻存管从液氮中取出，放在38-39℃水浴中溶解，用吸管吸取组织块放入离心管中，加入4-5倍量解冻液轻轻混匀后静置3-5分钟，然后离心（800转/分钟、3分钟）去掉上清液，之后再加入4-5倍量培养液轻轻混匀后离心（800转/分钟、3分钟）并去掉上清液，这时可将组织块直接接种到培养瓶中或经蛋白酶消化成单个细胞，加入培养液后放CO₂培养箱内培养。

本发明的有益效果是：（1）本发明先将组织用匀浆机处理成乳糜状，这种处理不仅比已报道的徒手切块剪碎省时、省力，而且使单个组织块更均匀、细小（每块直径在0.1-0.2 mm之间），有利于冷冻保护剂DMSO渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；同时冷冻液中添加的非渗透性保护剂蔗糖，也有利于组织细胞内的水分脱出，所以冷冻时能有效地防止组织细胞内冰晶的生成。（2）本发明在冷冻液和解冻液中加入抗氧化物质谷胱甘肽，有助于减轻氧自由基对细胞内蛋白的破坏作用，将冷冻损伤降到最低。解冻后组织块如果在培养瓶内直接接种，贴壁存活率在96%以上，高于已报道的89.8%。如果用蛋白酶消化成单个细胞后经台盼蓝染色，活细胞率为92.8%，与新鲜组织消化后活细胞率为94.6%差异不显著；（4）本发明方法已在山东省农业科学院畜牧兽医研究所内部推广使用，普遍认为是一种省时省力的组织冷冻保存方法。

附图说明

 图1 为实施例1贴壁约90-100%的肌肉细胞生长图片（相差显微镜下放大100倍观察）。

图2为实施例2贴壁约90-100%的乳腺细胞生长图片（相差显微镜下放大100倍观察）。

具体实施方式

实施例1

1、冷冻液配制

将9毫升DMSO、1毫升Supercool X-1000、18毫升FBS、0.2克谷胱甘肽、1.2克蔗糖溶解在72毫升DMEM/F12液中，经0.22微米滤膜过滤后4℃保存备用。

2、解冻液配制

将12毫升FBS、0.2克谷胱甘肽、3克蔗糖溶解在88毫升DMEM/F12液中，经0.22微米滤膜过滤后4℃保存备用。

3、肌肉组织样品处理

从屠宰场剪取成年鲁西黄牛后肢外侧肌肉组织，放在含1%青链霉素液的PBS液中2小时内带回实验室。在无菌超净台内首先将肌肉组织放在平皿中，修剪成1 cm³块状，然后用PBS液冲洗8遍，冲洗时操作者左手持弯眼科镊夹住组织块，右手持弯眼科剪用其外侧钝端反复摆摊开组织块内部，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3下，让组织块稍微干燥后接着放入组织匀浆机的无菌试管内，180转/分钟匀浆处理5分钟，这时组织块成乳糜状。

4、组织块的冷冻与解冻

冷冻时室温为25℃，先用吸管将乳糜状的组织块放入50毫升离心管内，每管内组织块为3毫升，然后加入30毫升冷冻液轻轻混匀，之后按每管5毫升分装到冻存管中，放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，整个操作时间在5分钟内完成。次日将冻存管转入液氮中长期保存。

68天后解冻组织块，先将冻存管从液氮中取出，放在38℃水浴中溶解，然后用吸管吸取组织块放入50毫升离心管中，加入25毫升解冻液轻轻混匀后静置4分钟，之后离心（800转/分钟、3分钟）去掉上清液，再加入25毫升培养液（添加10% FBS、0.5%青链霉素混合液的DMEM/F12液）轻轻混匀后离心（800转/分钟、3分钟）并去掉上清液。

5、解冻后细胞培养

用吸管将组织块直接接种到T75培养瓶中，在培养瓶的对侧加入25毫升培养液后放CO₂培养箱内，2小时后轻轻翻转培养瓶，让培养液充分浸润组织块并继续培养。70小时后有细胞从组织中游离出来，98小时后有约10-20%细胞贴壁，这时在相差显微镜下统计组织块贴壁存活率为96.2%，之后换入新鲜培养液，7天后有约90-100%细胞贴壁（如图1所示）。

实施例2

1、冷冻液配制

将11毫升DMSO、1.2毫升Supercool X-1000、20毫升FBS、0.15克谷胱甘肽、1克蔗糖溶解在67.8毫升DMEM/F12液中，经0.22微米滤膜过滤后4℃保存备用。

2、解冻液配制

将12毫升FBS、0.15克谷胱甘肽、2克蔗糖溶解在88毫升DMEM/F12液中，经0.22微米滤膜过滤后4℃保存备用。

3、乳腺组织样品处理

从屠宰场剪取荷斯坦奶牛乳腺组织，放在含1%青链霉素液的PBS液中3小时内带回实验室。在无菌超净台内首先将乳腺组织放在平皿中，修剪成1.2 cm³块状，然后用PBS液冲洗6遍，冲洗时操作者左手持弯眼科镊夹住组织块，右手持弯眼科剪用其外侧钝端反复摆摊开组织块内部，之后把组织块放在干燥的平皿内沾5下，让组织块稍微干燥后接着放入组织匀浆机的无菌试管内，190转/分钟匀浆处理3分钟，这时组织块成乳糜状。

4、组织块的冷冻与解冻

冷冻时室温为23℃，先用吸管将乳糜状的组织块放入50毫升离心管内，每管内3.5毫升，然后加入32毫升冷冻液混匀，之后按每管5毫升分装到冻存管中，放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，整个操作时间在8分钟内完成。次日将冻存管转入液氮中长期保存。

134天后解冻组织块，先将冻存管从液氮中取出，放在39℃水浴中溶解，然后用吸管吸取组织块放入离心管中，加入20毫升解冻液轻轻混匀后静置3分钟，之后离心（800转/分钟、3分钟）去掉上清液，再加入20毫升培养液（添加10% FBS、5 ng/mL表皮生长因子、0.5%青链霉素混合液的DMEM/F12液）轻轻混匀后离心（800转/分钟、3分钟）并去掉上清液。

5、解冻后细胞培养

在离心管内加入5毫升0.25%胰酶消化液，用吸管反复吹打组织块后放在培养箱内，以后每隔5分钟用吸管反复吹打组织块，15分钟后组织块呈柔软的丝线状，这时在离心管内加入20毫升培养液，经200目细胞筛过滤后离心（800转/分钟、3分钟）去掉上清液，然后重新加入培养液调节细胞密度约为5×10⁵个/毫升，同时用台盼蓝染色统计活细胞率为92.8%（注：冷冻前已进行新鲜乳腺组织的消化处理，检测活细胞率为94.6%）。之后按每个T75培养瓶加入25毫升细胞混合液放入CO₂培养箱内培养，18小时后有约10-20%细胞贴壁，48小时后换入新鲜培养液，96小时后有约90-100%细胞贴壁（如图2所示）。

Claims (4)

1. 一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法，其特征是，先将新取的动物组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存；所述冷冻液的组分为：每100ml冷冻液含有：二甲基亚砜9-11ml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清15-20 ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖1-2g 和DMEM/F12液75.2-67.5ml；冷冻液经0.22微米滤膜过滤后4℃保存。

2.如权利要求1所述的一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法，其特征是，

（1）在无菌超净台内首先将组织放在平皿中修剪成1.0-1.2cm³的块状，然后用PBS液彻底冲洗5-8遍，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3-5下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，180-200转/分钟匀浆处理3-5分钟，这时组织块成乳糜状；

（2）冷冻时，先用吸管将乳糜状组织块放入离心管内，根据乳糜状组织块的体积加入8-10倍量的冷冻液混匀，然后按每管5毫升分装到冻存管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，次日将冻存管转入液氮中长期保存。

3.一种用于细胞培养的组织块的解冻方法，其特征是，解冻时先将权利要求1或2所述的冻存管从液氮中取出，依次经过解冻液离心洗涤、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养；所述解冻液的组分为：每100ml解冻液含有：胎牛血清10-15ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2-3g和DMEM/F12液90-85ml，经0.22微米滤膜过滤后4℃保存。

4.如权利要求3所述的用于细胞培养的组织块的解冻方法，其特征是，解冻时，先将权利要求1或2所述的冻存管从液氮中取出，放在38-39℃水浴中溶解，用吸管吸取组织块放入离心管中，加入4-5倍量解冻液轻轻混匀后静置3-5分钟，然后离心去掉上清液，之后再加入4-5倍量培养液轻轻混匀后离心并去掉上清液，这时可将组织块直接接种到培养瓶中或经蛋白酶消化成单个细胞，加入培养液后放CO₂培养箱内培养。

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