CN101978048A - 从新生儿脐带制备成纤维细胞样细胞的方法 - Google Patents

从新生儿脐带制备成纤维细胞样细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程。从新生儿脐带制备成纤维细胞样细胞的本发明方法包括制备新生儿脐带的片段，匀浆，通过用含有1∶1的I型和IV型胶原酶的溶液处理来提取成纤维细胞，匀浆液与酶溶液之比是1∶5。该方法可能提高成纤维细胞产量，便于使用并能在实验室接受材料后冷冻保存这些细胞约25-30天。

Description

从新生儿脐带制备成纤维细胞样细胞的方法
发明领域
本发明涉及生物技术，即，涉及从脐带产生成纤维细胞样细胞的方法和它们的应用。产生的成纤维细胞可广泛用于医学实践。
目前认为脐带是产生几类细胞的来源，包括人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)和成纤维细胞(FPC)。全球有许多研究组织利用HUVEC。在药理学、药代动力学和其它研究中，通常利用非传代的内皮细胞。
发明背景
本领域有正常分娩后，利用脐带片段从新生儿脐带获得同种异体成纤维细胞的方法。在脐带静脉的两侧插入导管，先用汉克液(Hank′s solution)，再用DMEM配制的0.1％I型胶原酶溶液冲洗。然后在37℃温育该片段30分钟，最后搅拌脐带组织。通过汉克液冲洗来收集分离的细胞。将得到的细胞悬液经1000转/分钟离心5分钟以收集细胞残留物，然后重悬在含10％牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF的DMEM生长培养基中。将重悬在DMEM生长培养基中的细胞残留物转移至培养板，每周更换DMEM生长培养基两次来培养直至形成单层。形成单层时，以1∶3的比例再次接种细胞。给定的方法描述于2007年10月27日的RU 2308957，我们接受其作为最接近的类似方法。该方法的缺点在于，例如成纤维细胞产量低以及只获得脐带静脉的成纤维细胞，从而限制了它们的进一步分化能力和应用。
附图简述
图1第二代和第四代后的成纤维细胞样细胞培养物。
图2第二代和第四代后，细胞中的波形蛋白表达。
图3培养第7天时的HUVEC原代培养物。
图4细胞中I型胶原的表达。
图5第4代后，细胞中IV型胶原的表达。
发明详述
我们的目的是开发一种从脐带的完整组织制备成纤维细胞样细胞的简便方法，从而能分离静脉的成纤维细胞和间充质，真皮及基质成纤维细胞。
我们的工作提出了从新生儿脐带制备成纤维细胞样细胞的方法，该方法包括以下步骤：
1.制备脐带的片段；
2.将制备的片段匀浆；
3.用含有1∶1的I型胶原酶和IV型胶原酶的溶液处理该匀浆液；匀浆液与酶溶液之比是1∶5；
4.过滤，离心滤液从而产生残留的成纤维细胞样细胞。
所提出的制备成纤维细胞样细胞的方法不仅能提高成纤维细胞产量，从而能有效使用昂贵的生物材料--脐带，还能制备各种胚胎成纤维细胞样细胞，例如间充质、真皮和基质成纤维细胞。分离的各种细胞能进一步分化成间充质细胞，例如心肌细胞。基质成纤维细胞可在其它因素影响下进一步分化成软骨、肌肉、骨和其它细胞，例如神经元或产胰岛素的细胞。胚胎真皮成纤维细胞样细胞可分化成角质形成细胞和真皮成纤维细胞。因此，可采用本发明方法和所产生的细胞来制备以上细胞。
制备脐带片段的步骤还可包括分离脐带静脉的内皮细胞。采用该步骤，可从同一份样品制备两种和更多种细胞类型。
发明实施方式
得到志愿产科患者的知情同意前提下，在产科医院获得正常分娩后的人脐带。
作HIV、RW及乙型肝炎和丙型肝炎标记强制血检，并且检验结果呈阴性，遵从所有无菌和消毒的规定收集生物材料。
收集生物材料不许污染任何物质。
在为仅处理人生物材料而设计的实验室中对生物材料进行所有操作。
对人生物材料的处理必须符合1985年9月17日由公共卫生部(Minzdrav)第4-42-4-85号批准的“Regulations for sterility control of the preserved blood，blood components，preserved bone marrow products，volume expanders andpreserving solutions(保存血液、血液组分、保存骨髓产品、容积膨胀剂和保存溶液的无菌控制条例)”。
在II型生物安全层流通风橱的无菌条件下进行生物材料的所有操作。
制备脐带片段包括以下操作。
1.用汉克溶液洗去血液和粘液凝块。
2.利用含抗生素和两性霉素B的汉克溶液，以注射器冲洗脐带静脉。
3.将脐带切成2cm长的小片。各片纵向切割并用汉克溶液冲洗。
从脐带分离成纤维细胞样细胞包括以下操作：
1.将制备的脐带片段匀浆。
2.将得到的混合物装入试管，以1∶5的比例加入胶原酶I和胶原酶IV(酶比例是1∶1)的混合工作溶液。
3.发酵该生物材料，同时间歇搅拌试管内含物。温育时间取决于溶液中的酶浓度及其活性。
4.发酵的悬浮液经双重筛网过滤澄清除去其余未发酵的组织碎片和过量的胶原。
5.过滤后，将得到的悬浮液装入离心管，离心获得残留的成纤维细胞。
在制备脐带片段的同时分离内皮细胞是合理的。为此，可在冲洗涤脐带后进行额外的操作。
1.固定脐带一端，用发酵溶液(分散酶溶液-2.5mg/nl)填充静脉。再固定第二端以控制静脉气密性。
2.然后将样品在CO2中温育15分钟。
3.为促进酶接近静脉壁的每一点，揉捏脐带。
4.用无菌汉克溶液，然后用生长培养基冲洗静脉内含物两次。
5.吸取产生的细胞悬液，然后离心获得残留内皮细胞。
通过以下实施例可证实该方法的可行性。
实施例1.分离成纤维细胞样细胞
在层流通风橱的无菌条件下，从容器中取出分娩的脐带(7-10cm长的片段)放入佩特里细菌培养皿(俄罗斯制造)，该培养皿中含有加入抗生素和两性霉素B的汉克溶液(盘古公司(PanEco)等制造)。用汉克溶液(盘古公司等制造)洗去生物材料的血液和粘液凝块，更换该溶液三次。找到脐带静脉的位置后，用无菌镊子将其末端撑大，将填充有汉克溶液的2ml注射器尖端插入该静脉。用含抗生素和两性霉素B的无菌汉克溶液(盘古公司等制造)冲洗该静脉两次。将脐带切成2cm长的小片。各片纵向切割，用汉克溶液冲洗并匀浆。将得到的混合物装入15ml离心管(或装入50ml试管)，以1∶5的比例加入胶原酶I和胶原酶IV(1∶1)的0.075％混合工作溶液。用液体无血清和无谷氨酰胺DMEM生长培养基稀释酶来制备工作溶液(盘古公司等制造)。
37℃，发酵生物材料8-10小时，间歇混合试管内含物。通过改变悬浮液粘度评估酶处理效率。粘度显著增加后必须停止温育。目测观察粘度急剧升高的时刻。
发酵的悬浮液经双重筛网过滤以除去其余未发酵的组织部分和过量的胶原。用汉克溶液(盘古公司等制造)冲洗试管和筛网。过滤后，将产生的悬液装入另一15ml离心管(或装入50ml离心管)，以1000转/分钟，g＝90离心15分钟。从而获得残留的成纤维细胞样细胞。
实施例2.连续分离内皮细胞和成纤维细胞样细胞
如实施例1所述进行连续操作。此外，用宝石钳固定经冲洗的脐带静脉一端。小心把持样品，用酶溶液(分散酶溶液-2.5mg/nl)填充静脉。用液体无血清和无谷氨酰胺生长培养基稀释酶来制备该溶液。再固定另一端以控制静脉气密性。将样品放入佩特里细菌培养皿(俄罗斯制造)，CO2中温育15分钟。每5分钟揉捏脐带以促进酶接触静脉壁的每一点。15分钟时，将样品移入层流通风橱，除去宝石钳，用无菌汉克溶液(盘古公司等制造)，然后用生长培养基冲洗静脉内含物两次。吸取产生的细胞悬液，然后以1000转/分钟离心5分钟。获得残留内皮细胞。
分离内皮细胞后，将脐带片段置于另一佩特里细菌培养皿，该培养皿中含有加入抗生素和两性霉素B的汉克溶液(盘古公司等制造)。然后用汉克溶液冲洗该片段，更换该溶液两次。将脐带片段切成2cm长的小片。如实施例1所述分离成纤维细胞。
必须注意，酶处理持续时间取决于溶液中的酶浓度、不同生产商的酶产品的活性和许多其它因素。目测观察到悬液粘度急剧升高之时，停止对样品的操作。
实施例3.培养成纤维细胞和内皮细胞
将离心获得的细胞残留物重悬在生长培养基中，用Goryaev照相机计数分离细胞的数量。将产生的悬液置于佩特里细菌培养皿(格莱内尔公司(Greiner)或康宁公司(Corning))。
为培养从脐带分离的成纤维细胞样细胞，可利用任何合适的生长培养基，例如以下组成的培养基：1∶1比例的液体DMEM/F12培养基(盘古公司等)、10％胎儿克隆1血清(海克隆公司(Hyclone)等)、1X ITS(海克隆公司等)、1ng/ml bFGF(卡米康公司(Chemicon)等)、5U/ml肝素(盘古公司等)、50mg/ml庆大霉素(盘古公司等)。所有组分按1升DMEM/F12培养基计算。
为培养从脐带分离的内皮细胞，可利用任何合适的生长培养基，例如以下组成的培养基：含Erl盐的199培养基(盘古公司等)、20％胎儿克隆1血清(海克隆公司等)、1％抗生素(盘古公司等)、2.5ng/ml表皮生长因子(卡米康公司等)、HEPES溶液(盘古公司等)、7％NaHCO3溶液(盘古公司等)。
以5x103个细胞/cm2的密度接种内皮细胞，以104个细胞/cm2的密度接种成纤维细胞样细胞。
在标准条件下培养细胞：37℃，5％CO2，每2-3天更换培养基。当长到70-80％汇合时传代培养物。传代前，倒出培养基，用维尔烯溶液(Versen solution，盘古公司等)冲洗平板三次。将平板内含物浸渍在0.25％胰蛋白酶溶液中，4-7分钟。充分搅拌后，将细胞悬液以8,000-15,000个细胞/cm2的密度分配在另一佩特里细菌培养皿(格莱内尔公司或康宁公司)中。接种后，首次传代在12-14天进行。然后，成纤维细胞样细胞的数量每48-72小时翻倍。相应地，从第二代开始每代之间是2-3天。
培养时，成纤维细胞样细胞只在粘附于培养皿表面(佩特里细菌培养皿或培养瓶)时才生长。在所有培养期间，它们维持二倍体核型和高增殖活性4-6代(图1)。
经培养的人脐带分离的成纤维细胞样细胞表达波形蛋白、I和IV型胶原(图2、4、5)、α-肌动蛋白和其它(硫酸软骨素、弹性蛋白、纤连蛋白、角蛋白18、角蛋白19、硫酸肝素)，但它们不表达CD45、CD11b、CD14并且组织相容性抗原表达低。
通常利用脐带静脉的非传代内皮细胞。内皮细胞只在粘附于培养皿表面(佩特里细菌培养皿或培养瓶)时才生长，并且具有内皮细胞的典型表型(图3)。
实施例4.成纤维细胞的冷冻保存
成纤维细胞样细胞培养达到第四代时，将这些细胞冷冻保存在10mln冷冻小瓶中。
为消除冷冻保存前可能的细菌和病毒污染，一部分细胞经历彻底的细菌和病毒控制(产品污染控制)，再冷冻保存其余细胞。
检验细胞的：
-细菌污染，
-真菌污染，
-是否存在乙型肝炎病毒DNA，
-是否存在丙型肝炎病毒RNA，
-是否存在HIV-1原病毒DNA，
-是否存在HIV-2原病毒DNA，
-是否存在HSV-1DNA，
-是否存在HSV-2DNA，
-是否存在巨细胞病毒DNA，
-是否存在弓形体DNA，
-是否存在支原体DNA。
对于冷冻保存，从佩特里细菌培养皿挑取含汇合单层培养物的条件化培养基。用维尔烯溶液冲洗细胞培养物三次，37℃，5％CO2下胰蛋白酶处理10分钟。匀浆得到的悬液，用Goryaev照相机计数分离细胞。以1000转/分钟离心匀浆液。除去上清液，将细胞以每1ml冷冻保存介质10mln细胞的浓度重悬在冷冻保存介质中(胎儿克隆1人脐带血血清和7％二甲基亚砜)。用5ml移液管将细胞悬液加入2ml冷冻小瓶。按照标准模式对冷冻小瓶作标记。细胞在特定冰箱中进行控速冷冻至最低-80℃，然后置于冷冻保存设备的含液氮杜瓦瓶中。可从7-10cm脐带分离最多200mln的第四代成纤维细胞样细胞。实验室接受生物材料后可获得并冷冻保存这些200mln成纤维细胞约25-30天。

Claims (2)

1.一种从新生儿的脐带制备成纤维细胞样细胞的方法，包括制备人脐带的片段，在用I型胶原酶溶液处理该片段和离心之时分离成纤维细胞样细胞，其中所制备的脐带片段经匀浆，用含有1∶1的I型和IV型胶原酶的溶液处理该匀浆液，匀浆液与酶溶液之比是1∶5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在制备脐带片段的同时从脐带静脉分离内皮细胞。
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