CN101167450A - 一种器官保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学生物学技术，涉及一种器官保存液及其制备，按照每1000ml配制量的步骤包括：分别取四氢生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于1ml二甲基亚砜作为母液；配制0.1mol/L的CaCl210ml备用；将800ml双蒸水加入1000ml容器中，依次加入KCl1.12g、MgCl22.64g、甘露醇10.93g、组氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸钠3.74g，搅拌至清晰；加入乳酸钠6.90ml，搅拌至清晰；加入0.1mol/L CaCl22.5ml，搅拌至清晰；加入备用液和母液，搅拌至清晰。pH调至7.3～7.5，渗透压调至320 Osm/L，双蒸水定容至1000ml。放置4℃低温保存。
Description
技术领域
本发明属于生物学和医学技术领域，涉及器官移植技术中的器官保存，更具体地涉及一种器官保存液及其制备方法。
背景技术
器官移植是20世纪人类医学科学的重大进展。目前，全世界在各领域的移植总数已超过70万例(次)，存活最长的器官移植受者已近半个世纪。器官保存是器官移植的三大技术支柱之一。为了提高患者长期存活率、缓解供器官短缺的矛盾，移植临床对器官保存技术提出了更高的要求。
美国威斯康星大学(UW)Belzer教授等1988年研制成功的威斯康星大学溶液(Universityof Wisconsin Solution，UW液)极大地延长了肾、胰、肝、心脏等器官的保存时间。在UW液应用的20多年来，其已逐渐成为了临床上器官移植工作中保存液的“金标准”，后续开发成功的一系列器官保存也都以UW液为参照。Celsior液是1994年由Pasteur-Merieux研制成功的一种新型的细胞外液型保存液，其心脏冷保存效果已被实验证实优于UW液和St.Thomas液等传统的器官保存液。每升Celsior液的成分是甘露醇10.93g；组氨酸4.63g；谷胱甘肽0.92g；谷氨酸钠3.74g；乳酸钠6.90ml；KCl 1.12g；MgCl2 2.64g；0.1mol/L CaCl2 2.5ml。Celsior液对心肌的作用主要表现在：(1)细胞外Na+为87-115mmol/L，K+为6.3-6.9mmol/L，是一种高钠低钾溶液，与细胞外液相似，易于均匀扩散至组织间隙，改善灌注效果；(2)通过添加非渗透性物质甘露醇、乳糖醛酸等大分子来维持细胞内外渗透压的平衡，减轻心肌细胞水肿；(3)通过组氨酸/乳糖醛酸缓冲系统防止细胞酸化；(4)保存液中含有谷氨酸，保证充足的ATP供应；(5)用还原型谷胱甘肽作为抗氧化剂，可防止氧自由基介导的损伤作用。临床证实Celsior液在心脏移植中应用是安全有效的，可显著延长器官体外活性。但是目前此类保存液并不能降低器官移植过程中的灌注再损伤，对进一步提高器官移植后的存活率存在一定障碍。
本研究试图通过对Celsior液进行改良，研究开发出基于Celsior液的新的能防止减弱缺血再灌注损伤的多器官保存液。
四氢生物蝶呤(BH4)为喋啶类化合物，是一氧化氮合酶(NOS)重要的辅助因子，可与NOS紧密结合，促进NO的合成与释放。内源性NO可抑制PMN对血管内皮粘附、聚集，从而减轻组织器官的缺血损伤。NO也通过抑制PMN膜结合NADPH氧化酶活性，直接中和超氧阴离子而减轻氧自由基对血管内皮的损伤。因此可将BH4作为一种抗氧化、抗缺血再灌注损伤的因子添加至Celsior液中以加强其器官组织保护作用。
二氮嗪(diazoxide，DE)是一种苯丙噻二嗪类衍生物，作为一种血管扩张剂用于高血压危象的治疗。近年来的研究证实，DE还是一种线粒体ATP敏感性钾通道的特异性开放剂，它可模拟缺血预处理效应，对抗心肌缺血缺氧性损伤。在移植心脏保存领域，预先给予DE可显著促进心脏保存后舒张功能的恢复，缓解心肌水肿程度。因此，可将DE直接添加在心麻痹液中进行心脏保存。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种能有效防止减弱缺血再灌注损伤的多器官保存液及其制备方法。
本发明是一种器官保存液，其特征在于，在1000ml器官保存液中含有：
甘露醇 10.93g； 组氨酸 4.63g； 谷胱甘肽 0.92g；
谷氨酸钠 3.74g； 乳酸钠 6.90ml； KCl 1.12g；
MgCl2 2.64g； 0.1mol/L CaCl2 2.5ml； 四氢生物蝶呤 1.57mg；
二氮嗪 6.92mg； 余量为双蒸水。
一种上述保存液的制备方法，其特征在于：按照1000ml配置量的具体步骤如下：
(1)分别取四氢生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)作为母液备用；配制0.1mol/L的CaCl2 10ml备用；
(2)将800ml双蒸水加入＞1000ml容器中，再依次加入KCl 1.12g、MgCl22.64g、甘露醇10.93g、组氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸钠3.74g，搅拌至颜色变为清晰；加入乳酸钠6.90ml，搅拌至颜色变为清晰；加入0.1mol/L CaCl22.5ml，搅拌至颜色变为清晰；加入备用的母液，搅拌至颜色变为清晰。
(3)pH调至7.3～7.5，渗透压调至320Osm/L，双蒸水定容至1000ml，放置4℃低温保存待用。
本发明的优点在于：低温能减慢心肌细胞的生化反应速度和细胞内的酶降解速度，延迟溶酶体类的亚细胞器官的消散。而Celsior液是一种新型的细胞外液型保存液，其心脏冷保存效果已被实验证实优于UW液和St.Thomas液等传统的器官保存液。它含有防渗透剂甘露醇、还原型谷胱甘肽等氧自由基清除剂、组氨酸缓冲系统及能量底物谷氨酸，能维持细胞内外渗透压的平衡、有效地对抗氧自由基损伤、有效抑制酸中毒的发生、提供心肌细胞无氧状态下的能量来源、改善血管内皮功能。
四氢生物蝶呤(BH4)是一氧化氮合酶(NOS)重要的辅助因子，可与NOS紧密结合，促进NO的合成与释放。缺血再灌注损伤引起内源性BH4减少，进而导致内皮细胞和心肌细胞功能减退。外源性供给BH4后明显减少了NOS依赖的O2-及其代谢产物H2O2的数量，并提高了NO的净产量。适量的NO具有清除细胞内低水平氧自由基的作用。增加的NO通过抑制ICAM-1表达和PMN膜结合NADPH氧化酶活性，直接中和超氧阴离子而减轻氧自由基对血管内皮的损伤。同时，NO本身作为内皮衍化舒张因子，具有强大的扩张冠状动脉的作用，因而可增加再灌注时的冠脉流量，促进有害物质排出，从而减轻心肌损伤。
二氮嗪(diazoxide，DE)是一种线粒体ATP敏感性钾通道的特异性开放剂，对心肌缺氧损伤后线粒体的膜结构和功能的完整性具有较好的保存作用。将DE添加在心麻痹液中，开放mitoKATP通道，可通过降低线粒体膜电位，对抗线粒体钙超载；调节线粒体基质容积，提高氧代谢率和促进线粒体呼吸；抑制氧应激引起的细胞调亡。
应用该保存液可有效延长器官移植的存活时间，提高移植器官在宿主体内的存活率，还可以减轻缺血再灌注损伤，它可以替代Celsior液应用于包括心脏、肝脏、肾脏等重要脏器的移植。
具体实施方式
实施例1
器官保存液的制备(以配制1000ml为例)：
原材料的准备：甘露醇10.93g；组氨酸4.63g；谷胱甘肽0.92g；谷氨酸钠3.74g；乳酸钠6.90ml；KCl 1.12g；MgCl2 2.64g；0.1mol/L CaCl2 2.5ml；四氢生物蝶呤1.57mg；二氮嗪6.92mg；足量的双蒸水。
制备过程：
具体步骤如下：
分别取四氢生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)作为母液备用；配制0.1mol/L的CaCl2 10ml备用；将800ml双蒸水加入＞1000ml容器中，再依次加入KC1 1.12g、MgCl22.64g、甘露醇10.93g、组氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸钠3.74g，搅拌至颜色变为清晰；加入乳酸钠6.90ml，搅拌至颜色变为清晰；加入0.1mol/L CaCl22.5ml，搅拌至颜色变为清晰；加入备用的母液，搅拌至颜色变为清晰。pH调至7.3～7.5，渗透压调至320Osm/L，双蒸水定容至1000ml，放置4℃低温保存待用。
实施例2
器官保存液在Langendoff离体鼠心灌流和冷保存中的应用
受试对象：雄性SD大鼠(体重230～270g)
将大鼠分为①对照组：离体心脏保存于Celsior心麻痹液中保存，n＝8；②DE+BH4组：离体心脏保存于实施例1提供的器官保存液(下称″本器官保存液″)，n＝8。
实施过程：
大鼠称重后开胸，取出心脏后迅速转移并固定于Langendoff灌流装置上，用改良K-H液行常规逆行恒压灌注(76mmHg)。整个灌注期间温度保持在37℃，灌注液用95％O2+5％CO2饱和。肺动脉跟部切开，是冠脉循环回流液充分引流。切开左心耳，压力传感器与MedLab生物信号采集系统连接。往左心室球囊内缓慢注入适量生理盐水，使左心室舒张末压期压力(LVEDP)维持在6～8mmHg，记录球囊注水量。平衡灌注20～30min后测定心室血流动力学指标。测定完成后，经主动脉根部灌注4℃的Celsior液，灌注时间控制在3min以内，待心脏停跳后置于不同的保存液中，于4℃保存8h后，心脏被重新置于Langendoff装置上灌注60min，灌注条件同保存前保持一致。复灌的前10min作为复苏稳定期，10min后开始测定血流动力学指标。
实施例3
对实施例2所述测定保存前后的心功能指标，结果如下：
表1 冷保存8h后左心室舒张末压期压力(LVEDP)的变化
| Group | LVDEP during reperfusion(％of equilibrium) | ||||
| 20min | 30min | 40min | 50min | 60min | |
| ControlDE+BH4 | 462.58±18.25324.47±19.49* | 451.54±12.01321.31±11.04* | 469.46±15.47317.82±12.74* | 475.82±15.66315.90±16.18* | 482.23±15.63325.83±15.35* |
*p＜0.05 vs control group.冷保存8h后，与单纯的Celsior液相比较，本保存液可显著抑制保存后LVEDP的抬高。
表2 冷保存8h后左心室发展压力(LVDP)的变化
| Group | LVDP during reperfusion(％of equilibrium) | ||||
| 20min | 30min | 40min | 50min | 60min | |
| ControlDE+BH4 | 32.18±10.5979.88±21.81** | 46.72±10.5577.35±19.48** | 43.29±12.8974.47±22.18 | 40.15±11.0967.17±20.93** | 34.59±11.0765.02±18.51** |
**p＜0.05vs control group.冷保存8b后，本保存液促进LVDP恢复的作用明显优于单纯的Celsior液。
表3冷保存8h后冠脉流出量(CF)恢复率的变化
| Group | CF during reperfusion(％of equilibrium) | ||||
| 20min | 30min | 40min | 50min | 60min | |
| ControlDE+BH4 | 54.10±11.5684.594±15.55# | 44.21±7.7284.05±10.75# | 36.15±7.1278.01±16.93# | 30.45±6.4181.67±17.78# | 27.11±7.4374.28±21.55# |
#p＜0.05 vs control group.冷保存8h后，与单纯的Celsior液相比较，本保存液可明显提高CF恢复率。
表5 冷保存8h后乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的变化
| Group | LDH during reperfusion(％of equ ilibrium) | ||
| 3min | 10min | 20min | |
| ControlDE+BH4 | 78.42±11.7652.33±7.81## | 67.58±13.4947.83±7.33## | 69.75±9.5850.52±11.12## |
##p＜0.05 vs control group.冷保存8h后，与单纯的Celsior液相比较，本保存液LDH漏出量明显降低。
实验证明，本器官保存液和Celsior液相比，保存8h后，各项心功能和心肌酶学的指标显著改善，提示本发明中的器官保存液在心脏的保存上优于Celsior液。
实施例4
器官保存液在心脏移植手术中的应用
受试对象：雄性SD大鼠(体重230～270g)
将大鼠分为①对照组：离体心脏于Celsior心麻痹液中保存8h后进行颈部异位移植；②DE+BH4组：离体心脏保存于本器官保存液中保存8h后进行颈部异位移植。
实施过程：
供体手术：将供体鼠以3％戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔内注射麻醉，仰卧固定于手术板上，手术区备皮，常规PVP-I消毒。作腹部正中切口，显露下腔静脉，注入肝素5mg/kg。沿双腋前线开胸至锁骨，将整个胸前壁向上翻起。自下腔静脉快速注入5-6ml冷停跳液，剪开下腔静脉放血，供心停跳后，胸腔内置冰屑。靠近心脏处分别结扎、切断左右上、下腔静脉和双侧肺静脉，切断左、右肺动脉，切断降主动脉和头、臂各动脉，摘取心脏，于0-4℃ 0.9％氯化钠溶液中修剪。剪开肺动脉末端的分叉，将肺动脉末端翻转固定于套管外。剪开头臂动脉末端的分又，于无头臂动脉和左颈总动脉之间结扎主动脉弓，切除其远端部分。
保存：将取下的心脏按照不同的组分别放入4℃celsior液或本器官保存液中保存3h备用。
受体手术：将受体鼠以3％戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔内注射麻醉，仰卧固定于手术板上，手术区备皮，常规PVP-I消毒。自受体鼠胸骨上缘至下颌骨下方做颈部正中切口，显露右颈外静脉，在其第1个属支处结扎，留牵引线备用。切除右侧颌下腺和胸锁乳突肌，游离右侧颈总动脉，以小血管夹夹住近心端，于颈内、外动脉分叉处结扎、切断颈总动脉。近心端动脉用微型剪纵行剪开血管壁1.0mm，将颈总动脉末端分成两部分，8-0尼龙线牵引颈总动脉通过套管，将颈总动脉断端翻转于套管之外。将供心的头臂动脉套在受体颈总动脉套管外，结扎固定。纵行剪开受体的右颈外静脉，将供心肺动脉插入受体右颈外静脉内，结扎固定。开放动脉夹，移植心脏自动复跳或由心室颤动转为正常心搏。仔细放好移植心脏位置后关闭皮肤切口。
受体鼠在术后0.5-2h即可清醒，能爬行、饮水。通过视诊可观察到，本保存液保存后的移植心脏较Celsior液移植心脏的搏动情况好。
实验证明：本器官保存液和Celsior液相比，由于本器官保存液使用一氧化氮合酶辅助因子四氢生物蝶呤可促进NO的合成与释放，中和超氧阴离子，减轻心肌细胞损伤。同时添加了一种线粒体ATP敏感性钾通道的特异性开放剂二氮嗪，对心肌缺氧损伤后线粒体的膜结构和功能的完整性具有较好的保存作用。这些添加的药物可弥补Celsior液的不足，因此，本器官保存液可以替代Celsior液应用于多种器官移植手术中的脏器保存，尤其是心脏。
Claims (2)
1.一种器官保存液，其特征在于，在每1000ml器官保存液中含有：
甘露醇 10.93g； 组氨酸 4.63g； 谷胱甘肽 0.92g；
谷氨酸钠 3.74g； 乳酸钠 6.90ml； KCl 1.12g；
MgCl2 2.64g； 0.1mol/L CaCl2 2.5ml； 四氢生物蝶呤 1.57mg；
二氮嗪 6.92mg； 余量为双蒸水。
2.按权利要求1所述器官保存液的制备方法，其特征在于：按照每1000ml配置量的具体步骤如下：
(1)分别取四氢生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)作为母液备用；配制0.1mol/L的CaCl2 10ml备用；
(2)将800ml双蒸水加入1000ml容器中，再依次加入KCl 1.12g、MgCl2 2.64g、甘露醇10.93g、组氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸钠3.74g，搅拌至颜色变为清晰；加入乳酸钠6.90ml，搅拌至颜色变为清晰；加入0.1mol/L CaCl22.5ml，搅拌至颜色变为清晰；加入备用的母液，搅拌至颜色变为清晰。
(3)pH调至7.3～7.5，渗透压调至320Osm/L，双蒸水定容至1000ml，放置4℃低温保存。
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