CN101199273B

CN101199273B - 一种新型多器官储存保护液

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Publication number: CN101199273B
Application number: CN2006101241693A
Authority: CN
Inventors: 谭敦宪
Original assignee: Individual
Current assignee: Tan Dunxian
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2026-12-13
Also published as: CN101199273A

Abstract

本发明为“一种新型多器官储存保护液”，属于生物医学技术领域中器官移植部分。器官移植关键步骤是器官储存，决定了移植成败。器官储存过程中出现了缺血与再灌注现象，导至大量自由基生成造成储存器官氧化损伤。该发明创造性的应用了褪黑素(melatonin)、维生素C和水溶性维生素E组成的抗氧化系统，用以降低器官储存过程中自由基生成导致的氧化损伤；用甘露醇维持溶液渗透压与降低溶液粘滞度；使用低浓度葡萄糖以适应器官最低代谢要求。实验表明，本发明对多器官储存效果显著优于目前国际，国内广泛应用的器官储存液(UW液)。该发明用于离体肾脏、肝脏、胰腺、心脏和肺移植前的储存，延长有效储存时间，提高移植成功率，使更多患者获得器官移植机会。

Description

一种新型多器官储存保护液

技术领域：本发明是生物医学技术器官移植领域中一种新型多器官储存保护液。

背景技术：器官移植是某些疾病最终治疗手段，通过器官移植，全世界每年数以万计的患者得以延续生命。器官移植中一个非常关键的步骤是离体器官的储存保护，在很大程度上决定了器官移植成败。原则上器官移植要求移植一个活的器官。但是，以手术从其它供体上切取、已没有血液供应的器官(大多数供体为死亡者)不可能马上就移植到患者体内，必然有一个储存转运过程，而在35～37℃的常温下，储存器官的细胞仍进行缺氧代谢，引起细胞内酸中毒、线粒体产能障碍、细胞内钙超载、细胞肿胀、大量自由基生成，最终导至供移植用器官不可逆病理变化或死亡。因此，要延长供移植用器官储存时间的关键在于中断血液循环后尽量减低细胞缺氧代谢，预防自由基导致的氧化损伤，使储存器官病理变化降到最低。

目前通用移植用器官储存方法是冷储存法，也叫单纯低温灌洗保存法。将切取的器官，用一种特制的冷溶液(0～4℃)先作短暂的冲洗，使其中心降温到10℃以下，然后储存于2～4℃直至移植。1969年Collins等人应用“仿细胞内液型”溶液(是一种高钾、高镁而低钠的高渗溶液)作储存液，临床上能安全地保存人肾20～24小时，移植后肾功能恢复良好。国际上运用仿细胞内液型溶液原理而研制的通用储存液有Collins C2液、欧洲Collins液(Euro-Collins)、Ross液、我国上海的的HC-A液和武汉的WMO-1号液。但是，Collins类型储存液对肝、胰腺等其他脏器冷保存时间远没有肾那样长，肝不能超过10小时，胰腺宜在6小时内，极不理想，也说明此种储存液对器官保存有特异性。1988年美国Wisconsin大学的Belzer教授创制了一种新器官储存液，为纪念学校而取名为University Wisconsin solution(UW液)。UW液的特点有：①不含葡萄糖，而用乳糖盐作为非渗透阴离子，加棉糖作为附加的渗透支持。②含羟乙基淀粉，作为有效胶体发挥其渗透压力，可以阻止有害的细胞间隙扩大。③以磷酸盐预防酸中毒。④用谷胱甘肽、别嘌呤醇对抗氧自由基。UW液的研制成功极大地延长了移植器官对低温缺血耐受时间，肾脏储存时间可达72小时、肝脏储存可达48小时、但心脏保存一般不超过4～6小时。UW液在欧洲做了广泛的临床试验，结果发现UW液对器官保存明显优于Euro-Collins液。UW液对供体器官功能的损害从Euro-Collins液的33％下降到23％。UW液及其各种UW型改良液已在国际上日益广泛应用，已经替代了和正在替代其它类型的储存液。UW液的组成见表一。

但是，UW液也还存在许多不足之处。总体而言，UW液对肝脏、肾脏和胰腺的保存比较成功，而对心脏和肺的保存效果还有待进一步研究。Oppell和Pfeiffer等实验证明，UW液对冠状血管内皮细胞有损害，对心肌细胞的保护效果不如HTK液，并推测UW液的高钾(125mmol/L)特点可能是其对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成损害的直接原因。UW液的高粘滞性也可对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成损害。除了心脏外，UW液对其它离体移植器官的保护作用也还有很大改进余地。UW液最主要的缺点为其粘滞性过高，抗氧化作用弱和价格昂贵。为了满足器官移植工作发展需要，急需研发适合我国国情的有效器官储存液。本发明根据近年来国际上器官储存液研制方向并结合多年来我们在医学与抗氧化领域的研究成果，发明了一种新型高效离体器官储存保护液。

发明内容：UW液最主要的缺点为其抗氧化作用弱、粘滞性过高、对离体心脏和肺保存效果不好，并由于UW液中含有非天然大分子物质(羟乙基淀粉)所以在器官移植前要将器官储存液冲洗干净，这一过程不但增加了器官移植前操作步骤还有可能进一步损伤离体器官。申请人通过理论分析与实验检验，发明了一种新型高效多器官储存保护液，使离体肾脏、肝脏、胰腺、心脏和肺的有效储存时间显著的超过了UW液的有效储存时间。本发明新型高效多器官储存保护液组成见表二。

本发明创造性1：用褪黑素(melatonin)、维生素C和水溶性维生素E替代了UW液中的谷胱甘肽和别嘌呤醇作为抗氧化剂。谷胱甘肽虽然有很强的抗氧化作用，但是，它是一种三肽，不容易透过细胞膜，所以很难发挥细胞内抗氧化作用。别嘌呤醇能清除羟基自由基但对其它自由基清除作用有限。由于上述缺点限制了谷胱甘肽和别嘌呤醇在离体器官储存保护液中的抗氧化作用。新型抗氧化剂褪黑素能自透过细胞膜进入细胞每一部位，维生素E主要分布细胞膜，维生素C主要分布细胞浆。褪黑素在细胞膜及细胞浆内都能清除其中的自由基，然后失去一个电子形成褪黑素自由基，维生素C可提供一个电子给褪黑素自由基，使还原成有抗氧化功能的褪黑素，而失去一个电子的维生素C自由基又在细胞浆内接受谷胱苷肽提供的一个电子，还原成有抗氧化功能的维生素C。所以，维生素C、维生素E和褪黑素实际上在机体内形成了一个共同抗氧化网络，极大提高了各自抗氧化能力。在抗氧化网络中，由于褪黑素能在细胞浆内和细胞膜上均匀分布，起到了联系细胞浆中的维生素C与细胞膜中维生素E的桥梁作用。根据以上理论分析，申请人产生了一个创造性思维，首次明确提出，以褪黑素、维生素C和维生素E的组合用于作为器官储存液的抗氧化成份，用以保护离体器官储存中的氧化损伤。

本发明创造性2：用甘露醇替代了UW液内羟乙基淀粉和棉子糖以维持离体器官储存保护液的渗透压。WU液中的羟乙基淀粉为非天然大分子物质。虽然羟乙基淀粉可以维持离体器官储存液的胶体渗透压，但是增加了液体的粘滞度，使离体器官灌注速度减慢、增加器官的灌注时间；并且，羟乙基淀粉为非天然大分子物质不宜进入体内，在器官移植前要将其冲洗干净，这一过程不但增加了器官移植前的操作步骤还有可能进一步损伤离体器官。甘露醇为小分子物质，粘滞度底、不被细胞代谢、进入机体后由肾脏排出体外、对身体无害。有鉴如此，申请人产生了一个创造性思维，首次明确提出用甘露醇维持离体器官储存液的渗透压。这样不仅降低离体器官储存保护液的粘滞度、有利于灌注液并且移植前也不需冲洗器官减少了操作步骤。另外甘露醇为国产，价格便宜，从而大大降低了生产成本，减少患者负担。

本发明创造性3：在离体器官储存保护液加入了低浓度葡萄糖以适应低温保存器官的最低代谢要求。UW液不含葡萄糖，虽然可以减少糖代谢引起的耗氧但阻滞了细胞的能量代谢。

具体实施方式：器官离体后由于终断了血液供应，细胞缺氧导致离体器官缺血与再灌注氧化损伤。组织器官内反映氧化损伤的脂质过氧化物(LPO)以及一氧化氮自由基(NO)的水平将增高。由于缺氧，细胞不能进行有效氧化-磷酸化，细胞内ATP含量将大幅度降低，进而导致离体器官细胞程序性死亡(APOPTOSIS)。上述病理变化如果严重将影响移植器官成活、降低手术成功率。本发明的具体实施方式就是将新型多器官储存保护液与目前国内外公认的多器官储存液(UW液)作比较，观察两种储存液对Sprague Daley(SD)大白鼠离体肾脏、肝脏、胰腺、心脏和肺储存过程中不同时间细胞膜脂质过氧化(LPO)、细胞内一氧化氮自由基(NO)含量，ATP水平以及细胞程序性死亡(APOPTOSIS)等指标的影响，然后将这些指标与正常指标相比较。

用不同储存液所保存器官指标变化愈小，显示其器官储存保护效果愈好、器官移植手术愈容易获得成功。将SD大白鼠分为正常对照组(组一)，磷酸缓冲液对照组(组二)，新型多器官储存保护液实验组(组三)与UW液实验组(组四)。正常对照组8只大白鼠，处死动物后将各器官立即储藏于-80℃冰箱内供分析用。其余三组在不同时间点分别收集不同器官。储存时间选择分别为肾脏72至96小时；肝脏、胰腺、48至60小时；心脏和肺6至12小时。所需大白鼠数为：组一为8只，组二、组三与组四分别为8只。共8×4＝32只。详细步骤及检测方法见实施方案。

实施方案

一、材料与方法

1.化学试剂大部化学试剂均购自美国Sigma化学试剂公司(Sigma Chemicals，St.Louis，MO，USA)，均为高效液相纯(HPLC)级。一升装UW液购自美国威斯康辛大学(University ofWisconsin)，各分析试剂盒产地见正文。本发明新型多器官储存保护液按表二配方配制。两种器官储存保护液均置于4℃冰箱备用。

2.动物雄性SD大白鼠，体重250-300克，购自广东省医学实验动物中心。分为正常对照组(组一，大白鼠8只)；磷酸缓冲液对照组(组二，8只)，新型多器官储存保护液实验组(组三，大白鼠8只)与UW液实验组(组四，大白鼠8只)。

3.器官收集颈椎离断处死大白鼠，迅速打开胸腔，用大号(18号)针头插入左心室(针头连结灌流瓶)立即灌流，灌流液由切开的腹主静脉流出。灌流瓶高度离心脏120厘米(CM)，组一大白鼠用4℃生理盐水灌流2分钟，然后迅速收集各器官储藏于-80℃冰箱内供分析用。组二，三和组四的大白鼠先用4℃生理盐水灌流2分钟，然后分别用4℃的磷酸缓冲液、离体器官储存保护液和UW液灌流2分钟，再将各器官储藏于各自的储存液于4℃保存。在时间点6与12小时分别在组二、组三和组四取出心脏和肺；48与60小时取出肝脏和胰腺；72及96小时取出肾脏。器官取出后立即储藏于-80℃冰箱内供分析用。

4.分析方法

A.脂质过氧化物(LPO)分析方法：LPO测试剂为LPO-586kit药盒，购至Calbiochem公司(LaJolla，CA，USA)。分别取各器官组织100毫克(mg)于1毫升(ml)4℃Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中匀浆。匀浆液离心10分钟，离心速度为3000转/分钟。然后抽取0.2毫升(ml)上清液与LPO测试剂于45℃温育40分钟，反应液在586纳米(nm)区由可见光比色仪比色。LPO含量表示为丙二醛(MDA)nmol/g组织。

B.一氧化氮(NO)分析方法：亚硝酸/硝酸根离子(nitrite/nitrate)为一氧化氮稳定代谢产物，本实验采用nitrite/nitrate作为反应离体器官一氧化氮水平指标。分别取各器官组织150毫克(mg)于1毫升(ml)4℃Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中匀浆。匀浆液离心10分钟，离心速度为3000转/分钟。然后抽取0.1毫升(ml)上清液与Griess反应剂(一氧化氮测试盒，南京建成生物工程研究所)在4℃反应40分钟；反应液离心10分钟，离心速度为10,000转/分钟，然后测定上清液在540nm处的光密度(测定方法按照一氧化氮测试盒说明书).一氧化氮含量表示为nitrite/nitrate微克/克组织(μg/g tissue)。

C.ATP(三磷酸腺苷)分析方法：用高效液相(HPLC)方法测定离体器官ATP含量。分别取各器官组织150毫克(mg)于1.5毫升(ml)Perchloric酸[4℃，0.6当量(N)浓度]中匀浆。匀浆液于4℃静置1小时，然后用1.0毫升(ml)1摩尔(mol/l)浓度的K₂HPO₄溶液中和。反应液离心15分钟，离心速度为10,000转/分钟，上清液经过0.2毫米的滤膜过滤，取50微升滤过液用HPLC测定.HPLC的条件为检测波长254纳米(nm)，分析柱18炭(C-18)反相，流动相为160毫摩(mM)KH₂PO₄与100毫摩(mM)KCl组成的缓冲液(pH 6.5).ATP的变化用％表示。

D.细胞的程序性死亡(APOPTOSIS)分析方法：细胞的程序性死亡的一个重要特征是细胞内DNA断裂，本实验用TUNEL法检测细胞内DNA断裂，用以分析离体器官细胞程序性死亡。用磷酸缓冲液(含4％paraformaldehyde)固定器官横段面连续(4片)冰冻切片，切片厚度为12微米(μm)，24小时后，用不含paraformaldehyde的磷酸缓冲液将切片清洗干净，然后将清洗固定好的切片在37℃与TdT和含有共轭荧光素的12-dUTP(Roche，Mannheim，Germany)一起培育1小时；将荧光染色的切片用Vectashield mounting medium(Vector Laboratories，Burlingame，CA)复盖，在Zeiss荧光显微镜下观察荧光染色细胞的数量。荧光染色的细胞代表程序性死亡的细胞，单位以“荧光染色细胞数/视野”表示。

统计学处理：数据表达为平均值加减标准误本(mean±SEM)，统计处理的方法为方差分析(ANOVA)与t-检验，p＜0.05被认为统计学上存在着显著的差异。

二、结果

A.本发明多器官储存保护液与UW液对离体心脏和肺的影响：实验结果显示，随着心脏和肺储存时间延长，心脏和肺组织损伤越来越严重，表现为在6与12小时用磷酸缓冲液储存心脏和肺的LPO与NO含量显著高于对照组。反映了心肌和肺细胞内自由基含量升高并由此导致心肌和肺细胞膜损伤。心脏和肺组织内ATP含量显著下降，反应了心肌和肺能量代谢出现障碍。大量心肌和肺细胞出现了程序性死亡。这些指标的变化提示用磷酸缓冲液储存的心脏和肺在6小时后已不适合器官移植。而用本发明多器官储存保护液与UW液储存心脏和肺在6小时时上述各项指标变化与正常对照组相比无显著性差异，提示用本发明多器官储存保护液与UW液储存的心脏和肺在6小时时仍适合器官移植。12小时时，UW液储存心脏和肺的LPO，NO与细胞程序性死亡明显升高，组织ATP含量降低，此时用UW液储存的心脏和肺已不适合器官移植。而12小时时用本发明离体器官储存保护液储存的心脏和肺上述各项指标变化与正常对照组相比无显著性差异，提示用本发明多器官储存保护液储存的心脏和肺在12小时时仍适合器官移植。实验结果显示本发明多器官储存保护液对于离体心脏和肺的储存效果要明显优于UW液，使离体心脏和肺有效储存期延长至少6小时。详细结果见表3。

B.本发明多器官储存保护液与UW液对离体肝脏和胰腺的影响：实验结果显示，随着肝脏和胰腺储存时间延长，离体器官组织损伤越来越严重，表现为在48与60小时用磷酸缓冲液储存的肝脏和胰腺，其LPO与NO含量显著高于对照组。反映了肝脏和胰腺细胞内自由基含量升高并由此导致细胞膜损伤。肝脏和胰腺组织内的ATP含量显著下降，反映了二者能量代谢出现障碍。肝脏和胰腺程序性死亡细胞数也明显增多。这些指标的变化指示用磷酸缓冲液储存的肝脏和胰腺在48小时后以不适合器官移植。而用本发明多器官储存保护液与UW液储存的肝脏和胰腺在48小时时上述各项指标变化与正常对照组相比无显著性差异，提示用本发明多器官储存保护液与UW液储存的肝脏和胰腺在48小时仍适合器官移植。60小时时，UW液储存的肝脏和胰腺LPO，NO与细胞程序性死亡明显升高，组织ATP含量降低，此时用UW液储存的肝脏和胰腺已不适合器官移植。而60小时时用本发明多器官储存保护液储存的肝脏和胰腺上述各项指标的变化与正常对照组相比无显著性差异，提示用本发明多器官储存保护液储存的肝脏和胰腺在60小时时仍适合器官移植。实验结果显示本发明多器官储存保护液对于离体肝脏和胰腺的储存效果要明显优于UW液，使离体肝脏和胰腺的有效储存期延长至少12小时。详细结果见表4。

C.本发明多器官储存保护液与UW液对离体肾脏的影响：实验结果显示，随着肾脏储存时间延长，离体器官组织损伤越来越严重，表现为在72与96小时磷酸缓冲液储存肾脏LPO与NO含量显著高于对照组。反映了肾脏细胞内自由基含量升高并由此导致细胞膜损伤。肾脏组织内ATP含量显著下降，反应了肾脏能量代谢出现障碍。肾脏程序性死亡细胞数明显增多。这些指标变化指示用磷酸缓冲液储存的肾脏在72小时已不适合器官移植。而用本发明多器官储存保护液与UW液储存的肾脏在72小时上述各项指标变化与正常对照组相比无显著性差异，提示用本发明多器官储存保护液与UW液储存的肾脏在72小时仍适合器官移植。96小时时，UW液储存的肾脏LPO，NO与细胞程序性死亡明显升高，组织ATP含量降低，此时用UW液储存的肾脏已不适合器官移植。而96小时时用本发明多器官储存保护液储存的肾脏上述各项指标的变化与正常对照组相比无显著性差异，提示用本发明多器官储存保护液储存的肾脏在96小时仍适合器官移植。实验结果显示本发明多器官储存保护液对于离体肾脏的储存效果要明显优于UW液，使离体肾脏的有效储存期延长至少24小时。详细结果见表5。

目前，全世界年均器官移植数约有60,000例，我国每年仅肾移植就多达6,000例，再加上其它器官移植，数量接近万例。随着医学科学的迅速发展及我国器官移植法的出台，在未来数年内我国器官移植数将成倍增长。目前，大多数医院均采用UW液作为器官储存液。如前所述，UW 液对于离体器官的储存还存在许多缺点，特别是对心脏和肺的储存效果不佳。本发明多器官储存保护液是针对离体器官代谢特点以及针对器官储存移植过程中缺血/再灌注损伤的病理基础研制而成的新型器官储存液，其独特的配方有理论与实验的支持，具有显著的创新性。实验结果显示本发明多器官储存保护液对于离体心脏、肺，肝脏、胰腺和肾脏的储存效果明显优于UW液，使离体心脏和肺有效储存时间在UW液的基础上至少延长6小时；使离体肝脏和胰腺有效储存时间在UW液的基础上至少延长12小时；使离体肾脏有效储存时间在UW液的基础上至少延长24小时。

此发明应用于临床人体多器官储存将使更多患者有机会获得器官移植，使得器官移植成功率提高，并且此发明适合国内配制、使用方便价格便宜，可用于取代进口UW液，具有显著的实用性。

附表：

表一、UW液组份与含量

UW液pH为7.4，渗透压为325mosm/升。

表二、本发明多器官储存保护液组份与含量

本发明离体多器官储存保护液pH为7.4，渗透压为355mosm/升。

表三、本发明多器官储存保护液与UW液对离体心脏和肺的影响：

表中的数值为平均值±标准误；N＝8；*为与正常对照组相比P＜0.01；

正常对照：心脏和肺取出后立即进行各项指标的分析，所以表中的时间为0小时；

Apoptosis：细胞程序性死亡。

表四、本发明多器官储存保护液与UW液对离体肝脏和胰腺的影响

正常对照：肝脏和胰腺取出后立即进行各项指标的分析，所以时表中的时间为0小时；

Apoptosis：细胞程序性死亡。

表五、本发明多器官储存保护液与UW液对离体肾脏的影响

正常对照：肾脏取出后立即进行各项指标的分析，所以时表中的时间为0小时；

Apoptosis：细胞程序性死亡。

Claims

1.一种离体多器官储存保护液，其组份和含量为：乳糖钾盐100mmol/升、KH₂PO₄25mmol/升、MgSO₄ 5mmol/升、胰岛素100U/升、地塞米松8mg/升、腺苷5mmol/升、青霉素40U/升、葡萄糖0.5mmol/升、褪黑素200μmol/升、水溶性维生素E 200μmol/升、维生素C 200μmol/升、甘露醇15g/升，多器官储存保护液的pH为7.4，渗透压为355mosm/升。

2.一种离体多器官储存方法，其特征在于使用如权利要求1所述的器官储存保护液，对离体心脏、肺、肝脏、胰腺和肾脏器官移植前的储存保护。