CN108902131A - 一种用于离体心脏保存的常温灌注液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于离体心脏保存的常温灌注液，所述灌注液每升含有以下物质：伊桐苷4.5mg、羟基淀粉3g、三磷酸腺苷7.5g、全氟碳化物40g、卵磷脂4.5g，半乳糖苷酶1.25mg，乙酰半乳糖苷酶1mg，二氮嗪2.5mg、组氨酸550mg，色氨酸210mg，谷氨酰胺170mg，精氨酸625mg，青霉素3g，氯化钠15mmol，氯化钾10mmol，氯化镁5mmol，NaHCO₃ 7mmol,CaCl₂ 1.25mmol，辅酶Q10 7mg，维生素B12 6mg。本发明的常温灌注液能修复缺血再损伤对心肌细胞的伤害，降低移植心脏的免疫原性，提高供心的利用率。

Description

一种用于离体心脏保存的常温灌注液

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种用于离体心脏保存的常温灌注液。

背景技术

治疗终末期心脏衰竭患者历经四十年的研究，人造心脏瓣膜、心室辅助装置、以及最新的干细胞疗法等方法依然不足以取代心脏移植手术。心脏移植作为终末期心脏疾病的治疗方法已经被广泛接受，移植效果与供体和受体的健康状况、器官保存的条件、免疫技术及术后治疗等情况有着密切联系，其中，高质量的心脏保存是提高延时心脏移植手术成功率和远期生存率的关键之一。

器官保存技术现己取得了很大进展,肾脏、肝脏、胰脏一般都能超过24小时，但心脏的安全保存时间一般只有4-6小时。这是由于心脏在功能和代谢上与其它脏器有很大差别：首先，心脏在再灌注时必须恢复其90％的功能以维持生命，而其他器官可以允许有数小时至数天来恢复；其次，心脏为高能量依赖器官，维持心脏的活性需要持续的能量供应，而心肌本身并不储存能量，心脏在低温保存时会因缺乏ATP引起大量的肌动蛋白和肌球蛋白相互作用形成牢固的横桥,使心肌发生不可逆收缩；再次，作为心脏保存的开始，心脏必须用停搏液进行停搏；最后，由于心肌及心脏传导系统的特殊性，离子浓度对保存效果影响较大。

目前，在心脏移植临床实践中运用心脏保存液进行低温浸泡保存供体心脏，将供体心脏浸泡于4℃的心脏保存液中，保存期间供体心脏处于低温冷缺血状态，其安全可靠的保存时限为4-6小时。随着供体心脏的冷缺血时间越长，心脏移植术后患者30天生存率降低，并且供体的年龄越大，供体心脏耐受保存期间冷缺血的能力较差。据相关文献报道，在美国心脏移植临床实践中共有167种不同种类的心脏保存液被使用。临床实践中的心脏保存液种类众多，但未有关于何种心脏保存液具有最佳保护效果的共识。HTK液、Celsior液与UW液是临床上常用的三种心脏保存液。

然而，供体心脏的获得往往存在着不确定因素和复杂的环境，较短的保存时间极大的限制了供体心脏的获取范围。这就导致了在心脏移植手术中一直存在供需矛盾，即等待移植的患者数量远远超过供心的数量，许多患者在等待供心移植的过程中未能及时得到救治，解决这种困境的一种有效方法是扩大供心来源和提高供心利用率。Hassanein等提出，脱离降低能量代谢的低温理论而采用常温含氧血连续灌注液在体生理状态保存供心。然而，上述的方法和灌注系统仍然需要采用含血的灌注液进行灌注，由于血液需要来自于供体，这同样也限制了取材的范围。同时，采用含血的灌注液会增加排异反应的风险和感染风险。而且，上述器官呵护系统也无法很好的解决心脏在保存过程中由于缺血再灌注而出现的心肌损伤。

由此可见，提供一种能够防止缺血再灌注损伤，使心脏在长时间离体保存过程中保持良好的生理活性状态的灌注液，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的心脏无法长时间保存问题，提供了一种用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述心脏灌注液含有去除自由基的物质和生物酶，且不含有红细胞。

在一个实施方式中，去除自由基的物质优选为伊桐苷，所述伊桐苷又称为伊桐苷O(Itoside O)，其来源于大风子科栀子皮属落叶乔木—伊桐，为伊桐的活性提取物，属于一个新的链状单萜苷类成分，经波谱方法鉴定为3，7-dimethyl-1，6-octadien-3，10-dihydroxyl-10-O-α-L-arabinopyranosyl(1-6)-O-β-D-glucopyranoside(Chai XY，XuZR，Tang LY，et al.Itoside O，a new linear monoterpene glycoside from the barkand twigs of Itoa orientalis.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2008；17(1)∶79～81)。伊桐苷具有清除自由基，抑制脂质过氧化的作用，可以防止和修复缺氧、缺血或再灌注给细胞带来的损伤。去除自由基的物质还可以是二氮嗪(diazoxide)，二氮嗪是一种选择性的mitoK+ATP通道开放剂，它能够显著改善离体大鼠心肌缺血再灌注后心功能的恢复，减少乳酸脱氢酶(IDH)的释放，具有较好的心肌保护作用。

所述生物酶优选为外切糖苷酶，进一步优选为α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖苷酶，其可以去除细胞表面的血型抗原，例如，A、B抗体，防止心脏移植过程中出现急性排斥反应以及减少慢性排异反应。

在一个实施方式中，所述常温灌注液包含有人工血液，所人工血液优选为人工合成具有携氧功能的氟碳化合物。氟碳代血液是由全氟化合物组成的胶体超微乳剂，具有良好的携氧能力。在一定浓度和氧分压条件下，其氧溶解度为水的20倍，比血液高2倍。作为人工血应用较好的氟碳化合物有全氟正丁基呋喃、全氟三丁胺、氟列昂E4、全氟萘烷、全氟甲基萘烷，全氟三丙胺等。所述人工血液携带氧气，维持心肌细胞的生理功能。优选的，所人工血液为全氟碳化物(PFC)。

在一个实施方式中，所述常温灌注液进一步包含胶体、三磷酸腺苷(ATP)、卵磷脂、氨基酸，抗生素(青霉素)，氯化钠，氯化钾，氯化镁，NaHCO₃，CaCl₂，辅酶Q10，维生素B12。所述胶体优选为PEG、羟基淀粉，所述氨基酸优选为组氨酸，色氨酸，谷氨酰胺或精氨酸的任意一种或其组合。所述抗生素优选为青霉素或氨苄西林或本领域已知的常用的头孢类抗生素。

所述氯化钠，氯化钾，氯化镁，NaHCO3，CaCl2为人体体中的主要电解质成分，可以维持灌注液的渗透压接近与人体的血浆，为心脏提供一个良好的液体环境。

三磷酸腺苷(ATP)为细胞的能量物质，其可以为心肌细胞提供生理所需的相应能量。

组氨酸，色氨酸，谷氨酰胺或精氨酸等物质是人体内重要的氨基酸，是蛋白质和肽的重要组成部分，并且在维持机体酸碱平衡、调节机体免疫机能以及为特定器官、组织甚至细胞的物质和能量代谢提供原料等方面发挥重要作用，并且，组氨酸，谷氨酰胺或精氨酸对于减少心脏缺血再灌注酸均起到一定的作用。

所述卵磷脂对于人工血液的乳化或分散起到辅助作用。所述PEG、羟基淀粉作为胶体可以维持灌注液的渗透压，防止长时间灌注导致心肌细胞出现水肿的现象。抗菌药物青霉素、氨苄西林等，在一定程度上预防感染。辅酶Q10，维生素B12是本领域常用的心肌细胞营养物质，其对于维持心肌细胞的功能起到重要的作用。

在一个实施方式中，所述常温灌注液优选为每升灌注液组成为：伊桐苷3-9mg、胶体2-4g、三磷酸腺苷1-10g、人工血液10-40g、卵磷脂2-6g，半乳糖苷酶1-1.5mg，乙酰半乳糖胺酶1-1.5mg，二氮嗪1-5mg、组氨酸500-900mg，色氨酸150-450mg，谷氨酰胺100-300mg，精氨酸400-700mg，青霉素1-5g，氯化钠1-20mmol，氯化钾5-12mmol，氯化镁3-7mmol，NaHCO₃5-12mmol,CaCl₂ 1-2mmol，辅酶Q10 3-10mg，维生素B12 4-7mg。进一步优选，每升灌注液组成为：伊桐苷4.5mg、羟基淀粉3g、三磷酸腺苷7.5g、全氟碳化物40g、卵磷脂4.5g，半乳糖苷酶1.25mg，乙酰半乳糖胺酶1mg，二氮嗪2.5mg、组氨酸550mg，色氨酸210mg，谷氨酰胺170mg，精氨酸625mg，青霉素3g，氯化钠15mmol，氯化钾10mmol，氯化镁5mmol，NaHCO₃ 7mmol,CaCl₂1.25mmol，辅酶Q10 7mg，维生素B12 6mg。

在一个实施方式中，所述心脏保存的机械灌注系统可以用于保存离体心脏，优选的，所述离体心脏在保存过程中处于搏动状态，进一步优选的，保存温度为常温保存，例如，25℃-37℃。更优选的，所述，离体心脏经历了停博或热缺血，例如，热缺血15-60min。最优选的，离体心脏的保存时间为8-14h。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：本发明的用于心脏保存的常温灌注液采用伊桐苷作为主要成分，使心脏在离体保存中能够防止缺血再灌注损伤，在离体保存过程中保持良好的生理活性状态，同时，本发明的用于心脏保存的常温灌注液在各种成分共同作用下，特别是采用人工血液和外切糖苷酶，能够使心脏在长时间保存后，移植到受体体内，能维持正常的生理活性且免疫原性较低，不会出现急性排异反应。本发明的心脏保存的常温灌注液能够很好的解决心脏供体来源不足和离体心脏无法长时间保存的问题，具有良好的市场前景和社会公益价值。

附图说明

图1：本发明用于心脏保存的机械灌注系统的示意图，其中1:中央处理器模块，2：动力模块，3：心脏存储模块，4：液体循环模块，5：监测模块，6：心脏灌注液存储器，7：蠕动泵，8：心脏存储装置，9：温度调节装置，10：心脏起搏器，11：膜氧合器；12：灌注液过滤装置，13：灌注液输送通道，14：输入导管，15：输出导管，16：温度传感器，17：压力传感器，18：流速传感器，19：心率监测器，20：控制模块，21：数据处理模块，22：信息传输装置；

图2：Bcl-2免疫组化结果图，其中图2A为A组Bcl-2表达的免疫组化结果，图2B为B组Bcl-2表达的免疫组化结果；

图3：Bax免疫组化结果图，其中图3A为A组Bax表达的免疫组化结果，图3B为B组Bax表达的免疫组化结果；

图4：H组和I组的移植心脏的心肌细胞表达B7-1情况；

图5：H组和I组的移植心脏的心肌细胞表达B7-2情况。

具体实施方式

以下通过本发明的最佳实施方式对本发明的心脏保存的常温灌注液的效果进行详细说明，但是，以下内容不应理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1用于心脏保存的机械灌注系统的构成与连接方式

如图1所示，中央处理器模块1与蠕动泵7连接，通过控制模块20控制蠕动泵的输出功率，进一步，蠕动泵7与心脏灌注液存储器6连接，心脏灌注液存储器6通过输入导管14与心脏存储装置8连接，心脏存储装置8中设置有开口，输入导管14可以进入心脏存储装置内部与离体保存的心脏连接。所述蠕动泵7通过输出功率的变化控制灌注液的灌注压力和流速，所述心脏灌注液存储器内壁设置有冷热调节管，所述冷热调节管由控制模块20控制，用于调节灌注液的温度。所述心脏存储装置8与心脏灌注液存储器6存在势能落差，具体的，心脏灌注液存储器高于心脏存储装置20cm。进一步，所述心脏存储装置8与心脏灌注液存储器6之间还设置有膜氧合器11，所述膜氧合器11分别与控制模块20、蠕动泵7，心脏灌注液存储器6连接，并通过控制模块20控制灌注液的氧合效率。所述心脏存储装置8底部设计成U形槽，且与水平面呈45°的倾斜面。心脏存储装置8通过输出导管15与灌注液过滤装置12连接，心脏存储装置8中设置有开口，输出导管15可以进入心脏存储装置内部与离体保存的心脏连接；所述灌注液过滤装置12与心脏灌注液存储器6连接，将过滤完成的灌注液回送至心脏灌注液存储器6；所述心脏存储装置中还设置有心脏起搏器10，用于心脏的起搏，所述起搏器与控制模块20连接。进一步，灌注系统设置有温度传感器16、压力传感器17和流速传感器18和心率监测器19，所述温度传感器分别16与心脏存储装置8、心脏灌注液存储器6中连接，用于监控心脏离体保存时的温度和灌注温度；所述压力传感器17与蠕动泵7、心脏存储装置8、心脏灌注液存储器6和膜氧合器11连接，用于监控灌注过程中的灌注压力和氧合效率；所述流速传感器18与蠕动泵7、心脏存储装置8、心脏灌注液存储器6连接，用于监控灌注过程中的灌注液流速；所述心率监测器19与心脏存储装置8连接，用于监控离体心脏的心率状态；所述温度传感器16、压力传感器17和流速传感器18和心率监测器19均与数据处理模块21连接，将收集的数据传输至中央处理器模块1。所述的中央处理器模块1还包括信息传输装置22，可以将所述监测模块5监测到的数据参数，传递给外部对应的接收装置。进一步，所述心脏灌注液存储器6中存储有心脏灌注液，所述心脏灌注液为每升灌注液组成为：伊桐苷3-9mg、胶体2-4g、三磷酸腺苷1-10g、人工血液10-40g、卵磷脂2-6g，半乳糖苷酶1-1.5mg，乙酰半乳糖胺酶1-1.5mg，二氮嗪1-5mg、组氨酸500-900mg，色氨酸150-450mg，谷氨酰胺100-300mg，精氨酸400-700mg，青霉素1-5g，氯化钠1-20mmol，氯化钾5-12mmol，氯化镁3-7mmol，NaHCO₃ 5-12mmol,CaCl₂1-2mmol，辅酶Q10 3-10mg，维生素B12 4-7mg。

实施例2供体心脏的获取与灌注

1实验动物

雄性中华小型猪6-10头，体重30±3Kg。所有的实验动物均受到人道主义对待,符合美国国立卫生院颁布的《实验动物管理和使用指南》，实验方案获得相关实验动物伦理委员的许可。

2.方法

(1)实验动物术前禁食禁水8小时。肌肉注射戊巴比妥钠进行诱导麻醉，称取体重并记录。四肢固定，建立右侧耳缘静脉通路。打开上下颌显露咽喉，使用喉镜挑起会咽，插入气管插管，连接呼吸机进行辅助呼吸，潮气量保持15ml/kg，呼吸频率保持15-18次/分钟，吸入氧浓度保持100％。四肢粘贴电极片，并接入心电监护仪进行监测。

(2)心脏获取：取正中位劈骨开胸，开胸器撑开，电刀切开心包，充分暴露心脏各主要血管，依次备线待结扎各动静脉，主动脉接近根部处荷包固定灌注针，敷无菌冰屑并以150mmHg左右压力灌注ST.Thomas液1000ml，灌注时间3分钟左右，灌注时将一定量无菌冰屑放入心腔，降低心肌局部温度避免损伤。供心灌注至停跳并完全发白，停跳心脏处于舒张期，同时剪断上下腔静脉、肺动脉、肺静脉等，获取心脏修剪血管后称重。

(3)机械灌注系统的预热：采用实施例1中所述的机械灌注系统，开启系统，使灌注液温度和心脏存储室的温度维持在36.5℃，使灌注保存系统运转等待接入供心。

(4)离体心脏接入灌注系统：主动脉处缝合灌注导管，低流量灌注氧合灌注液，灌注液沿导管壁慢慢流入心腔，同时，挤压心腔排净空气后，对接灌注道导管持续灌注，经肺静脉和二尖瓣置入左室引流管，经肺动脉置入右室引流管，左右引流管中灌注液经输出导管到进入灌注液过滤装置进行过滤，并回流至心脏灌注液装置。

(5)心脏复博：待连接完成后，调整灌注压保持40±5mmHg，灌注量保持40-50ml/min，并保持灌注液温度为36.5℃。心脏恢复灌注并逐步复温实现自动复跳，心脏灌注保存出现室颤时，及时采用起搏器电击除颤，恢复正常窦性心律。

(6)灌注保存：利用心率检测装置实时监测心脏状态，使心脏维持跳动保存。每4h采取等量置换的方法放出200ml灌注液并添加200ml新鲜灌注液。

实施例3伊桐苷对机械灌注离体保存心脏的影响

伊桐苷具有清除具有自由基，抑制脂质过氧化的作用，可以防止和修复缺氧、缺血或再灌注给细胞带来的损伤。为了探究伊桐苷对机械灌注离体保存心脏的影响，本实施例设计两种不同的心脏灌注液，具体成分如表1所述：

表1灌注液A和灌注液B的成分构成(1L)

1.灌注方法

雄性中华小型猪6头，体重30±3Kg。随机分组两组，A组和B组，每组3只。A组采用灌注液A进行灌注保存，B组采用灌注液B进行灌注保存，供体心脏的获取与灌注参见实施例2，供体心脏在体外机械灌注8小时。

2.心脏状态的检测方法

2.1心肌含水量测定

实验各组停机后，留取左心室前壁的一块心肌，用滤纸拭干，称取湿重后置于80℃烘箱中烘烤48小时，称心肌干重。心肌含水量＝(湿重-干重)/湿重X100％。

2.2磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(Tn T)的测定

实验各组分别留取停机后1-5分钟输出导管流出的心脏灌注液，3000r/min离心15分钟，取上清液注入EP试管内,用全自动生化分析仪统一测定其中磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(Tn T)的含量作为评价心肌损伤的指标。

2.3心肌组织ATP含量和丙二醛(MDA)含量的测定

(1)实验各组停机后留取小块左心室心肌组织，立即投入液氮中冻存。用ATP检测试剂盒进行免疫荧光法测定，通过标准曲线计算样本中ATP浓度。

(2)实验各组停机后切取左心室心肌组织，10％福尔马林固定，加入0～4℃的0.9％生理盐水，低温手工研磨制备10％的组织匀浆，低温离心10分钟(3000r/min)，取上清液加入MDA试剂。MDA:按照说明书配制试剂并按照其要求的顺序依次加入，充分混匀，置入95℃水浴40分钟，流水冷却后以3500～4000r/min离心10分钟，取上清液，于532nm波长处，蒸馏水调零，比色测定各管吸光度值，按公式计算MDA含量。

2.4心肌细胞原位调亡检测

实验各组停机后取心肌组织甲醛固定，在病理科进行心肌组织常规石蜡包埋处理后，将蜡块制成厚的切片，将切片轻轻用多聚赖氨酸载玻片搜起，放置于37℃的烤片机烤干后，于检测前再放入60℃的烤箱内烤片2小时左右，采用原位末端标记(TdT-mediated dUTPnick end labeling，TUNEL)法测定心肌细胞凋亡情况，并计算心肌细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)。

2.5心肌细胞Bax和Bcl-2检测

实验各组停机后取心肌组织甲醛固定，在病理科进行心肌组织常规石蜡包埋处理后，将蜡块制成厚的切片，将切片轻轻用多聚赖氨酸载玻片搜起，放置于37℃的烤片机烤干后，于检测前再放入60℃的烤箱内烤片2小时左右，采用本领域常规的免疫组化方法，用BaxRB-9206(兔来源的多克隆抗体)和Bcl-2Ab-4MS-598(大鼠来源的单克隆抗体)测定心肌细胞Bax和Bcl-2的含量。

2.6统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，多组间均数比较采用单因素方差。P＜0.05为差异有统计学意义。

3.实验结果

A组与B组灌注8小时后，心肌含水量、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(Tn T)含量、心肌组织ATP含量和丙二醛(MDA)含量如表2所示

表2A组与B组的心肌组织中含水量、CK-MB、TnT、ATP和MDA

从表2显示的结果可以看出，采用含有伊桐苷的灌注液灌注8小时后(A组)，心肌组织中含水量、CK-MB、TnT、ATP和MDA的含量指标均优于不含有伊桐苷的灌注液灌注8小时后(B组)的结果，可见，伊桐苷对于清除自由基，减少心肌细胞的再灌注损伤以及维持离体心脏良好的状态有着积极的作用。

A组与B组灌注8小时后，心肌细胞凋亡指数以及心肌细胞Bax和Bcl-2的含量如表3。

表3A组与B组的心肌细胞凋亡指数以及心肌细胞Bax和Bcl-2含量

各组猪心保存后均发生了细胞凋亡，但是B组的凋亡比例明显高于A组，Bax和Bcl-2均与心肌细胞的凋亡密切相关，Bcl-2表达越强，心肌细胞凋亡率则越低，而Bax则与凋亡负相关。从表2和图2-3中可以看出，A组的心肌细胞Bcl-2表达较高，Bax表达则相对较低，这也说明了A组的心肌细胞凋亡较少。由此可见，伊桐苷对于减少离体保存过程中心肌细胞的凋亡，也起到了积极的作用。

实施例4心脏灌注液不同成分配比对于心脏保存的影响

为了探究心脏灌注液不同成分配比对于心脏保存的影响，本实施例设计3种不同的心脏灌注液，具体成分如表4所述：

表4灌注液C、灌注液D、灌注液E的成分构成(1L)

1.灌注方法

雄性中华小型猪9头，体重30±3Kg。随机分组三组，C组、D组、E组，每组3只。C组采用灌注液C进行灌注保存，D组采用灌注液D进行灌注保存，供体心脏的获取与灌注参见实施例2，供体心脏在体外机械灌注8小时。

2.心脏状态的检测方法

对于离体保存8小时后的实验各组进行心肌含水量、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(Tn T)含量、心肌组织ATP含量和丙二醛(MDA)含量的测定，同时设置对照组，采用未进行保存的心脏组织进行上述指标的测定，测定方法采用实施例3中记载的相应方法。

3.实验结果

C组、D组、E组灌注8小时后，心肌含水量、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(TnT)含量、心肌组织ATP含量和丙二醛(MDA)含量如表5所示

表5C组、D组、E组的心肌组织中含水量、CK-MB、TnT、ATP和MDA的含量

从表5显示的结果可以看出，虽然与未保存的心脏相比，离体机械灌注后的心脏，在各项指标的检测中，均存在一定的差异，但是，这种差异并不显著，特别是灌注液D，在机械灌注保存离体心脏8小时后，其心肌组织中含水量、CK-MB、TnT、ATP和MDA的含量与未保存的心脏相比，差异较小，这说明灌注液D中各种成分的配比能很好的保存离体心脏。另外，从C组、D组、E组之间的表可以看出，将伊桐苷的含量限定在3.5-6mg，适当的增大ATP、PFC以及卵磷脂的含量，可以较好保护离体心脏。

实施例5不同的灌注时间对离体心脏保存的影响

为了探究灌注液D在不同灌注时间下，对于离体心脏的保护作用，本实施例采用实施例2的心脏获取和灌注方法，利用灌注液D分别灌注12小时和14小时。

1.灌注方法

雄性中华小型猪6头，体重30±3Kg。随机分组两组，F组和G组，每组3只。F组和G组均采用灌注液D进行灌注保存，供体心脏的获取与灌注参见实施例2，F组供体心脏在体外机械灌注12小时，G组供体心脏在体外机械灌注14小时。

2.心脏状态的检测方法

对于离体保存12小时和14小时的实验各组进行心肌含水量、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(TnT)含量、心肌组织ATP含量和丙二醛(MDA)含量的测定，测定方法采用实施例3中记载的相应方法。

3.实验结果

F组灌注12小时后，G组灌注14小时后，其心肌含水量、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白-T(TnT)含量、心肌组织ATP含量和丙二醛(MDA)含量如表6所示

表6F组、G组的心肌组织中含水量、CK-MB、TnT、ATP和MDA的含量

结合表6和实施例4中D组的实验结果(灌注液D灌注8小时)可知，随着灌注时间的延长，心肌的含水量、CK-MB、TnT、MDA的含量均有所增加，而ATP的含量有所下降，但是从表6中的数据可以看出，各个指标增加和下降的幅度较小。这说明，在灌注液D的作用下，离体心脏在长时间灌注下，仍能保持较为良好的生理状态。

实施例6离体保存心脏的移植

为了进一步探究本发明机械灌注系统离体保存的心脏，移植到体内的效果，本实施采用实施例6中采用灌注液D进行灌注保存12小时的F组心脏和灌注保存14小时的F组心脏进行移植。

1.实验动物

雄性中华小型猪6头，体重30±3Kg。随机分组两组，每组3只，作为供体移植供体，其中，H组：接收F组心脏移植；I组：接收G组心脏移植。

2.移植方法

受体麻醉采用基础诱导后全麻气管插管。右股动静脉置管用于监测动脉血压和补液给药支持,连接心电监测导线,持续心电监测。按照双房标准原位心脏移植的方法建立体外循环,修剪供心,保留部分右心房和部分左心房移除受体心脏。心脏移植吻合顺序两组相同均为:左心房全部,1/2右心房,2/3肺动脉干,主动脉全部,剩余的右心房和肺动脉干。在移植过程中两组供心左心室的减压方法均为经心尖部置入带侧孔的减压引流管。在移植过程中均需调整两组主动脉灌注管的位置由右侧头臂静脉到供心主动脉的根部。在开放受体主动脉阻断钳时,在受体体外循环灌注液中加入注射用甲拨尼龙玻珀酸钠500mg和利多卡因注射液l00mg。,复温后主动脉开放后如果供心没有心电活动,给予心脏按摩,出现心室纤颤时给予5-10焦耳的能量除颤处理,直到心脏恢复正常的窦性心律。

3.H组和I组供心移植后心功能恢复的情况

H组和I组供心移植后心功能恢复的一般情况下见表7,

表7H组和I组供心移植后心功能恢复情况

从表7的数据可以看出，H组和I组的心脏在移植后，均可以保持/自动恢复窦性心律，并且移植两周后，均能够成功脱离呼吸机。虽然,I组一例主动脉开放后自动恢复窦性心律但出现心动过速,后出现室颤,除颤一次后恢复窦性心律，且成功脱机。移植两周，未发现H组和I组的心脏移植后出现急性排异反应。从以上结果可以看出，灌注液D的作用下，离体心脏在长时间灌注下，仍能够达到心脏移植的要求。

实施例7灌注液D灌注保存的离体心脏对移植心脏免疫原性的影响

急性排斥反应(AR)一般在移植后数天至两周左右出现，80％一90％发生于移植后的一个月内,是临床上同种器官移植中最常发生的排斥反应,近50％的移植病人发生AR,也是影响手术能否成功的关键之一。为了探究灌注液D灌注保存的离体心脏对移植心脏免疫原性的影响，本实施例采用荧光定量PCR的方法对实施例6中H组和I组的移植心脏中B7-1和B7-2的表达情况进行分析。

1.实验对象

H组和I组的移植心脏；对照组：雄性中华小型猪3头，体重30±3Kg，未进行移植的心脏。

2.实验方法

2.1总RNA提取

切取H组和I组的移植心脏和对照组心脏，每份标本取含冠状血管的心脏组织约50mg,采用Trazol法提取总RNA。

2.2cDNA的合成

采用cDNA合成试剂盒进行反转录((北京天根生化科技公司)

2.3采用荧光定量PCR检测B7-1和B7-2的表达

(1)引物合成

B7-2的检测引物为F：5’-CTTGTTCCTATCCACCAGATGAGTT-3’；

R:5’-GGGAAGAGAGCACCCTGATTGATAC-3’；

B7-1的检测引物为F：5’-CCTGTCAGACAATGGCACCTA-3’；

R:5’-GGGAAAGCATCGTGTGTGGTA-3’；

β-actin的检测引物：F：5’-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3’；

(对照)R:5’-CTTCTGACCCATACCCACCA-3’

(2)荧光定量PCR的检测

荧光定量PCR反应体系的构建如表8所示

表8荧光定量PCR反应体系

PCR反应程序为：95℃预变性90s；然后43个循环的95℃变性15s，退火58℃、20s，72℃延伸10s；最后72℃、5min，4℃保温；

反应完成后，利用iCycler软件自动生成标准曲线,进一步调整基线循环和反应阈值，利用iCycler软件以及标准曲线,确定各待测样品的Ct值。

3.实验结果

B7-1是由288个氨基酸组成的分子量为60kDa的I型跨膜糖蛋白，其中包括19个氨基酸的胞内段；B7-2是由329个氨基酸组成的分子量为70kDa的I型跨膜糖蛋白,两个蛋白有25％的同源性且均定位于染色体，B7-2作用于免疫应答的起始期，而B7-1则在调节持续期调节活化进程，当着两个标志物表达升高时，意味着机体的免疫反应增强。从图4-5的结果可以看出，H组和I组的移植心脏中B7-1和B7-2的表达与对照组心脏中B7-1和B7-2的表达类似，无较大差异。可见，灌注液D减轻了移植心脏的免疫原性，有利于减轻或延缓急性排异的发生。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 嘉兴莱普晟医疗科技有限公司

<120> 一种用于离体心脏保存的常温灌注液

<130> CP11802406C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttgttccta tccaccagat gagtt 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggaagagag caccctgatt gatac 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgtcagac aatggcacct a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggaaagcat cgtgtgtggt a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacggctccg gcatgtgcaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttctgaccc atacccacca 20

Claims (10)

1.一种用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述灌注液含有伊桐苷，外切糖苷酶和人工血液。

2.权利要求1所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述伊桐苷的含量为3-9mg，优选为4.5g。

3.权利要求1或2所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述外切糖苷酶为为α-半乳糖苷酶和/或α-N-乙酰半乳糖苷酶。

4.权利要求1或3所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述人工血液优选为人工合成具有携氧功能的氟碳化合物；优选的，所述氟碳化合物为全氟正丁基呋喃、全氟三丁胺、氟列昂E4、全氟萘烷、全氟甲基萘烷或全氟三丙胺；优选的，所述人工血液为全氟碳化物。

5.权利要求1-2任意一项所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述灌注液包含胶体、三磷酸腺苷、卵磷脂、氨基酸，抗生素，氯化钠，氯化钾，氯化镁，NaHCO₃，CaCl₂，辅酶Q10，维生素B12。

6.权利要求1-5任意一项所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述胶体选自PEG或羟基淀粉。

7.权利要求1-6任意一项所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述氨基酸选自组氨酸，色氨酸，谷氨酰胺或精氨酸的任意一种或其组合。

8.权利要求1-6任意一项所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述灌注液每升含有以下物质：伊桐苷3-9mg、胶体2-4g、三磷酸腺苷1-10g、人工血液10-40g、卵磷脂2-6g，半乳糖苷酶1-1.5mg，乙酰半乳糖苷酶1-1.5mg，二氮嗪1-5mg、组氨酸500-900mg，色氨酸150-450mg，谷氨酰胺100-300mg，精氨酸400-700mg，青霉素1-5g，氯化钠1-20mmol，氯化钾5-12mmol，氯化镁3-7mmol，NaHCO₃ 5-12mmol,CaCl₂ 1-2mmol，辅酶Q10 3-10mg，维生素B124-7mg。

9.权利要求1-8任意一项所述的用于心脏保存的常温灌注液，其特征在于，所述灌注液每升含有以下物质：伊桐苷4.5mg、羟基淀粉3g、三磷酸腺苷7.5g、全氟碳化物40g、卵磷脂4.5g，半乳糖苷酶1.25mg，乙酰半乳糖苷酶1mg，二氮嗪2.5mg、组氨酸550mg，色氨酸210mg，谷氨酰胺170mg，精氨酸625mg，青霉素3g，氯化钠15mmol，氯化钾10mmol，氯化镁5mmol，NaHCO₃7mmol,CaCl₂ 1.25mmol，辅酶Q10 7mg，维生素B12 6mg。

10.权利要求1-9任意一项所述的用于心脏保存的常温灌注液的用途，其特征在于，所述心脏保存的常温灌注液可以用于保存离体心脏，优选的，所述离体心脏在保存过程中处于搏动状态，进一步优选的，保存温度为常温保存，例如，25℃-37℃；最优选的，离体心脏的保存时间为8-14h。