CN113795247A - 用于心脏手术的稳定心脏麻痹液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种心脏麻痹液，相较于现有的心脏麻痹液，本发明于pH值、微粒物质形成及渗透压方面表现得更加稳定，且同时对于维护心脏功能的能力也表现较佳。该心脏麻痹液包含溶于水中的钾离子(K+)、镁离子(Mg2+)、钠离子(Na+)、氯离子(Cl‑)、葡萄糖酸根离子、醋酸根离子、硫酸根离子(SO4 2‑)、三羟甲基氨基甲烷(THAM)及甘露醇。

Description

用于心脏手术的稳定心脏麻痹液
技术领域
本发明属于关于心脏麻痹液的领域，尤其关于一pH值、微粒物质形成及渗透压表现稳定，且同时能够维护心脏功能的心脏麻痹液。
背景技术
心脏麻痹液是用于引起心脏麻痹并同时维护心脏生存能力，常用于心脏手术等目的。举例而言，一心脏麻痹液可能透过改良去极化(modified depolarization)方法暂时中断心肌活动、减少该器官的能量消耗、促进心脏麻痹时的无氧糖解作用、防止钙离子累积于心肌细胞内导致心肌损伤、清除氢离子，并保护带有高能磷酸键的化合物。心脏麻痹液作为心脏手术的关键用药，于储藏与使用时应足够稳定、易于制备与使用、要求能快速引起心脏麻痹且持续至心脏手术结束、维护重要心脏功能，并且要价合理。
目前常用的心脏麻痹液包含
Figure BDA0003211261450000011
HTK、
Figure BDA0003211261450000012
及德尼多心脏麻痹液(delNido solution)。
Figure BDA0003211261450000013
HTK的特色在于其钠离子与钙离子浓度较低，分别为15mEq/L与0.015mEq/L，并透过过极化(hyperpolarization)方法达到心脏麻痹之效。另外，该心脏麻痹液也包含色胺酸与酮戊二酸根离子，并以组胺酸作为缓冲溶液。
Figure BDA0003211261450000014
HTK的心脏麻痹效果能维持长达4小时，且该心脏麻痹液需于摄氏2到8度下保存，保存期限为一年，然而该药品的临床使用受限于其相对高昂的价格，在美国1,000mL的
Figure BDA0003211261450000015
HTK售价预计超过1,000美元，是
Figure BDA0003211261450000016
定价的四倍。
另一较可负担的选择是
Figure BDA0003211261450000017
该心脏麻痹液以相对高的钾离子浓度16mEq/L达到去极化。该心脏麻痹液能于室温保存，其保存期限为2年，但
Figure BDA0003211261450000018
受限于其心脏麻痹作用约只有20到30分钟，而开心手术有时可能需要长达2小时的作用期间(需多次施予心脏麻痹液)。此外，Plegisol也曾受限于制造延误所致的供应短缺。1,2
第三个选项是德尼多心脏麻痹液，德尼多心脏麻痹液为16.3mL的20％甘露醇、4mL的50％硫酸镁、13mL的8.4％碳酸氢钠，及13mL的2mEq/mL氯化钾，加入
Figure BDA0003211261450000019
1公升的Plasma-Lyte A溶液。每公升Plasma-Lyte A溶液含140mEq钠离子(Na+)、5mEq钾离子(K+)、3mEq镁离子(Mg2+)、98mEq氯离子(Cl-)、27mEq醋酸根离子，及23mEq葡萄糖酸根离子。另外，也可添加13mL的1％利多卡因与20％的完全充氧的病人血液至溶液中。德尼多心脏麻痹液添加利多卡因与充氧病人血液之前的类晶体(crystalloid)成分，列于表1。该心脏麻痹液有含钾量高的优点，且不含钙离子，可避免钙离子进入心肌细胞。此外，单一剂量德尼多心脏麻痹液便足以引起足够作用时间的心脏麻痹，而能减少多次施予心脏麻痹液所可能导致的心脏损伤，并简化手术过程。德尼多心脏麻痹液未受专利保护，但德尼多申请的美国专利第5,407,793号的专利，其所请求的另一不同的心脏麻痹液包含组胺酸、至少一种能量供应物质(葡萄糖或果糖)、钠离子、钾离子、腺苷、常规型胰岛素(regularinsulin)、利多卡因与钙离子。然而，德尼多心脏麻痹液与本发明的心脏麻痹液皆不含腺苷、组胺酸或胰岛素。
德尼多心脏麻痹液虽有许多优势，却必须保存于摄氏2至8度，且保存的期限仅有短短45天。此外，该心脏麻痹液经加热灭菌后会产生沉淀物或微粒物质，实例显示如图4A与4B相关的微粒物质。由于过滤灭菌法的成本较加热灭菌法高，心脏麻痹液商业化生产过程通常以加热灭菌法为主要灭菌流程，然而加热灭菌后所产生微粒物质，导致德尼多心脏麻痹液无法使用。因德尼多心脏麻痹液保存期限过短，且加热灭菌导致溶液中产生微粒物质，目前并无商品化的现成德尼多心脏麻痹液，现有作法是在医院内于开心手术之前调制德尼多心脏麻痹液，或是将调制德尼多心脏麻痹液外包予无菌药品调制公司。但是临场调制溶液则会为手术提高许多人为疏失的风险，而成为德尼多心脏麻痹液的另一缺点。因此，需要发展另一在引起心脏麻痹及保护心脏功能方面至少与德尼多心脏麻痹液效果相等，但其保存期限较长、经加热灭菌后不会产生微粒物质的心脏麻痹液，以便可生产为商品化的心脏麻痹液，实质减少使用前临场调制的需求。
发明内容
本发明提供一相较于现有心脏麻痹液，于pH值、微粒物质形成及渗透压方面较稳定，同时维护心脏功能的能力较佳的心脏麻痹液。该心脏麻痹液包含溶于水中的钾离子(K+)、镁离子(Mg2+)、钠离子(Na+)、氯离子(Cl-)、葡萄糖酸根离子、醋酸根离子、硫酸根离子(SO4 2-)、三羟甲基氨基甲烷(THAM)及甘露醇。本发明另提供制备本发明的心脏麻痹液的方法，以及施予本发明的心脏麻痹液的方法。
附图说明
图1为比较该实验研究的四种心脏麻痹液的pH值，Y轴表示pH值，X轴表示实验天数。本研究的四种心脏麻痹液存放于25℃，分别是成分如表1含10mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液，以及经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。
图2为比较该实验研究的四种心脏麻痹液的pH值，Y轴表示pH值，X轴表示实验天数。本研究的四种心脏麻痹液存放于16℃，分别是成分如表1含10mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液，以及经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。
图3为比较该实验研究的四种心脏麻痹液的pH值，Y轴表示pH值，X轴表示实验天数。本研究的四种心脏麻痹液存放于4℃，分别是成分如表1含10mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液，以及经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。
图4A与4B为比较该实验研究的四种心脏麻痹液的微粒物质浓度，分别说明>＝10μm的微粒物质的浓度，及>＝25μm的微粒物质的浓度，Y轴表示每mL的微粒物质数量，X轴表示实验天数。本研究的四种心脏麻痹液存放于室温，分别是成分如表1含10mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液，以及经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。
图5为比较该实验研究的四种心脏麻痹液的渗透压，Y轴以mOsm/kg为单位表示渗透压，X轴表示实验天数。本研究的四种心脏麻痹液存放于室温，分别是成分如表1含10mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液、经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液，以及经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。
图6A与6B显示施予该实验研究的三种心脏麻痹液后大鼠心脏中Bcl-2的表现量。本研究的三种心脏麻痹液，分别是成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为W)、德尼多心脏麻痹液(标示为D)，及HTK心脏麻痹液(标示为H)。
图7显示施予该实验研究的三种心脏麻痹液后大鼠心脏中Bax/Bcl-2的表现比例。本研究的三种心脏麻痹液，分别是成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)，及HTK心脏麻痹液(标示为HTK)。
图8A与8B显示大鼠心脏及心脏细胞的存活率。更具体而言，图8A是比较为达必要的每组n＝6该实验使用的六组大鼠数量，及最终搜集数据的大鼠数量，Y轴表示大鼠个数，X轴表示本实验施予的六种溶液。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000041
心脏麻痹液(标示为P)、HTK心脏麻痹液(标示为H)、德尼多心脏麻痹液(标示为D)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为W)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为K)，另有负对照组生理盐水(标示为S)。图8B是比较大鼠心脏施予该实验研究的五种溶液之后，心肌细胞因局部缺血而死亡的比例，Y轴表示细胞局部缺血的百分比(％)，X轴表示本实验施予的溶液。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000042
心脏麻痹液(标示为P)、HTK心脏麻痹液(标示为H)、德尼多心脏麻痹液(标示为D)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为W)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为K)，另有负对照组生理盐水(标示为S)。
图9为比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后的心电图的电压，Y轴以mV为单位表示电压，X轴表示时间。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000043
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
图10为比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后的左心室收缩压(leftventricle systolic pressure，LVSP)，Y轴以mmHg为单位表示左心室收缩压，X轴表示时间。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000051
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
图11为比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后的左心室舒张压(leftventricle diastolic pressure，LVDP)，Y轴以mmHg为单位表示左心室舒张压，X轴表示时间。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000052
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
图12为比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后的心率(heart rate，HR)，Y轴以bpm为单位表示心率，X轴表示时间。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000053
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
图13为比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后的冠状血管血流(coronaryflow，CF)，Y轴以mL/min为单位表示冠状血管血流，X轴表示时间。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000054
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
图14为比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)表现量，Y轴以U/L为单位表示乳酸脱氢酶表现量，X轴表示时间。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000055
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
表1列出德尼多心脏麻痹液及本发明的心脏麻痹液一实例(标示为WAW心脏麻痹液)溶于水时的离子组成与浓度。
表2列出绘制图9所使用的实验数据，比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后，心电图的电压(单位为mV)随时间的变化。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000061
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
表3列出绘制图10所使用的实验数据，比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后，左心室收缩压(单位为mmHg)随时间的变化。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000062
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
表4列出绘制图11所使用的实验数据，比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后，左心室舒张压(单位为mmHg)随时间的变化。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000063
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
表5列出绘制图12所使用的实验数据，比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后，心率(单位为bpm)随时间的变化。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000064
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
表6列出绘制图13所使用的实验数据，比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后，冠状血管血流(单位为mL/min)随时间的变化。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000065
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
表7列出绘制图14所使用的实验数据，比较大鼠心脏施予本实验研究的五种溶液后，乳酸脱氢酶表现量(单位为U/L)随时间的变化。本研究的五种溶液，分别是
Figure BDA0003211261450000071
心脏麻痹液(标示为Plegisol)、HTK心脏麻痹液(标示为HTK)、德尼多心脏麻痹液(标示为DND)、成分如表1含20mmol/L的THAM的本发明的WAW心脏麻痹液(标示为WAW)，及正对照组KH缓冲溶液(Krebs-Henseleit buffer)(标示为KH)，另有负对照组生理盐水(标示为Saline)。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
以下在说明书与权利要求所使用的内容中，除非内文特别说明，否则单数形式“一”与“该”包含多个参照者。因而，例如参照“一成分”包含多个成分的混合物、参照“一活性药剂”包含超过一个活性药剂，以及类似者。
在本发明中，“约”一词作为量的修饰语，用以表示包含所修饰的量的+或-5％。
在本发明中，药物或医药活性成分的“有效量”或“治疗有效量”一词用以表示无毒性但足以提供所需治疗效果的药物或活性剂的量。“有效的”该量将因个体而异，取决于个体的年龄与整体状况、特定活性剂，以及类似者。本领域技术人员使用常规实验，可判定在任何个别例子中的适当的“有效”量。
本发明的心脏麻痹液改善先前技术部分提及的德尼多心脏麻痹液的短处，且维护心脏功能的能力实质优于德尼多心脏麻痹液。更具体而言，申请人意外发现以适当浓度的三羟甲基氨基甲烷(THAM)又称Tris取代德尼多心脏麻痹液的氢氧化纳，能防止本发明的心脏麻痹液因加热灭菌形成微粒物质，如下述与图4A与4B所显示的相关的实施例。此外，本发明的心脏麻痹液存放长达365天仍维持稳定的pH值与渗透压，使pH值维持离子浓度在引起心脏麻痹的关键范围，如图1-3所示，且渗透压维持在对人体无害的范围，如图5所示。除此之外，使用前可添加的成分仅限完全充氧病人血液与/或利多卡因，该成分可依心脏外科医师需求选择性地添加；相较于临场调制的德尼多心脏麻痹液，本发明实质降低制备心脏麻痹液过程中产生人为误差的可能性。重要地，下述与图6-14相关的实施例及相关研究，显示本发明的心脏麻痹液维护心功能的能力，意外地优于包含德尼多心脏麻痹液的其他心脏麻痹液。举例而言，根据下述与图6与图7相关的实施例论及的BCL-2表现量与BAX/BCL-2比例，本发明的心脏麻痹液能减少细胞凋亡。此外，如下述与图8-14相关的实施例所示，由心电图电压、左心室收缩压、左心室舒张压、心率、冠状血管血流与乳酸脱氢酶表现量的实验结果可见，相较于德尼多心脏麻痹液，本发明的心脏麻痹液维护大鼠心脏功能的效果较佳。
另外，本发明的申请人最先发现以适当浓度的THAM取代碳酸氢钠，不仅能减少心脏麻痹液加热灭菌后形成的微粒物质等不稳定性，还能实质增进如上述维护心脏功能的效果，如上所述。更具体而言，就申请人所知，目前并无现有技术表示以THAM取代德尼多心脏麻痹液中的碳酸氢钠，能使心脏麻痹液具有上述的性质。举例而言，沃古薛夫(Volgushev)的美国专利申请案US15/325,501表示，THAM并非心脏麻痹液的必要成分，可以碳酸氢钠或其他医药上可接受的碱取而代之。(’501专利申请案，第0023节)。该叙述与下述与图1-3相关的实施例不相符，本发明的实施例显示碳酸氢钠导致德尼多心脏麻痹液不稳定性的问题，使之无法商品化，而THAM并无导致该问题。此外，’501专利申请案只论及将溶液pH值维持在特定范围内，更具体而言，该专利申请案只讨论将溶液pH值维持在低于8的pH值，该目标pH范围实质低于本发明的心脏麻痹液，而非含预防存放时溶液形成沉淀物等整体稳定性。('501专利申请案，第0022节及权利要求1、2、3与4)。此外，’501专利申请案所描述的心脏麻痹液，是与本发明的组成与制备方式实质不同的心脏麻痹液。举例而言，’501专利申请案所描述的心脏麻痹液是用不同的化合物制备而成，不含本发明包含的钠离子或葡萄糖酸根离子。(’501专利申请案，第0047-0081节及权利要求1-4)。’501专利申请案所描述的心脏麻痹液，渗透压大于400mOsm/kg，实质大于本发明的渗透压，pH值低于8也低于本发明的pH值。(’501专利申请案，第0022、0025与0026节)。
由于申请人是最先发现以适当浓度的THAM取代碳酸氢钠来改良德尼多心脏麻痹液，可排除加热灭菌使溶液产生微粒物质的问题，并使该心脏麻痹液在pH值方面维持稳定至少365日，而让该心脏麻痹液得以商品化，本发明应符合Phair原则(Phair doctrine)，且根据该原则本发明应具有专利性。更具体而言，Ex parte Phair,1USPQ 133,134(Bd.App.1929)“Phair原则”裁定：“发明可为从现有机械或程序中发觉缺陷的原因并据以改善，不论改善方法在理解该原因后变得显而易见。”法院后于In re Sponnoble,405F.2d579,56CCPA 823,160USPQ 237(1969)支持该原则，后续案例亦遵循此原则。Sponnoble案中，法院基于大量意见证据，裁定：“证据明显显示他[Sponnoble]发现了问题的来源。”405F.2d at 585,56CCPA at 833,100USPQ at 243。同样地，申请人于本专利申请案的实施例与相应图表揭露足量证据，证明以适当浓度的THAM取代碳酸氢钠，能解决加热灭菌导致德尼多溶液产生微粒物质的问题，使本发明得以商品化。
本发明的一实施例中，该心脏麻痹液包含钾离子(K+)、镁离子(Mg2+)、钠离子(Na+)、氯离子(Cl-)、葡萄糖酸根离子、醋酸根离子、硫酸根离子(SO4 2-)、THAM与甘露醇。在一实施例中，可在施予该心脏麻痹液前选择性地添加完全充氧病人血液与/或利多卡因。在一实施例中，本发明的组成包含溶于水的约27到约33mEq/L钾离子(K+)、约16到约20mEq/L镁离子(Mg2+)、约120到约146mEq/L钠离子(Na+)、约106到约130mEq/L氯离子(Cl-)、约20到约24mmol/L葡萄糖酸根离子、约22到约28mmol/L醋酸根离子、约6到约9mmol/L硫酸根离子(SO4 2-)、约5到约30mmol/L THAM，与约2到约5g/L甘露醇。在另一实施例中，本发明的组成包含溶于水的约29.63mEq/L钾离子(K+)、约18.39mEq/L镁离子(Mg2+)、约133.80mEq/L钠离子(Na+)、约118.51mEq/L氯离子(Cl-)、约21.98mmol/L葡萄糖酸根离子、约25.81mmol/L醋酸根离子、约7.76mmol/L硫酸根离子(SO4 2-)、约10mmol/L THAM或约20mmol/L THAM，与约3.116g/L甘露醇。在一实施例中，制备该心脏麻痹液的水是蒸馏水，也可能是无菌水。在另一实施例中，本发明的心脏麻痹液不含钙离子(Ca2+)。在另一实施例中，本发明的心脏麻痹液不含碳酸氢钠。本发明的任一实施例可另包含约0.1到约0.14mg/mL利多卡因于最终溶液。此外，本发明的任一实施例可另包含完全充氧的病人血液，完全充氧的病人血液与本发明的WAW心脏麻痹液体积比例是约1：1到约1：8。在另一实施例中，可以其他极化剂(polarizing agent)取代利多卡因，例如普鲁卡因(procaine)。在另一实施例中，冰醋酸可以其他医药上可接受的酸取而代之，例如氢氯酸、磷酸或乳酸。
本发明亦提供制备本发明的心脏麻痹液的方法，包含以下步骤：(a)于水中混合约75到约95mmol/L氯化钠(NaCl)、约20到约24mmol/L葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)、约22到约28mmol/L三水合醋酸钠USP(C2H3NaO2·3H2O)、约27到约33mmol/L氯化钾USP(KCl)、约1.2到约1.6mmol/L六水合氯化镁USP(MgCl-2·6H2O)、约6到约9mmol/L七水合硫酸镁USP(MgSO4·7H2O)，与约15到约20mmol/L甘露醇USP(C6H14O6)。在另一实施例中，制备本发明的心脏麻痹液的方法如下步骤(a)：于水中混合约86.02mmol/L氯化钠(NaCl)、约21.99mmol/L葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)、约25.85mmol/L三水合醋酸钠USP(C2H3NaO2·3H2O)、约29.59mmol/L氯化钾USP(KCl)、约1.41mmol/L六水合氯化镁USP(MgCl-2·6H2O)、约7.76mmol/L七水合硫酸镁USP(MgSO4·7H2O)，与约17.1mmol/L甘露醇USP(C6H14O6)。在一实施例中，制备该心脏麻痹液的水是蒸馏水，也可能是无菌水。制备本发明的心脏麻痹液的方法，另包含如下步骤(b)：由步骤(a)所制成的溶液中混入THAM与一医药上可接受的酸，调整溶液至所欲pH值约8.2到约8.6，并使THAM浓度达到约5到约30mmol/L、约10到约20mmol/L、约10mmol/L，或约20mmol/L。在一实施例中，该医药上可接受的酸是冰醋酸。该组合物可于使用前365天制备。在一实施例中，本发明的心脏麻痹液的制备方法可选择性地包含另一步骤：在使用前于步骤(a)与步骤(b)所制成的溶液中混入利多卡因与/或完全充氧的病人血液。
在一实施例中，制备本发明的心脏麻痹液的方法所包含的步骤为：将约15到约19mmol甘露醇、约5到约10mmol硫酸镁，与约22到约27mmol氯化钾混入1公升的Plasma-LyteA溶液。在另一实施例中，制备本发明的心脏麻痹液的方法的步骤(a)包含将约17.10mmol甘露醇、约7.76mmol硫酸镁，与约24.85mmol氯化钾混入1公升的Plasma-Lyte A溶液。每1LPlasma-Lyte A基础溶液包含约140mEq钠离子(Na+)、约5mEq钾离子(K+)、约3mEq镁离子(Mg2 +)、约98mEq氯离子(Cl-)、约27mEq醋酸根离子，与约23mEq葡萄糖酸根离子。制备本发明的心脏麻痹液的方法，另包含步骤(b)：在步骤(a)所制成的溶液中混入THAM与一医药上可接受的酸，调整溶液至所欲pH值约8.2到约8.6，并使THAM浓度达到约5到约30mmol/L、约10到约20mmol/L、约10mmol/L，或约20mmol/L。在另一实施例中，可以其他极化剂取代利多卡因，例如普鲁卡因。
在本发明的一实施例中，以本发明的任一方法制备而成的心脏麻痹液，包含溶于水的约29.63mEq/L K+、约18.39mEq/L Mg2+、约133.80mEq/L Na+、约118.51mEq/LCl-、约21.98mmol/L葡萄糖酸根离子、约25.81mmol/L醋酸根离子、约7.76mmol/L硫酸根离子、约5到约30mmol/L THAM、与约3.116g/L甘露醇。在一实施例中，以本发明的方法制备而成的心脏麻痹液不含碳酸氢钠。在一实施例中，以本发明的方法制备而成的心脏麻痹液不含钙离子。
本发明另提供心脏手术中施予本发明的任一心脏麻痹液于病人心脏，引致心脏麻痹的方法，该方法包含以德尼多溶液引致心脏麻痹的任一现有施予方法。在一实施例中，心脏手术中对病人施予本发明的任一心脏麻痹液以引致心脏麻痹的方法，包含以本发明的任一心脏麻痹液快速灌注(perfuse)病人心脏。在一实施例中，本发明的心脏麻痹液可灌注20到30mL/kg于病人心脏。该心脏麻痹液的储藏温度可为约4℃到约室温。
在一实施例中，心脏麻痹液为灌注至阻断的主动脉(cross-clamped aorta)根部，与/或直接灌注至冠状窦(coronary sinus)。在一实施例中，可以一气囊袖口导管(balloon-cuffed catheter)作为心脏麻痹液导管，穿过右心房导入冠状窦，透过静脉循环(venous circulation)将心脏麻痹液灌注至冠状血管循环(coronary circulation)。该方法的益处为使用于弥漫性冠状动脉疾病(diffuse coronary artery disease)患者时，可较均匀分布，且其投递不依赖功能完好的动脉瓣膜(aortic valve)。
在本发明的一实施例中，在心脏手术中使用本发明的心脏麻痹液引致心脏暂时麻痹的方法，包含以约4℃到约35℃的本发明的心脏麻痹液灌注病人心脏，该心脏麻痹液若在约10℃到约21℃更佳，约13℃最佳。本领域技术人员已知，使用本发明引致患者心脏麻痹以保存心脏功能的过程，包含在中度低温(hypothermia)下以该水溶液灌注心脏。本发明的施予过程另包含以约20到约30mL/kg心脏麻痹液灌注心脏。本发明的另一实施例包含每20到40分钟在中等低温以本发明的水溶液灌注病人心脏，引致心脏麻痹以保存心脏功能。本发明的使用方法可包含以约20到40分钟为一循环以本发明的水溶液灌注心脏，在中等低温持续至少约24循环。在另一实施例中，本发明的使用方法包含持续投递心脏麻痹液。
在本发明的任一实施例中，本发明的心脏麻痹液皆维持约8.2到约8.6的pH值，或约8.3到约8.5的pH值，或约8.4的pH值。在本发明的任一实施例中，本发明的心脏麻痹液的THAM浓度维持约5mM到约30mM，或约5mM到约20mM，或约10mM到约20mM。在一实施例中，本发明的组合物包含20mM THAM，其保存温度为约25℃。
在一实施例中，为确保本发明的心脏麻痹液pH值稳定、渗透压稳定并预防微粒物质的形成，其保存温度为约4℃到约25℃。在一实施例中，为确保本发明的任一心脏麻痹液pH值稳定、渗透压稳定并预防微粒物质的形成，其保存温度为约4℃到约16℃。在另一实施例中，为确保本发明的任一心脏麻痹液pH值稳定、渗透压稳定并预防微粒物质的形成，其保存温度为约16℃。
实施例
稳定性实验
发明人为比较本发明的心脏麻痹液与德尼多心脏麻痹液于25℃、16℃与4℃保存长达365天，其pH值、微粒物质形成及渗透压的稳定性，实施三项稳定性实验。本实验研究的四种心脏麻痹液包含成分如表1的本发明的WAW心脏麻痹液的二种实施例，与二种德尼多心脏麻痹液。更具体而言，该实验使用的本发明的二种实施例，一者为包含约29.63mEq/L K+、约18.39mEq/L Mg2+、约133.80mEq/L Na+、约118.51mEq/L Cl-、约21.98mmol/L葡萄糖酸根离子、约25.81mmol/L醋酸根离子、约7.76mmol/L硫酸根离子、约3.116g/L甘露醇，与约10mMTHAM的水溶液，另一者为与前者相同的水溶液，唯一差异是THAM浓度为20mM而非10mM。本发明的二种心脏麻痹液皆经加热灭菌。用于稳定性实验的第一种德尼多心脏麻痹液同样经加热灭菌处理，用于稳定性实验的第二种德尼多心脏麻痹液则经过滤灭菌而非加热灭菌。
上述四种心脏麻痹液于灭菌后保存在4℃、16℃与25℃，并于第1天、第7天、第14天、第28天、第90天、第120天与第365天收取实验数据。加热灭菌法是以灭菌釜将溶液加热至121℃，维持15分钟。
本实验的心脏麻痹液pH值标准为约8.2到约8.6，此为心脏麻痹期间减少代谢性酸中毒(metabolic acidosis)的pH值范围。本实验的微粒物质稳定性标准为>＝10μm微粒物质的浓度要等于或低于25/mL，>＝25μm微粒物质的浓度要等于或低于3/mL，此为《美国药典》(United States Pharmacopeia，USP)界定的医药用溶液可接受的微粒物质浓度。本实验的渗透压稳定性标准为渗透压要小于388mOsm/kg，此为观察含THAM商品所得出的对人体安全的渗透压限制，含THAM商品以THAM Hospira为例，其0.3M溶液的渗透压为389mOsm/L。
pH值稳定性实验
图1、图2与图3分别为比较本发明的心脏麻痹液二种实施例、经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液及经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液，分别在25℃、16℃与4℃保存365日后的pH值稳定性实验结果。
图1为上述四种心脏麻痹液保存于25℃的pH值稳定性实验结果。如图1所示，唯有含约20mM THAM的本发明的WAW心脏麻痹液在365日实验期间维持8.2到8.6的pH值，符合pH值稳定性标准。含约10mM THAM的本发明的WAW心脏麻痹液，pH值于第80天与第310天之间降至8.2以下。尽管如此，本发明的二种心脏麻痹液实施例于365日实验期间，pH值稳定性实质优于二种德尼多心脏麻痹液，举例而言，经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液pH值于实验期间持续高于8.6，经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液pH值仅于前90天维持在8.2到8.6的范围内，90日后其pH值持续超过高标8.6。
图2为上述四种心脏麻痹液保存于16℃的pH值稳定性实验结果。如图2所示，本发明的WAW心脏麻痹液二种实施例皆于365天实验期间维持8.2到8.6的pH值。本实验使用的二种德尼多心脏麻痹液并没有维持8.2到8.6的pH值，更具体而言，经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液pH值于实验期间持续高于8.6，经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液仅于前90天维持在8.2到8.6的范围内，90日后其pH值持续超过高标8.6。
图3为上述四种心脏麻痹液保存于4℃的pH值稳定性实验结果。如图3所示，本发明的WAW心脏麻痹液含10mM THAM者，pH值于第150日到第300日降至低标8.2之下，而本发明的WAW心脏麻痹液含20mM THAM者，pH值于第0日到约第30日高于高标8.6。本实验使用的二种德尼多心脏麻痹液的pH值稳定性与保存于16℃时结果相似，实验期间大部分或所有时间pH值不符合8.2到8.6的标准，举例而言，经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液pH值于实验期间持续高于高标8.6，经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液仅于前90日符合pH值8.2到8.6的标准，第90日后其pH值持续高于8.6。
因此，如图1、图2与图3所示，在4℃、16℃与25℃的三种保存温度下，本发明的WAW心脏麻痹液二种实施例pH稳定性皆实质优于经加热灭菌与经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。如图3所示，THAM浓度为20mM的本发明的WAW心脏麻痹液，于365日实验期间的pH值最为稳定。因此，在一实施例中，将本发明成分如表1且含20mM THAM的WAW心脏麻痹液存放于25℃。此外，如图2所示，含10mM THAM的本发明的WAW心脏麻痹液实施例，以及成分含20mMTHAM的本发明的WAW心脏麻痹液实施例，皆于实验期间维持8.2到8.6的pH值。因此，在另一实施例中，将本发明成分如表1且含10mM THAM的WAW心脏麻痹液存放于16℃。在另一实施例中，将本发明成分如表1且含20mM THAM的WAW心脏麻痹液存放于16℃。
微粒物质稳定性实验
图4A与4B为微粒物质稳定性实验的实验结果。如图4A与4B所示，于365日实验期间经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液微粒物质稳定性实验结果完全不符合标准，其余三种心脏麻痹液皆符合标准。更具体而言，经加热灭菌的德尼多心脏麻痹液已于第0日超过体积>＝10μm及体积>＝25μm微粒物质的浓度标准。虽然如图4A的第7日、第15日与第28日实验数据所示，体积>＝10μm微粒物质浓度于实验观察期间降至可接受的范围，却又于第90日后再次超出可接受的浓度范围。同样地，如图4B的第15日与第28日实验数据所示，虽然体积>＝25μm的微粒物质浓度仅于实验观察期部分时间降至可接受范围，却又于第90日后再次超出可接受的浓度范围。如上所述，该实验结果重要性在于加热灭菌对商品化来说是偏好且普遍的过程，却使德尼多心脏麻痹液因此难以商品化，但本发明的心脏麻痹液已解决这问题而得以商品化。因此，本发明的一实施例为溶于水的约29.63mEq/L K+、约18.39mEq/L Mg2+、约133.80mEq/L Na+、约118.51mEq/L Cl-、约21.98mmol/L葡萄糖酸根离子、约25.81mmol/L醋酸根离子、约7.76mmol/L硫酸根离子、约3.116g/L甘露醇、与THAM浓度介于约10mM与约20mM之间的心脏麻痹液，且灭菌是采用加热灭菌处理。
渗透压稳定性实验
图5为渗透压稳定性实验的实验结果。如图5所示，本实验的四种心脏麻痹液皆符合渗透压低于388mOsm/kg的标准。另，成分含20mM THAM的本发明的WAW心脏麻痹液的渗透压最高，成分含10mM THAM的本发明的WAW心脏麻痹液的渗透压，则相似于经过滤灭菌的德尼多心脏麻痹液。
心脏麻痹实验
本实验的实验对象为体重约350到约450公克的公Sprague-Dawley大鼠，根据所要施予的三种心脏麻痹液将大鼠分三组，分别为德尼多心脏麻痹液组(D)、本发明的WAW心脏麻痹液组(W)，与HTK心脏麻痹液组(H)，每组大鼠个数为n＝5+1。用于心脏麻痹实验的本发明的WAW心脏麻痹液包含约29.63mEq/L K+、约18.39mEq/L Mg2+、约133.80mEq/L Na+、约118.51mEq/L Cl-、约21.98mmol/L葡萄糖酸根离子、约25.81mmol/L醋酸根离子、约7.76mmol/L硫酸根离子、约20mM THAM、与约3.116g/L甘露醇。
大鼠经麻醉药挥发器(anesthesia vaporizer machine)施予异氟醚(Isoflurane)麻醉，在完全麻醉后经腹膜内注射(intraperitoneal injection)施予3,000U/kg肝素(heparin)。研究者分离大鼠心脏，将之置于盛装少量冰KB缓冲液(Krebs-Henseleit buffer，KHB)的容器内，然后于心脏的主动脉与左心房插管，在由研究者以每组大鼠对应的心脏麻痹液灌注心脏，W与D组注入20mL/kg心脏麻痹液，H组注入30mL/kg心脏麻痹液，灌注时间为10分钟，心脏麻痹液温度为约8℃。灌注心脏麻痹液后，大鼠心脏置于盛装少量KH缓冲液且置于冰上的容器内，在灌注心脏麻痹液后第0、2、4、6与12小时取样，组织病理学切片则于第0、4与12小时取样，样本皆立即存放在-80℃条件下。本实验的样本被用以检测Bcl-2及Bax/Bcl-2比例参数。
Bcl-2
Bcl-2蛋白质家族具反细胞凋亡功能，此类蛋白质能与作用者(effector)及启动者(activator)直接互动，抑制其促进细胞凋亡的作用3,4,5。在临床前研究模型中(preclinical models)，Bcl-2能与单一BH3区段启动者(BH3-only activators)结合并隔离之，防止该启动者与穿孔作用者(pore-forming effector)互动6,7,8。同样地，Bcl-2可直接影响作用者，防止粒线体穿孔。Bcl-2等反细胞凋亡物质与促进细胞凋亡物质之间的动态平衡，能决定细胞是否凋亡。
图6A与图6B的Bcl-2西方墨点法结果显示，在施予兼具糖解作用参与者与细胞凋亡促使者的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)后，施予本发明的心脏麻痹液的W组的Bcl-2表现量高于施予德尼多心脏麻痹液的D组。由此可见，本发明的WAW心脏麻痹液抑制细胞凋亡的能力优于德尼多心脏麻痹液。因此，本发明提供的方法包含一
Figure BDA0003211261450000151
抑制细胞凋亡的心脏麻痹方法。
Bax
据研究，Bax能与粒线体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anionchannel，VDAC)互动并促进其开启，导致粒线体膜电位丧失并释放细胞色素c(cytochromec)9。该基因表现受肿瘤抑制蛋白P53调控，而Bax也参与P53调节的细胞凋亡。
Bax/Bcl-2比例
粒线体调控的细胞凋亡途径受Bcl-2蛋白质家族的反细胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1)及促细胞凋亡蛋白(Bax、Bad、Bak)调控，其中Bcl-2能与Bax-Bak互动并形成失活异合体(inactivating heterodimer)来抑制细胞凋亡。部分研究者认为在决定细胞凋亡过程中，Bax/Bcl-2比例也许较Bax与Bcl-2个别的表现量更来得重要10,11。Bax/Bcl-2比例为判断细胞凋亡的指数，较高的Bax/Bcl-2比例可能与较高的细胞凋亡程序启动相关，而较高的胱天蛋白酶-3(caspase-3)浓度常与细胞凋亡过程有关12。
如图7所示，施予本发明的WAW心脏麻痹液的W组各数据点Bax/Bcl-2比例实质上低于施予德尼多心脏麻痹液的N组。因此，本发明提供一使用本发明的心脏麻痹液引致心脏麻痹且抑制细胞凋亡的方法。
心脏麻痹液维护分离的大鼠心脏功能的比较
实验动物：本实验的实验对象为体重300到400g的公Sprague-Dawley大鼠，每组6只大鼠。本实验的心脏分离及体外培养程序经实验动物照护及使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)认可。
心脏麻痹液：本实验使用本发明的WAW心脏麻痹液、德尼多心脏麻痹液、
Figure BDA0003211261450000161
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液、KH缓冲液及生理食盐水。本实验使用的本发明的WAW心脏麻痹液包含约29.63mEq/L K+、约18.39mEq/L Mg2+、约133.80mEq/L Na+、约118.51mEq/L Cl-、约21.98mmol/L葡萄糖酸根离子、约25.81mmol/L
Figure BDA0003211261450000162
醋酸根离子、约7.76mmol/L硫酸根离子、约20mM THAM、与约3.116g/L甘露醇。
分离与灌注心脏：在分离心脏前，大鼠经腹膜内注射施予戊巴比妥(sodiumpentobarbital)(60mg/kg)麻醉，过程如上述。研究者切开大鼠腹部，在移除心脏3分钟前以血管内注射方式在腔静脉(vena cava)注入肝素(500U/mL)。大鼠被开胸后，研究者快速割除其心脏，将之浸入10℃到15℃的KH缓冲液或与该实验组别相应的心脏麻痹液，以同一溶液冲洗主动脉5次以移除残血。研究者将大鼠心脏秤重后经主动脉插管，以滚轮泵(rollerpump)灌注10℃到15℃的KH缓冲液或心脏麻痹液，本发明的WAW心脏麻痹液及德尼多心脏麻痹液灌注20mL/kg，HTK心脏麻痹液灌注30mL/kg，
Figure BDA0003211261450000171
心脏麻痹液灌注20mL/kg，KH缓冲液则以10-20mL/min的速率持续灌注。灌注2小时后，研究者以离体心脏模式(Langendorffmodel)处理13，此法是在37℃常温下，以约95mmHg常压以KH缓冲液(Sigma,St.Louis,MO)逆向灌注(retrograde)心脏。此后，大鼠心脏在无循环情况下灌注KH缓冲液30分钟，以移除心脏麻痹液，而后以体积固定的100mL灌注液循环灌注心脏20分钟，得基准数据如上述。KH缓冲液持续注入95％O2/5％CO2气泡，以热水套维持37℃温度。大鼠心脏分别经上述各种心脏麻痹液处理后，研究者依下图所示的实验方法评估心脏功能。
为观察心脏缺血后的心脏细胞存活率及心肌梗塞大小，研究者另实施一引致急性心肌逆灌流损伤(acute myocardial ischemia-reperfusion injury)的实验，实验结果如图8B所示。在30分钟基准期过后，研究者于37℃对大鼠心脏施予30分钟的全面无流缺血，再以每组相应的心脏麻痹液逆向灌注4小时作为逆灌流损伤，对照组心脏则以KH缓冲液灌注290分钟。
评估心脏功能：压力传感器(pressure transducer)连接在大鼠心脏主动脉插管的枝臂，监控冠状动脉灌注压(coronary perfusion pressure，CPP)。一压力-容积导管(PVcatheter)(ADVantage Pressure-Volume System,Transonic,Netherlands)经主动脉插管的同一枝臂置入左心室，即时量测左心室血压-容积回圈(left ventricular pressure-volume loops)。冠状血管血流的量测，是收集灌注液30秒，在经心脏湿重标准化后计算其mL/min/g。研究者另收集0.1mL灌注液做心脏酶分析，如下所述。血压信号纪录于MP36四频道生理纪录系统(four-channel MP36 data acquisition system)
Figure BDA0003211261450000172
(Biopac Systems,Inc.,CA)，如上所述。
心脏酶分析：如下所述的灌注液或左心室组织匀浆于620g离心，收集上清液后将之保存于-70℃，以商业试剂组(Roche,Tokyo,Japan)分析其B型排钠利尿胜肽(B-typenatriuretic peptide)、心脏肌钙蛋白I(troponin I)、肌酸磷酸酶-MB亚型(creatinekinase MB)与乳酸脱氢酶活性，评估心肌所受的损伤程度，如上所述。
使用氯化三苯基四唑(Triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色判断心肌梗塞大小：灌注与秤重后，大鼠心脏从基部至尖端切成2-mm薄片，由于全面缺血于分离灌注的心脏模型引致同质反应，分析梗塞大小时只须使用心脏组织最多的中间切片。分析时，以37℃的1％2,3,5-氯化三苯基四唑(Sigma)染色20分钟，区分浅色的梗塞与红色的可存活心肌区块，如上所述。剩余组织切片保存于-80℃待后续生化分析，或以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)后固定，做非直接免疫荧光染色。
西方墨点法分析：左心室的心脏组织取样后，以商业试剂组(BioVision,Milpitas,CA)制备全蛋白、细胞质蛋白与粒线体蛋白样本，蛋白质样本以商业分析试剂组(Bio-Rad,Hercules,CA)测定后分离，经电泳转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)膜，如上所述。以5％脱脂牛奶阻隔(blocking)后，聚偏二氟乙烯膜加入抗细胞色素c抗体、抗BCL02抗体、抗Bax抗体、抗Bcl-XL抗体、抗胱天蛋白酶-9(caspase-9)抗体、抗Apaf-1抗体、抗胱天蛋白酶-3抗体或抗发炎体NLRP-3抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)，在4℃下放置过夜。清洗(washing)后，聚偏二氟乙烯膜加入连接辣根过氧化物酶的相应免疫球蛋白G(horseradish peroxidase-conjugated IgG)(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)于室温放置1小时。清洗聚偏二氟乙烯膜后，研究者以商业化学冷光试剂组(Thermo Scientific,Rockford,IL)侦测抗体结合形成的复合物。适当分子量的冷光条带(band)密度用图像分析系统(Diagnostic Instruments,SterlingHeights,MI)以密度测定法(densitometry)半量化。
研究者以非直接免疫荧光染色，检查心脏中蛋白质表现的几何局部化，如上所述。更具体而言，5-μm心脏切片固定于4％甲醛中。阻隔内生过氧化物酶后，研究者加入特定的抗体，样本于4℃放置过夜。抗兔子或抗山羊免疫球蛋白G(Jackson ImmunoResearch)被用作负对照组。隔天，心脏切片加入连接辣根过氧化物酶的免疫球蛋白G，室温放置1小时，以酪酰胺信号放大试剂组(tyramide signal amplification kit)(PerkinElmer,MA)显影。细胞核以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行复染。
分离的大鼠心脏施予心脏麻痹液实验结果
图8A与图8B分别为大鼠心脏实验时的存活率与心肌梗塞大小。如图8A所示，实验时大鼠心脏存活率最高的组别为仅施予KH缓冲液的正对照组，其次为施予本发明的心脏麻痹液的W组。如图8B所示，相较于施予
Figure BDA0003211261450000191
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液与德尼多心脏麻痹液的组别，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏心肌梗塞实质上较小。上述二项实验结果显示，本发明的心脏麻痹液维护心脏的功能优于其他三种心脏麻痹液。
心电图电压：如图9所示，相较于施予其他三种心脏麻痹液的组别，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏其电压较高，最接近仅施予KH缓冲液的对照组，表示W组大鼠心脏较健康且功能较强。在第0、30、60、90与120分钟，当P<0.05时，相较于施予
Figure BDA0003211261450000192
心脏麻痹液的大鼠心脏的电压，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的电压较高且有显著差异。在第0、30与60分钟，当P<0.05时，相较于施予HTK心脏麻痹液的大鼠心脏的电压，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的电压较高且有显著差异。更重要的是，在第0、30、60、90与120分钟，当P<0.05时，相较于施予德尼多心脏麻痹液的大鼠心脏的电压，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的电压较高且有显著差异。此外，在第0、30、60、90与120分钟，当P<0.05时，相较于仅施予KH缓冲液的大鼠心脏的电压，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的电压没有显著差异。上述实验结果显示，本发明的心脏麻痹液能使施予该心脏麻痹液的心脏维持较高的电压，效果优于其他三种心脏麻痹液。
左心室收缩压：同样地，如图10所示，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室收缩压，实质上高于施予其他三种心脏麻痹液的大鼠心脏，且实验结果最近似仅施予KH缓冲液的正对照组。于P<0.05进行的统计测试显示，在第0、30、60、90与120分钟，施予
Figure BDA0003211261450000193
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液与更重要的德尼多心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室收缩压，与施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏左心室收缩压具显著差异。施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室收缩压，较近似仅施予KH缓冲液的正对照组大鼠心脏的左心室收缩压，表示该心脏麻痹液维持心血压的功效优于
Figure BDA0003211261450000194
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液与德尼多心脏麻痹液。
左心室舒张压：施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏，经主动脉插管的枝臂插入左心室的压力-容积导管(ADVantage Pressure-Volume System,Transonic,Netherlands)所测量的即时量测左心室血压-容积回圈，高于施予其他三种心脏麻痹液的大鼠心脏的即时量测左心室血压-容积回圈。如图11所示，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室舒张压，实质上高于施予其他三种心脏麻痹液的大鼠心脏，且最近似仅施予KH缓冲液的正对照组左心室舒张压。当P<0.05，在第0、30、60、90与120分钟，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室舒张压，与施予
Figure BDA0003211261450000201
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液，与更重要的德尼多心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室舒张压，有显著差异。施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的左心室舒张压，最近似仅施予KH缓冲液的正对照组左心室舒张压，表示相较于其他三种心脏麻痹液，本发明的心脏麻痹液维持健康的左心室舒张压功效较优。
心率：如图12所示，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的心率，实质上高于施予其他三种心脏麻痹液的大鼠心脏的心率，且最近似仅施予KH缓冲液的正对照组的心率。当P<0.05，在第0、30、60与90分钟，相较于施予
Figure BDA0003211261450000202
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液，与更重要的德尼多心脏麻痹液的大鼠心脏的心率，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的心率较高且具显著差异。施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏，心率最近似仅施予KH缓冲液的正对照组心率，表示相较于
Figure BDA0003211261450000203
心脏麻痹液、HTK心脏麻痹液与德尼多心脏麻痹液，本发明的心脏麻痹液维持健康的心率功效较优。
冠状血管血流：冠状血管血流是供应心肌的血管中的血流循环，冠状动脉将充氧血供应给心肌，血液中的氧用尽后，心静脉便将血液输走。由于身体其余部位，尤其是大脑，需要几乎不间断供应之充氧血，心脏必须时时刻刻工作，有时工作得相当卖力。因此心脏血液循环不仅对心脏组织非常重要，对全身、甚至对大脑知觉亦十分重要。如图13所示，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏，冠状血管血流实质上高于施予其他三种心脏麻痹液的大鼠心脏的冠状血管血流。当P<0.05时，在第0与30分钟，相较于施予
Figure BDA0003211261450000204
心脏麻痹液及施予HTK心脏麻痹液的大鼠心脏的冠状血管血流，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的冠状血管血流较高且具显著差异。更重要地，当P<0.05时，在第0、30、60、90与120分钟，相较于施予德尼多心脏麻痹液的大鼠心脏的冠状血管血流，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的冠状血管血流较高且具显著差异。施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的冠状血管血流，最近似仅施予KH缓冲液的正对照组冠状血管血流，表示相较于其他三种心脏麻痹液，本发明的心脏麻痹液维持健康的冠状血管血流功效较优。
乳酸脱氢酶：乳酸脱氢酶广泛表现于身体组织，是器官损伤的非特定生物标记，由于本实验使用单一器官(分离心脏模型)，乳酸脱氢酶表现量可用于估测心脏受损程度。如图14所示，本实验使用的四种心脏麻痹液当中，施予本发明的心脏麻痹液的组别乳酸脱氢酶表现量最低。当P<0.05时，在第0、30、60、90与120分钟，相较于施予
Figure BDA0003211261450000211
心脏麻痹液及施予HTK心脏麻痹液的大鼠心脏乳酸脱氢酶浓度，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的乳酸脱氢酶浓度较低且具显著差异。更重要地，当P<0.05时，在第30、60、90与120分钟，相较于施予德尼多心脏麻痹液的大鼠心脏的乳酸脱氢酶浓度，施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏的乳酸脱氢酶浓度较低且具显著差异。施予本发明的心脏麻痹液的大鼠心脏，释出的乳酸脱氢酶浓度低于施予其他三种心脏麻痹液的大鼠心脏所释出的乳酸脱氢酶浓度，表示相较于其他三种心脏麻痹液，本发明的心脏麻痹液预防组织损伤的功效较优。
本领域技术人员可理解可对于上述实施例进行变化，仍不脱离本发明的概念。因此，可理解本发明不受限于所公开的实施例，而是涵盖权利要求所定义的本发明的精神与范围内的修饰。
可理解前述的一般描述与以下详细的描述皆为例示且仅供说明，而非用于限制权利要求所主张的本发明。
根据详细说明，可进行上述与其他变化。通常，除非上述详细说明清楚定义该语词，否则以下揭露内容所使用的语词不被解读为将技术限制为说明书中所公开的特定实施例。据此，技术的实际范围包含所公开的实施例以及实施该技术的所有均等方式。

Claims (24)

1.一种心脏麻痹液，包含溶于水的钾离子(K+)、镁离子(Mg2+)、钠离子(Na+)、氯离子(Cl-)、葡萄糖酸根离子、醋酸根离子、硫酸根离子(SO4 2-)、THAM与甘露醇，其中钾离子(K+)浓度为约27到约33mEq/L，镁离子(Mg2+)浓度为约16到约20mEq/L，钠离子(Na+)浓度为约120到约146mEq/L，氯离子(Cl-)浓度为约106到约130mEq/L，葡萄糖酸根离子浓度为约20到约24mmol/L，醋酸根离子浓度为约22到约28mmol/L，硫酸根离子(SO4 2-)浓度为约6到约9mmol/L，THAM浓度为约5到约30mmol/L，甘露醇浓度为约2到约5g/L。
2.如权利要求1所述的心脏麻痹液，其中钾离子(K+)浓度为约29.63mEq/L，镁离子(Mg2 +)浓度为约18.39mEq/L，钠离子(Na+)浓度为约133.80mEq/L，氯离子(Cl-)浓度为约118.51mEq/L，葡萄糖酸根离子浓度为约21.98mmol/L，醋酸根离子浓度为约25.81mmol/L，硫酸根离子(SO4 2-)浓度为约7.76mmol/L，THAM浓度为约20mmol/L，甘露醇浓度为约3.116g/L。
3.如权利要求1所述的心脏麻痹液，另包含利多卡因，其中该利多卡因于心脏麻痹液中的浓度为约0.1到约0.14mg/mL。
4.如权利要求1所述的心脏麻痹液，另包含完全充氧的病人血液，该完全充氧的病人血液与权利要求1所述的心脏麻痹液体积比例为约1：1到约1：8。
5.如权利要求1所述的心脏麻痹液，其中该心脏麻痹液维持约8.2到约8.6的pH值达365日。
6.如权利要求1所述的心脏麻痹液，其中该心脏麻痹液不含钙。
7.如权利要求1所述的心脏麻痹液，其中该心脏麻痹液不含碳酸氢钠。
8.一种制备如权利要求1所述的心脏麻痹液的方法，包含以下步骤：
(a)、于水中加入氯化钠(NaCl)、葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)、三水合醋酸钠USP(C2H3NaO2·3H2O)、氯化钾USP(KCl)、六水合氯化镁USP(MgCl-2·6H2O)、七水合硫酸镁USP(MgSO4·7H2O)与甘露醇USP(C6H14O6)；及
(b)、在由步骤(a)所得的溶液中混入THAM与冰醋酸；
其中于水中的氯化钠(NaCl)浓度为约75到约95mmol/L、葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)浓度为约20到约24mmol/L、三水合醋酸钠USP(C2H3NaO2·3H2O)浓度为约22到约28mmol/L、氯化钾USP(KCl)浓度为约27到约33mmol/L、六水合氯化镁USP(MgCl-2·6H2O)浓度为约1.2到约1.6mmol/L、七水合硫酸镁USP(MgSO4·7H2O)浓度为约6到约9mmol/L、甘露醇USP(C6H14O6)浓度为约15到约20mmol/L；
其中藉由将THAM与冰醋酸混入于由步骤(a)所得的溶液时，调整溶液至所欲pH值范围约8.2到约8.6，且THAM浓度达到约5到约25mmol/L。
9.如权利要求8所述的方法，其中于水中的氯化钠(NaCl)浓度为约86.02mmol/L、葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)浓度为约21.99mmol/L、三水合醋酸钠USP(C2H3NaO2·3H2O)浓度为约25.85mmol/L、氯化钾USP(KCl)浓度为约29.59mmol/L、六水合氯化镁USP(MgCl-2·6H2O)浓度为约1.41mmol/L、七水合硫酸镁USP(MgSO4·7H2O)浓度为约7.76mmol/L、甘露醇USP(C6H14O6)浓度为约17.1mmol/L；
其中，藉由将THAM与冰醋酸混入于由步骤(a)所得的溶液中时，调整溶液至所欲pH值范围约8.2到约8.6，且THAM浓度达到约20mmol/L或约10mmol/L。
10.如权利要求8所述的方法，另包含加入利多卡因的步骤，使该利多卡因于该心脏麻痹液中的浓度约0.1到约0.14mg/mL。
11.如权利要求8所述的方法，另包含加入完全充氧病人血液的步骤，使完全充氧病人血液与如权利要求1所述的心脏麻痹的体积比例为约1：1到约1：8。
12.如权利要求8所述的心脏麻痹液，其中该心脏麻痹液不含钙。
13.如权利要求8所述的心脏麻痹液，其中该心脏麻痹液不含碳酸氢钠。
14.如权利要求8所述的方法，其中该步骤可于使用该心脏麻痹液前365日完成。
15.一种制备如权利要求1的心脏麻痹液的方法，包含以下步骤：
(a)、于Plasma-Lyte A基础溶液中混入甘露醇、硫酸镁、THAM与氯化钾；及
(b)、混入THAM与冰醋酸，以调整溶液pH值至约8.2到约8.6；
其中将约15到约19mmol甘露醇、约5到约10mmol硫酸镁，与约22到约27mmol氯化钾加入1L Plasma-Lyte A基础溶液中；
其中每1L Plasma-Lyte A基础溶液包含约140mEq钠离子(Na+)、约5mEq钾离子(K+)、约3mEq镁离子(Mg2+)、约98mEq氯离子(Cl-)、约27mEq醋酸根离子，与约23mEq葡萄糖酸根离子。
16.如权利要求15所述的方法，其中甘露醇、硫酸镁、THAM与氯化钾可在使用该心脏麻痹液前365日加入至Plasma-Lyte A基础溶液。
17.如权利要求15所述的方法，另包含加入利多卡因的步骤，使利多卡因于该心脏麻痹液中的浓度约0.1到约0.14mg/mL。
18.如权利要求15所述的方法，另包含加入完全充氧病人血液的步骤，使完全充氧病人血液与如权利要求1所述的心脏麻痹的体积比例为约1：1到约1：8。
19.如权利要求15所述的方法，其中该心脏麻痹液储存于室温。
20.一种于心脏手术时施予如权利要求1所述的心脏麻痹液，引致心脏暂时性麻痹的方法，其包含以如权利要求3的心脏麻痹液灌注病人心脏。
21.如权利要求20所述的方法，其中该心脏麻痹液于低温施予病人。
22.如权利要求20所述的方法，其中该心脏麻痹液于常温施予病人。
23.如权利要求20所述的方法，其中该心脏麻痹液于手术中只施予一次。
24.如权利要求20所述的方法，其中该心脏麻痹液于手术中施予超过一次。
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