RU2744301C1 - Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из пупочного канатика новорожденного - Google Patents
Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из пупочного канатика новорожденного Download PDFInfo
- Publication number
- RU2744301C1 RU2744301C1 RU2020124246A RU2020124246A RU2744301C1 RU 2744301 C1 RU2744301 C1 RU 2744301C1 RU 2020124246 A RU2020124246 A RU 2020124246A RU 2020124246 A RU2020124246 A RU 2020124246A RU 2744301 C1 RU2744301 C1 RU 2744301C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- umbilical cord
- cells
- newborn
- homogenate
- stromal cells
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из Вартонова студня пупочного канатика новорожденного. Способ включает подготовку фрагмента пупочного канатика новорожденного, его механическое измельчение до получения гомогената, ферментативную обработку полученного гомогената раствором ферментов в соотношении 4:1, содержащим 0.2% коллагеназы NB4, 0.005% гиалуронидазы, 10% аккутазы, до образования вязкой суспензии с последующим фильтрованием суспензии и центрифугированием фильтрата с получением осадка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Изобретение позволяет обеспечить высокий выход жизнеспособных клеток из пупочного канатика (30-31×103 кл/см2 через 5 суток при жизнеспособности до 98%) при сокращении времени обработки материала до 3-4 ч. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из основного вещества пупочного канатика новорожденного (МСК ПК) и может быть использовано, в частности, для получения клеточных продуктов для регенеративной медицины. Кроме того, изобретение может найти применение при создании препаратов на основе МСК для лечения пациентов с COVID-19 (терапии и профилактика острого респираторного дистресс-синдрома, вызванного коронавирусной инфекцией).
Уровень техники
МСК находят множество применений в разных областях регенеративной медицины. Это связано с тем, что они обладают несколькими значительными преимуществами: 1) многообразие источников МСК, 2) способность к миграции в поврежденную ткань, 3) высокий пролиферативный потенциал и способность к дифференцировке в разные типы клеток, 4) низкая иммуногенность и при этом ярко выраженные иммуномодуляторные свойства, что позволяет в том числе производить трансплантацию аллогенных клеток, 5) отсутствие этических противоречий при клиническом применении (Naji A, Eitoku M, Favier B, Deschaseaux F, Rouas-Freiss N, Suganuma N. Biological functions of mesenchymal stem cells and clinical implications. Vol. 76, Cellular and Molecular Life Sciences. Birkhauser Verlag AG; 2019. p. 3323–48; Xu T, Zhang Y, Chang P, Gong S, Shao L, Dong L. Mesenchymal stem cell-based therapy for radiation-induced lung injury. Vol. 9, Stem Cell Research and Therapy. BioMed Central Ltd.; 2018. p. 1–7). Перспективным из-за большого количества доступного материала и отсутствия этических противоречий источником МСК становится пупочный канатик новорожденного. Более того, сравнение профилей экспрессии генов МСК ПК с самым распространенным типом МСК, выделенных из костного мозга, показало, что в МСК ПК выше экспрессия генов, связанных с межклеточной адгезией, иммуномодуляцией и нейротрофическими факторами (Donders R, Bogie JFJ, Ravanidis S, Gervois P, Vanheusden M, Marée R, et al. Human Wharton’s Jelly-Derived Stem Cells Display a Distinct Immunomodulatory and Proregenerative Transcriptional Signature Compared to Bone Marrow-Derived Stem Cells. Stem Cells Dev [Internet]. 2018 Jan 15 [cited 2020 Apr 28];27(2):65–84. Available from: https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/scd.2017.0029). МСК ПК секретируют почти в 10 раз больше TGF-β, меньше VEGF-α и MMP, чем МСК из жировой ткани (Dabrowski FA, Burdzinska A, Kulesza A, Sladowska A, Zolocinska A, Gala K, et al. Comparison of the paracrine activity of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord, amniotic membrane and adipose tissue. J Obstet Gynaecol Res [Internet]. 2017 Nov 1 [cited 2020 Apr 28];43(11):1758–68. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/jog.13432). Эти свойства делают основное вещество пупочного канатика более предпочтительным источником МСК для лечения заболеваний дыхательной системы из-за высокого уровня секреции одного из ключевых факторов, отвечающих за иммуномодуляторные свойства МСК (TGF-β), а также низкого уровня экспрессии металлопротеиназ, влияющих на целостность эндотелия лёгких. Фенотип, иммуномодулирующие и проангиогенные свойства МСК ПК не изменяются после криоконсервации (Barcia R.N. et al. Umbilical cord tissue–derived mesenchymal stromal cells maintain immunomodulatory and angiogenic potencies after cryopreservation and subsequent thawing //Cytotherapy. 2017. Vol. 19. №. 3. p. 360-370 10.1016/j.jcyt.2016.11.008), то есть можно создавать банки клеток и хранить полученные биомедицинские клеточные продукты в замороженном виде.
Для выделения МСК ПК применяют как механическое измельчение с последующим выселением клеток из эксплантатов, так и различные варианты ферментативной обработки. При выделении из эксплантатов нет повреждающего действия ферментов на клетки, но выселение МСК ПК из плотной стромы внеклеточного матрикса происходит медленно и может занимать 3-4 недели. Внеклеточный матрикс основного вещества пупочного канатика состоит из коллагенов (I, III, VI. IV и VII типов), гликозаминогликанов, преимущественно представленных гиалуроновой кислотой, и протеогликанов, формирующих механически прочные фибриллы с развитой сетью каналов (Dan P. et al. Human-derived extracellular matrix from Wharton’s jelly: an untapped substrate to build up a standardized and homogeneous coating for vascular engineering //Acta biomaterialia. 2017. Vol. 48. p. 227-237; Can A., Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus‐derived stem cells //Stem cells. 2007. Vol. 25. №. 11. p. 2886-2895.). Основное вещество пупочного канатика представлено уникальной слизистой или студенистой соединительной тканью, Вартоновым студнем, не встречающимся у взрослого организма. Особенность губкоподобной структуры при высокой механической прочности данной ткани обусловлена как раз строением внеклеточного матрикса. Чтобы выделить из Вартонова студня жизнеспособные клетки после ферментативной обработки используют или различные коллагеназы или комбинации ферментов, сочетая действие коллагеназ и пептидаз, добавляя иногда гиалуронидазу. Но несмотря на большое количество вариантов ферментативной обработки, до сих пор не подобраны параметры для быстрого выделения жизнеспособных клеток с высоким выходом и стабильно хорошей пролиферацией (Varaa N. et al. Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cell: Various Protocols for Isolation and Differentiation of Hepatocyte-Like Cells; Narrative Review //Iranian Journal of Medical Sciences. 2019. Vol. 44. №. 6. p. 437).
Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного (патент РФ №2710263), включающий забор и подготовку пуповины; ее механическое измельчение; ферментативную обработку; выделение суспензии клеток в результате процессов фильтрования и центрифугирования. При этом пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0.02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость утилизируют, осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×105 жизнеспособных кл./см2 в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой.
Недостатком известного способа является долгое время обработки материала, длительное центрифугирование с изменением температурных режимов. Кроме того, входящая в состав раствора Версена этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хелатируя ионы кальция, снижает адгезионную способность клеток.
Известен способ выделения МСК ПК из Вартонова студня, основанный на обработке кусочков ПК объемом 1-3 мм3 коллагеназой IV типа (Заявка США US20180362923).
Однако данный способ характеризуется использованием единственного фермента и длительным временем обработки материала, достигающим 8-12 часов.
При использовании смеси ферментов для выделения клеток, как правило, наиболее длительным этапом является обработка и инкубация материала с ферментами, особенно при их последовательном применении. Например, известно последовательное применение ферментов: 1 мг/мл коллагеназы типа B - в течение 3 часов, затем 2.5 мг/мл трипсина - в течение 30 мин (AM S. P. A. N. B. A. Omar AR Mohit M Janzamin E Samani FS Torshizi Z Nematollahi-Mahani SN 2012 Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton’s jelly //Vitro Cellular and Developmental Biology–Animal. Vol. 48. p. 75-83.). Известен также способ выделения МСК, включающий обработку неизмельченных фрагментов пупочного канатика длиной 3-5 см смесью 300 ед/мл коллагеназы I типа и 1 мг/мл гиалуронидазы в течение часа, отмывку, механическое измельчение и инкубацию в 0.1% растворе трипсин-ЭДТА в течение 30 мин (Seshareddy K., Troyer D., Weiss M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord //Methods in cell biology. 2008. Vol. 86. p. 101-119.).
Недостатками описанных примеров выделения МСК ПК являются долгая обработка материала и применение последовательно различных ферментов с промежуточными этапами трудоемкой пробоподготовки.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного (патент РФ №2384618), согласно которому осуществляют подготовку фрагмента пупочного канатика; его механическое измельчение; ферментативную обработку; фильтрование полученной суспензии и центрифугирование. При этом ферментативную обработку проводят с помощью смеси 0,075% растворов коллагеназы типа I и коллагеназы типа IV при соотношении концентраций ферментов 1:1 в объемной пропорции гомогената к рабочему раствору ферментов 1:5.
Недостатком известного способа является длительная ферментативная обработка гомогената в течение 8-10 часов, что может негативно сказаться на жизнеспособности клеток, влияя на их мембрану и адгезионные свойства. Кроме того, использование материала после естественных родов может увеличить риск контаминации полученных культур, а отсутствие анализа жизнеспособности выделенных клеток не позволяет оценить эффективность выхода живых клеток из основного вещества пупочного канатика описанным способом.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка простого способа получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из основного вещества пупочного канатика новорожденного, обеспечивающего высокий выход жизнеспособных клеток со стабильно хорошей пролиферацией при сокращении времени обработки материала до 3-4 часов.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом изобретения является обеспечение высокого выхода жизнеспособных клеток из пупочного канатика (30-31×103 кл/см2 через 5 суток при жизнеспособности до 98%) при сокращении времени обработки материала до 3-4 часа.
Технический результат достигается за счет реализации способа получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из Вартонова студня пупочного канатика новорожденного, включающий подготовку фрагмента пупочного канатика новорожденного, его механическое измельчение до получения гомогената, ферментативную обработку полученного гомогената до образования вязкой суспензии с последующим фильтрованием суспензии и центрифугированием фильтрата с получением осадка мезенхимных стромальных клеток. При этом ферментативную обработку проводят раствором ферментов, содержащим 0.2% коллагеназы NB4, 0.005% гиалуронидазы, 10% аккутазы, при этом раствор ферментов и гомогенат берут в объемном соотношении 4:1.
Пупочный канатик новорожденного получают после операции кесарева сечения.
Подготовку фрагмента пупочного канатика новорожденного осуществляют не позднее 5 часов после родов.
Раствор ферментов готовят на ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением L-глутамина.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежом, где на Фиг. 1 представлена морфология культур МСК ПК нулевого пассажа (А) и четвертого пассажа (Б).
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Пупочный канатик человека получают после родов за счет кесарева сечения в роддомах с добровольного информированного согласия роженицы. Забор биоматериала осуществляют с соблюдением всех правил асептики и антисептики после проведения предварительного обязательного анализа крови на ВИЧ, RW и маркеры гепатита В и С и получения отрицательных анализов на инфицированность. Противопоказанием к забору материала является инфицированность по одному из агентов. Всю дальнейшую работу с биоматериалом ведут в лаборатории, которая предназначена только для работы с человеческим биоматериалом. Работу с человеческим биоматериалом осуществляют в соответствии с соблюдением всех норм по работе с биомедицинскими клеточными продуктами, (прежде всего, установленных в Федеральном законе от 23 июня 2016 года № 180 «О биомедицинских клеточных продуктах» и Приказом МЗ №512н «Правила надлежащей практики по работе с биомедицинскими клеточными продуктами»). Все работы с биоматериалом проводят в стерильных условиях ламинарного бокса II-го класса биологической защиты. Обработку биоматериала начинают не позже, чем через 5 часов после родов.
Осуществляют подготовку фрагмента пупочного канатика следующим образом.
Поступившие фрагменты пупочного канатика длиной 8-10 см отмывают от сгустков крови в физиологическом растворе с добавлением антибиотиков и антимикотика (например, пенициллин-стрептомицин 1:100, гентамицин 50 мкг/мл, флуконазол 0.2% раствор 3:100). Отмытый фрагмент пупочного канатика разрезают на куски по 2-3 см длиной. Каждый из полученных кусков разрезают продольно, удаляют кровеносные сосуды (1 пупочную вену и 2 пупочные артерии). Далее осуществляют выделение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, для чего подготовленные фрагменты пупочного канатика механически дезагрегируют на кусочки объемом не более 1 мм3. Полученную массу переносят в центрифужные пробирки и добавляют раствор ферментов, содержащий 0.2% коллагеназы NB4, 0.005% гиалуронидазы, 10% аккутазы (в конечной концентрации), приготовленный на стандартной ростовой среде (например, DMEM/F12 1:1 с добавлением L-глутамина без сыворотки (БиолоТ, 1.3.7.1) или DMEM/F12 1:1 (ПанЭко, C470п) с добавлением 146 мг L-глутамина (ПанЭко, Ф032) на 450 мл среды, или аналогичный), в объемной пропорции гомогената к раствору ферментов 1:4. Ферментируют материал при +37оС на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 25-30 раз/мин, до образования вязкой суспензии. Продолжительность инкубации зависит от активности ферментов, но не превышает 2 часов (предпочтительно, 1-2 часа). Полученную после ферментирования суспензию пропускают через клеточное сито с размером пор 70-100 мкм для очистки от остатков неферментированных кусков ткани и избытка коллагена. Полученную после фильтрования суспензию переносят в новые центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 6-7 мин при ускорении 100g с получением осадка МСК ПК.
Пример 1. Получение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из основного вещества пупочного канатика.
В стерильных условиях ламинарного бокса перекладывали поступившие после родов за счет кесарева сечения фрагменты пупочного канатика (3 фрагмента, каждый длиной 10 см) из транспортного контейнера в индивидуальные стерильные центрифужные пробирки на 50 мл, добавляли по 30 мл физиологического раствора (фирмы БиолоТ) с добавлением антибиотиков и антимикотика (100-кратный раствор пенициллин-стрептомицин 300 мкл (пенициллин 5000 ME/мл, стрептомицин 5000 мкг/мл), гентамицин 50мкг/мл, флуконазол 0.2% раствор 900 мкл). Инкубировали 15 мин, сливали раствор и заливали 30 мл свежего физиологического раствора с добавлением антибиотиков и антимикотика. Повторяли описанную процедуру. Отмытый фрагмент пупочного канатика переносили на сухую крышку стерильной чашки Петри диаметром 100 мм и разрезали на куски по 2-3 см длиной. Каждый из полученных кусков разрезали продольно, удаляли кровеносные сосуды (1 пупочную вену и 2 пупочные артерии) и промывали физиологическим раствором. Затем каждый из полученных кусков механически измельчали до однородного гомогената из кусочков объемом не более 1 мм3 с помощью лабораторного миксера. Полученный гомогенат переносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавляли раствор смеси ферментов, включающий 0.2% коллагеназы NB4, 0.005% гиалуронидазы, 10% аккутазы, в объемной пропорции гомогената к раствору ферментов 1:4. Ферменты разводили в жидкой ростовой среде DMEM/F12 1:1 с добавлением L-глутамина (БиолоТ, 1.3.7.1.). При этом для приготовления 50 мл раствора ферментов к 45 мл среды DMEM/F12 (1:1) с добавлением L-глутамина добавляли 5 мл раствора аккутазы (BD BioSciences, 561527), 100 мг коллагеназы NB4 (Nordmark, S1745403) и 2.5 мг гиалуронидазы (Sigma, 385931). Следует отметить, что риск контаминации культур при применении аккутазы ниже, чем при использовании трипсина, т.к. аккутаза не содержит продукты, полученные в клетках млекопитающих и бактериях. После полного растворения сухих компонентов рабочий раствор стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Ферментировали материал при +37оС на мини-рокер-шейкере (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого пробирок 30 раз/мин, до образования вязкой суспензии, которое наблюдали визуально. Инкубирование прекращали после значительного увеличения вязкости. Время инкубации составило 1.5 часа. После ферментирования полученную суспензию пропускали через клеточное сито с размером пор 70 мкм (фирмы Sigma), сито и пробирку промывали чистым физиологическим раствором (фирмы БиолоТ). Полученную после фильтрования и промывки суспензию переносили в новые центрифужные пробирки объемом 15 мл, центрифугировали в течение 7 мин, 1000 об/мин, 100g с получением в результате осадка МСК ПК. Общее время обработки материала составило 3.5 ч.
Пример 2. Культивирование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток основного вещества пупочного канатика.
Осадки МСК ПК, полученные после центрифугирования, ресуспендировали в ростовой среде, подсчитывали количество выделенных жизнеспособных клеток с помощью камеры Горяева или автоматического счетчика клеток (Countess фирмы Thermo или аналогичный), используя окрашивание 0.4% раствором трипанового синего для выявления погибших клеток (краситель проникает через поврежденные мембраны погибающих и погибших клеток). Высевали жизнеспособные клетки в плотности 10×103кл/см2 на адгезивные культуральные чашки Петри (Corning, 430167). Для культивирования МСК ПК использовали полную ростовую среду следующего состава: DMEM/F12 1:1 с добавлением L-глутамина (фирмы БиолоТ, 1.3.7.1.), сыворотка Fetal Clone III – 10% (фирмы HyСlone, SH30109.03), 100Х раствор инсулина-трансферрина-селенита, 1:100 (фирмы БиолоТ, 1.2.006.), основной фактор роста фибробластов bFGF 1 нг/мл (фирмы ПанЭко, ФР-07050), гентамицин 30 мкг/мл (фирмы ПанЭко, А011).
Культивировали МСК ПК в стандартных условиях в СО2 инкубаторе (фирмы Sanyo или аналогичный): при 37°С, 5% СО2, 100% влажности со сменой среды каждые 2-3 дня. Культуры пассировали при заполнении клетками 80-90% площади поверхности культуральных чашек. Перед пассированием сливали среду, 2 раза промывали чашку раствором Версена (фирмы БиолоТ, 1.2.3.2.), 2-5 мин инкубировали при 37°С в 0.25% растворе трипсина (фирмы БиолоТ, 1.2.2.5.), действие фермента инактивировали добавлением полной ростовой среды. Полученную суспензию равномерно распределяли на новые адгезивные культуральные чашки Петри в плотности 10×103кл/см2. Первое пассирование проводили через 5-6 суток после посадки, время удвоения МСК ПК составляло 37-42 часа. Начиная со второго пассажа, между пассажами проходило 2-3 сут. В таблице 1 приведены характеристики пролиферации, адгезии и жизнеспособности клеток через 5 суток после выделения.
Индекс адгезии выражали в процентах и определяли как отношение числа адгезированных клеток к посаженному через 24 часа после посадки клеток по формуле:
ИА= Х 2 *100/Х 1
где Х 1 – посевная доза, Х2 – количество клеток на пластике через 24 ч после посева (например, Гильмутдинова И. Р. и др. Исследование биологической совместимости биопластического материала «Гиаматрикс» на культуре дермальных фибробластов //Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2015. – Т. 17. – №. 2-2).
Индекс пролиферации определяли по формуле:
ИП= Х n+1 /Х n ,
где Х n – общее исходное число посеянных для каждой группы клеток, Х n+1 – общее число выращенных для каждой группы (например, Копаев С. Ю. Клинико-экспериментальное обоснование комбинированного использования неодимового ИАГ 1, 44 мкм и гелий-неонового 0, 63 мкм лазеров в хирургии катаракты //Дисс.… д. м. н./С.Ю. Копаев. – 2014.).
Время удвоения популяции оценивали по формуле:
T1/2=Tk*ln(2)/ln(Nk/N0),
где N – число клеток, посеянных в начале культивирования; Tк – длительность культивирования одного пассажа в часах; Nк – конечное число клеток через Тк (например, Зорин В. Л. и др. Оптимизация условий получения и ведения культур фибробластов кожи и десны человека //Гены и клетки. – 2014. – Т. 9. – №. 2.).
Жизнеспособность оценивали с помощью автоматического счетчика клеток (Countess фирмы Thermo), используя окрашивание 0.4% раствором трипанового синего для выявления погибших клеток, краситель проникает через поврежденные мембраны погибающих и погибших клеток (например, Митрошина Е. В., Мищенко Т. А., Ведунова М. В. Определение жизнеспособности клеточных культур. – 2015).
Таблица 1. Характеристики полученных культур МСК ПК
| Шифр культуры | Плотность монослоя через 5 суток (кл/см2) | Индекс адгезии (%) | Индекс пролиферации (отн.ед.) | Время удвоения (часы) | Живые клетки в культуре (%) |
| 1 | 30.09×103±6.7 | 87±0.4 | 1.5±0.2 | 42±0.5 | 88.6±0.4 |
| 2 | 31.01×103±4.5 | 91±0.7 | 1.5±0.3 | 37±0.8 | 98.2±0.5 |
| 3 | 30.52×103±7.5 | 90±0.6 | 1.5±0.5 | 39±0.7 | 95.0±0.8 |
Как видно из таблицы 1, клетки имели высокий индекс адгезии (87±0.4% - 91±0.7%), индекс пролиферации (1.5±0.3), процент жизнеспособных клеток в культурах составлял от 88.6 до 98.2%.
МСК ПК росли в культуре в прикрепленном к поверхности культуральной посуды состоянии, имели характерную фибробластоподобную морфологию (Фиг.1), диплоидный кариотип и высокую пролиферативную активность в течение 4-6 пассажей.
Иммунофенотип полученных МСК ПК соответствовал критериям МСК – клетки стабильно экспрессировали CD105, CD90, CD73, CD44 и не экспрессировали маркеры лимфоцитарного и гемопоэтического ряда (CD19, CD11b, CD45, CD34), а также не экспрессировали антиген II класса главного комплекса гистосовместимости HLA-DR и иммуноглобулин подкласса IgG1 (таблица 2).
Таблица 2. Иммунофенотипирование культур МСК ПК нулевого (р0) и четвертого (р4) пассажей методом проточной цитометрии
| Поверхностные маркеры | р0 | p4 | |
| Позитивные | CD44 | 99.94 | 100.00 |
| CD90 | 99.40 | 99.89 | |
| CD105 | 98.57 | 98.27 | |
| CD73 | 97.94 | 95.89 | |
| Негативные | Isotype IgG1 | 0.04 | 0.03 |
| CD19 | 0.07 | 0.01 | |
| CD11b | 0.07 | 0.01 | |
| CD45 | 0.07 | 0.01 | |
| CD34 | 0.07 | 0.01 | |
| HLA-DR | 0.07 | 0.01 |
Таким образом, применение в качестве раствора ферментов смеси, содержащей 0.2% коллагеназы NB4, 0.005% гиалуронидазы, 10% аккутазы, позволяет добиться высокого выхода жизнеспособных клеток при сокращении времени обработки материала до 3-4 часа. Уменьшение или увеличение концентрации ферментов приводило к понижению жизнеспособности и/или к уменьшению выхода клеток.
Claims (4)
1. Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из Вартонова студня пупочного канатика новорожденного, включающий подготовку фрагмента пупочного канатика новорожденного, его механическое измельчение до получения гомогената, ферментативную обработку полученного гомогената до образования вязкой суспензии с последующим фильтрованием суспензии и центрифугированием фильтрата с получением осадка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, отличающийся тем, что ферментативную обработку проводят раствором ферментов, содержащим 0,2% коллагеназы NB4, 0.005% гиалуронидазы, 10% аккутазы, при этом раствор ферментов и гомогенат берут в объемном соотношении 4:1.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пупочный канатик новорожденного получают после операции кесарева сечения.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что подготовку фрагмента пупочного канатика новорожденного осуществляют не позднее 5 часов после родов.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор ферментов готовят на ростовой среде DMEM/F12 1:1 с добавлением L-глутамина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124246A RU2744301C1 (ru) | 2020-07-21 | 2020-07-21 | Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из пупочного канатика новорожденного |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124246A RU2744301C1 (ru) | 2020-07-21 | 2020-07-21 | Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из пупочного канатика новорожденного |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2744301C1 true RU2744301C1 (ru) | 2021-03-05 |
Family
ID=74857784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020124246A RU2744301C1 (ru) | 2020-07-21 | 2020-07-21 | Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из пупочного канатика новорожденного |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2744301C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2073435C1 (ru) * | 1993-04-30 | 1997-02-20 | Московская государственная академия прикладной биотехнологии | Способ консервирования интактных клеток печени |
| RU2384618C2 (ru) * | 2008-03-27 | 2010-03-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного |
| WO2019123407A1 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Chiesi Farmaceutici S.P.A. | Mesenchymal stromal cells and methods for obtaining mesenchymal stromal cells from umbilical cord |
-
2020
- 2020-07-21 RU RU2020124246A patent/RU2744301C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2073435C1 (ru) * | 1993-04-30 | 1997-02-20 | Московская государственная академия прикладной биотехнологии | Способ консервирования интактных клеток печени |
| RU2384618C2 (ru) * | 2008-03-27 | 2010-03-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного |
| WO2019123407A1 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Chiesi Farmaceutici S.P.A. | Mesenchymal stromal cells and methods for obtaining mesenchymal stromal cells from umbilical cord |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| COROTCHI MC et al. "Isolation method and xeno-free culture conditions influence multipotent differentiation capacity of human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells", Stem Cell Res Ther. 2013; 4 (4): 81. * |
| HAN Y.-F. et al. "Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods", Cytotechnology. 2013; 65(5):819-827. * |
| HAN Y.-F. et al. "Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods", Cytotechnology. 2013; 65(5):819-827. COROTCHI M.C. et al. "Isolation method and xeno-free culture conditions influence multipotent differentiation capacity of human Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells", Stem Cell Res Ther. 2013; 4(4):81. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754674B (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN105238751B (zh) | 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 | |
| EP1999250B1 (en) | Method of cultivation of human mesenchymal stem cells, particularly for the treatment of non-healing fractures, and bioreactor for carrying out this cultivation method | |
| JP2010538681A (ja) | 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法 | |
| US10465167B2 (en) | Adjuvant for rapid proliferation of human mesenchymal stem cells in vitro, method for rapid proliferation of human mesenchymal stem cells in vitro, method for growth factor harvested from rapid proliferation of human mesenchymal stem cells in vitro and use thereof | |
| CN109804063A (zh) | 一种采用细胞培养基自脐带羊膜中分离间充质干细胞的方法 | |
| CN104726406A (zh) | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 | |
| CN104651305A (zh) | 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法 | |
| CN107502588B (zh) | 一种分离制备牙髓干细胞的方法 | |
| CN110623917A (zh) | 一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶 | |
| JP2021526125A (ja) | 間葉系幹細胞の創傷治癒特性を誘導するまたは改善する方法 | |
| CN108642002A (zh) | 一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法 | |
| CN114867347A (zh) | 间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法 | |
| EP2723850B1 (en) | Method for cultivating cells in platelet-lysate-containing medium | |
| CN111778206A (zh) | 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 | |
| CN109628388B (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| RU2530622C2 (ru) | Биотрансплантат для восстановления объема костной ткани при дегенеративных заболеваниях и травматических пвореждениях костей и способ его получения | |
| KR101380561B1 (ko) | 말과동물 양수 유래 다분화능 줄기세포 및 그 제조방법 | |
| CN111909898B (zh) | 一种人牙髓干细胞的分离和扩增方法及其应用 | |
| CN104031881B (zh) | 一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| RU2744301C1 (ru) | Способ получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из пупочного канатика новорожденного | |
| CN106591230A (zh) | 人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法 | |
| EP2277994B1 (en) | Method for producing fibroplast cells from the newborn's navel-cord | |
| CN106434543A (zh) | 一种培养基及细胞培养方法 | |
| CN110872574A (zh) | 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法 |