RU2519326C2 - Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения - Google Patents

Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения Download PDF

Info

Publication number
RU2519326C2
RU2519326C2 RU2011153873/15A RU2011153873A RU2519326C2 RU 2519326 C2 RU2519326 C2 RU 2519326C2 RU 2011153873/15 A RU2011153873/15 A RU 2011153873/15A RU 2011153873 A RU2011153873 A RU 2011153873A RU 2519326 C2 RU2519326 C2 RU 2519326C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
biocomposite
cells
carrier
nucleic acid
nucleic acids
Prior art date
Application number
RU2011153873/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011153873A (ru
Inventor
Артур Александрович Исаев
Сергей Львович Киселев
Роман Вадимович Деев
Илья Ядигерович Бозо
Елена Сергеевна Филоненко
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to RU2011153873/15A priority Critical patent/RU2519326C2/ru
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен"
Priority to EP12861904.6A priority patent/EP2797633B1/en
Priority to UAA201405515A priority patent/UA112450C2/uk
Priority to CN201280064772.0A priority patent/CN104203285A/zh
Priority to EA201400401A priority patent/EA031108B1/ru
Priority to PCT/RU2012/001103 priority patent/WO2013100818A2/en
Priority to US14/369,008 priority patent/US9730959B2/en
Priority to CA2866483A priority patent/CA2866483C/en
Priority to ES12861904.6T priority patent/ES2617338T3/es
Publication of RU2011153873A publication Critical patent/RU2011153873A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2519326C2 publication Critical patent/RU2519326C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/64—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)

Abstract

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию. Предложены способы получения вышеуказанного биокомпозита и набор для его приготовления. Предложены также способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего и способ доставки нуклеиновой кислоты. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную регенерацию тканей после повреждения у млекопитающего за счет использования трехкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Description

Группа изобретений относятся к медицине и ветеринарии и может быть использована для восстановления поврежденных тканей и органов млекопитающих.
Известные в настоящее время инновационные способы восстановления тканей и органов базируются на использовании тканеинженерных конструкций, содержащих либо различные клеточные популяции, либо разнообразные генетические конструкции (нуклеиновые кислоты). Однако оба направления - клеточное и генное - являются, хоть и перспективными, но умеренно ограниченно эффективными.
Известен способ местного введения только генетических конструкций с помощью ультразвука [1, 2]. Однако при безопасных для реципиента параметрах ультразвукового излучения эффективность введения генетических конструкций низкая. Доставка нужного количество генетических конструкций возможна только под действием ультразвука высокой интенсивности, который оказывает на ткани повреждающее действие [3, 4].
Известен способ местного введения нуклеиновых кислот в комплексе с липосомами [5] и его модификация - комбинированное введение конъюгата липосом с генетическим конструкциями под действием физических факторов (ультразвук) [6]. Однако значительная часть липосом разрушается под действием тканевых липолитических ферментов, что снижает эффективность доставки действующего вещества - нуклеиновых кислот. Оставшаяся часть поступает практически единовременно, что не позволяет добиться пролонгированного эффекта. Кроме того, при транспорте в клетки-мишени комплекс «липосома-генетическая конструкция» не разрушается - липосомы поступают в клетки, что снижает безопасность метода.
Известен способ введения нуклеиновых кислот с помощью электропорации [6, 7]. Однако метод основан на применении электрического поля, которое проталкивает генетические конструкции (в «чистом виде» или в комплексах со вспомогательными веществами) через биологические мембраны, в результате чего значительная часть генетических конструкций повреждается. Недостатком метода также является невозможность достичь пролонгированного эффекта, необходимость повторного применения метода.
Известен способ местного введения тканеинженерной конструкции, состоящей из трехмерного носителя и адгезированных к его поверхности клеток [8]. Однако клетки требуют активного кровоснабжения - критическая удаленность от гемомикроциркуляторного русла, более которой клетки неизбежно погибают, составляет 200-500 мкм [9]. В этой связи объем тканеинженерной конструкции, при котором клетки, входящие в ее состав, после введения в организм реципиента могут сохранить жизнеспособность, должны составлять не более 1 см3.
Дефекты такого размера вообще не нуждаются в дополнительных оптимизирующих ход восстановительного процесса влияниях, поэтому существует потребность в замещении протяженных (объемных) костных дефектов, в случае которых показаны к применению тканеинженерные конструкции значимо большего объема (от 1 см3). Однако трансплантация таких больших конструкций неизбежно сопровождается гибелью большей части вводимых клеток (особенно тех из них, которые локализованы в центральной части изделия и в наибольшей степени испытывают нехватку оксигенации), что существенно уменьшает эффективность метода. Клетки нуждаются в оксигенации, поэтому чем больше размер тканеинженерной конструкции, тем больше ее клеток погибает после трансплантации изделия. Таким образом, в тканеинженерных конструкциях больших размеров (более 1 см3) значительная часть клеток гибнет, в связи с чем эффективность целевого действия (обеспечения репаративного процесса) изделия становится сопоставима с эффективностью носителя без клеток вообще, что позволяет сделать следующие выводы: включение только лишь клеток в состав тканеинженерных конструкций не является в достаточной степени эффективным подходом; необходим поиск других более эффективных решений.
Из уровня техники известны активированная матрица, способ ее получения и способ местного введения нуклеиновых кислот на биосовместимых матрицах из различных материалов для обеспечения репаративных процессов [10]. Однако эти технические решения имеют отношение к строго двухкомпонентному продукту, состоящему только из носителя и генетических конструкций. Клеточный элемент, как критически необходимый для оптимального гистотипического восстановления тканей и органов, в данном случае отсутствует, поэтому эффективность применения продукта умеренная.
Ближайшим аналогом является частный вариант трехкомпонентного биокомпозита, состоящий из носителя из полилактокогликолида (PLGA), плазмидной ДНК с геном ВМР-4 и гетерогенной популяции предварительно культивированных стромальных клеток костного мозга [11]. Такой вариант биокомпозита имеет ряд недостатков. Во-первых, обладает недостаточно благоприятным механизмом синергичного действия клеток и генных конструкций, так как экспрессия плазмидных ДНК с геном ВМР-4 клетками материала или реципиента (после трансплантации) способствуют только дифференцировке клеток в остеогенном направлении, при этом не влияет на их выживаемость, которая остается все такой же низкой, как в случае трансплантации двухкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя и клеток. Эти недостатки были признаны и авторами данного исследования, в виду чего они были вынуждены усложнить биокомпозит, добавив к нему четвертый компонент - белок VEGF. Только в этом случае исследователи отметили выраженный положительный эффект в виде усиления гетеротопического остеогенеза. Однако использование в одной системе синтетического носителя, плазмидных ДНК, предварительно культивированных клеток и рекомбинантных белковых факторов роста обусловливает чрезмерную неоправданно высокую стоимость изделия. Кроме того, факторы роста (рекомбинантные белки) являются короткоживущими и короткодистантными, быстро распадаются в кислой среде операционной раны в условиях воспаления, характерного для первой стадии раневого процесса. В этой связи включенный в состав биокомпозита рекомбинантный белок не может в полной мере проявить свое теоретически возможное действие. Подтверждением тому являются данные авторов статьи, которые использовали белок VEGF в трехкомпопентной системе без плазмидных ДНК (носитель из PLGA + клетки + белок VEGF), что не привело к удобоваримому результату - эффективность такого биокомпозита была низкой. По мнению авторов, причиной недостаточной эффективности трехкомпонентных вариантов являлась ограниченность специфической функции каждого из компонентов биокомпозита, в связи с чем исследователи пошли по пути усложнения изделия и добавили четвертый компонент - плазмидные ДНК с геном, кодирующим BMP-4.
Необходимо отметить, что в большинстве исследований авторы ведут работу по пути усложнения биокомпозитов, включая в их состав все большее количество компонентов различной природы (материалы носителей, биологически активные белки, клеточные популяции, генные конструкции, фармацевтические субстанции, липосомальные элементы, экзосомы и т.д.). Однако наряду с возможным положительным эффектом таких систем обратной стороной их многокомпонентности может стать возникновение нежелательных явлений, в частности повышение риска развития реакции индивидуальной непереносимости (гиперчувствительности) к какому либо компоненту (чем больше компонентов, тем, закономерно, выше риск) и т.д. В этой связи идеальным вариантом являлось бы минимальное воздействие (минимальное количество компонентов биокомпозита) с оптимальной эффективностью. Наши изобретения позволяют решить крайне сложную задачу - создание биокомпозита с минимальным, но достаточным для обеспечения репаративной регенерации количеством компонентов, подбор их оптимального состава и технологии объединения в единое медицинское изделие.
Настоящая группа изобретений относится к принципиально новому подходу гистотипического заживления повреждения у млекопитающего за счет введения в организм реципиента единого генно-клеточного комплекса для оптимального - выраженного и пролонгированного - проявления целевого действия. При этом компоненты биокомпозита оптимально подобраны, а варианты технологии совмещения в единое изделие позволяют достичь максимальной концентрации генных конструкций и клеток при сохранении их биологической активности.
В нашем случае были использованы плазмидные ДНК с генами, кодирующими другие факторы роста: VEGF и (или) SDF-1, которые обладают более широким биологическим эффектом, включающим индукцию ангиогенеза. Именно активация ангиогенеза, привлечение дополнительных камбиальных клеток к месту трансплантации биокомпозита за счет экспрессии его генных конструкций обеспечивает в том числе и повышение выживаемости клеток, входящих в состав биокомпозита, что и обеспечивает синергичное действие всех компонентов биокомпозита и, как результат, высокую эффективность активизации репаративного процесса. Другими словами новизна подхода состоит в том, что компоненты, включенные в состав биокомпозита, нацелены не только на непосредственное обеспечение репаративного процесса за счет прямого влияния на клетки реципиентного ложа, но и характеризуются опосредованным действием на репаративную регенерацию посредством взаимного потенцирования: плазмидные ДНК обеспечивают выживаемость клеток биокомпозита, а клетки - доставку плазмидпых ДНК в целевую область, их экспрессию. При этом количество компонентов и сложность биокомпозита являются минимальными, но достаточными для высокой эффективности даже в случае «фреш-популяции» клеток (некультивированных, полученных непосредственно перед введением биокомпозита в организм реципиента), использование которых также удешевляет и ускоряет процесс изготовления биокомпозита.
Кроме того, необходимо отметить, что выбор носителя также является одним из наиболее проблемных аспектов создания биокомпозитов с биологически активными компонентами, особенно трехкомпонентных содержащих клетки и генетические конструкции одновременно. Носитель в этом случае должен обеспечивать как оптимальную адгезию клеток без снижения их морфофункциональной активности, так и характеризоваться высокой «емкостью» для генетических конструкций. При этом биорезорбция материала не должна быть быстрой (менее 2 месяцев) или чрезмерно продолжительной (более года). Так, в работе [11] использован ко-полимер молочной и гликолевой кислот, который в процессе синтеза имеет жидкую фазу, оптимальную для включения в состав нуклеиновых кислот, а также не оказывает токсического действия на клетки, что обеспечивает эффективность его использования как средства доставки биологически активных компонентов. Однако скорость биорезорбции материала довольно высокая - не более 2 мес, а химические вещества, входящие в его состав, не являются структурными компонентами межклеточного матрикса, что в целом ограничивает «самостоятельную» эффективность материала в оптимизации репаративной регенерации тканей.
В ходе проведенных исследований нами были выбраны наиболее эффективные материалы носителя, которые, помимо функции средства доставки, обладают еще и собственной, хоть и умеренной, активностью в обеспечении репаративной регенерации тканей: носители, содержащие коллаген, гидроксиапатит, кальцийфосфат или другие компоненты внеклеточного матрикса.
Таким образом, вопреки сформировавшемуся тренду разработок многокомпонентных сложных биокомпозитов мы разработали варианты трехкомпонентных генно-клеточных изделий, которые оказались высокоэффективными для обеспечения репаративной регенерации тканей.
Создание и применение генно-клеточного материала согласно нашему изобретению позволяет добиться введения максимального количества нуклеиновых кислот и необходимых для оптимального восстановления тканей и органов клеточных элементов в целевую область, достичь синергичного действия активных компонентов, пролонгированного эффекта и избежать недостатков аналогов.
Способ повышает эффективность восстановления тканей и органов за счет:
- оптимальной доставки нуклеиновых кислот, защищенных от повреждающих факторов реципиентного ложа, в организм реципиента, а также пролонгированного высвобождения их из структуры носителя, то есть пролонгирования целевого эффекта;
- введения в организм реципиента необходимой популяции клеток, обеспечивающих гистотипическое восстановление целостности тканей и органов;
- синергичного действия нуклеиновых кислот и клеток, входящих в состав единого биокомпозита медицинского назначения.
В одном аспекте изобретение относится к биокомпозиту для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, состоящему из носителя, содержащего коллаген, и/или гидроксиапатит, и/или кальцийфосфат, и/или продукты внеклеточного матрикса, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию.
Нуклеиновые кислоты выбирают из группы: ДНК, кодирующие гены, ДНК, некодирующие гены, ДНК, содержащиеся в векторных молекулах (таких, как плазмиды, вирусы, эписомы, транспозоны), свободные линейные ДНК, одноцепочечные РНК, двуцепочечные РНК, РНК, содержащие модифицированные рибонуклеотиды, РНК, имеющие 5'-кэп или нет, РНК, содержащие 3'-поли А или нет, микроРНК или siPHK. Нуклеиновые кислоты могут быть включены в состав композита в нескольких возможных вариантах в зависимости от того, с каким компонентом носителя они непосредственно связаны. Средство для восстановления тканей и органов содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или различные их сочетания, при этом нуклеиновая кислота может кодировать по меньшей мере один ген. Возможно использование поликассетных генетических конструкций.
Выбор целевого гена или нескольких целевых генов, заключенных в один тип нуклеиновых кислот, либо выбор сразу нескольких типов нуклеиновых кислот, содержащих разные целевые гены, для создания композита определяется тем, за счет каких механизмов планируется реализовать восстановление тканей и органов, и связан с биологическим действием конкретного фактора, кодируемого целевыми генами нуклеиновых кислот. В частности, для восстановления тканей и органов за счет индукции ангиогенеза целесообразно использовать нуклеиновые кислоты, содержащие гены, кодирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) или фактор стромальных клеток-1 (SDF-1).
Носитель может быть твердым органической или неорганической природы, выбранным из группы: металлический, коллагеновый, хитозановый, кальцийфосфатный, гидроксиапатитовый, биокерамический, биостеклянный, алюминатный материал, очищенные белки, продукты внеклеточного матрикса или их комбинации.
Носитель может быть жидким, а именно 0,9% раствор NaCL, растворы декстранов, солевые растворы (Рингера, Хенкса), растворы органических кислот - компонентов аморфоного вещества межклеточного матрикса (гиалуроновая, хондроитинсерная кислоты и др.).
Носитель может быть в форме геля (коллагеновый, альгинатный, желатиновый и др.), золя, мази, крема или их комбинации.
Носитель может представлять собой комплексный материал, содержащий твердые, жидкие, гелевые, мазевые и кремовые материалы в различных комбинациях.
Носитель может быть наноструктурированным материалом.
Выбор клеточной популяции определяется гистогенетической природой ткани, на восстановление целостности которой направлен получаемый композит. Для создания композита целесообразно использовать именно те виды клеток, которые либо способны к дифференцировке по направлению в клетки поврежденных тканей, либо уже являются дифференцированными клетками, соответствующими клеткам поврежденных тканей, а также клетки, которые могут “обеспечить процессы гистотипической репаративной регенерации”. К таковым относятся практически любые клетки, способные продуцировать необходимые факторы роста или каким-либо иным опосредованным путем оптимизировать ход репаративного процесса, например путем стимуляции, обеспечения ангиогенеза.
Биокомпозит может содержать аутогенные и/или аллгогенные клетки. Клетки могут являться производными одной или разных цитогенетических линий.
Биокомпозит может содержать стволовые, малодифференцированные прогениторные или дифференцированные клетки или смесь клеток разной степени дифференцировки.
Биокомпозит может содержать клетки, полученные непосредственно от млекопитающего, т.е. клетки, которые использовали сразу же после получения - без лабораторных технологий клеточного процессинга (культивирования, иммунофенотипирования, индукции дифференцировки). Также биокомпозит может содержать клетки, которые предварительно подвергали лабораторным технологиям клеточного процессинга (культивированию, иммунофенотипированию, индукции дифференцировки или трансфекции генетическими конструкциями).
Изобретение также относится к способам получения биокомпозита. Возможны следующие варианты его осуществления:
1. Совмещение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с носителем и последующее добавление клеток, обеспечивающих гистотипическую репаративную регенерацию, к полученному комплексу носитель с, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислотой.
2. Совмещение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с носителем и добавление предварительно трансфецированных по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой клеток, обеспечивающих гистотипическую репаративную регенерацию, к полученному комплексу носитель с, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислотой.
3. Совмещение по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты с носителем, при этом нуклеиновую кислоту предварительно объединяют с клетками, обеспечивающими гистотипическую репаративную регенерацию, а после этого трансфецированные клетки добавляют к носителю.
4. Совмещение сначала клеток с носителем, после чего - добавление нуклеиновых кислот.
5. Способ, в котором для создания изделия сначала совмещают одну клеточную популяцию с носителем, в то же время другую клеточную популяцию трансфецируют генетическими конструкциями, а уже после этого трансфецированные клетки и изделие, состоящее из клеток и носителя, объединяют в композит.
Взаимодействие нуклеиновых кислот и носителя может состоять в обратимом взаимодействии генетических конструкций с компонентами носителя в виде слабых (временных) химических связей с компонентами носителя, в виде импрегнации в структуру носителя (например, жидкого, мазевидного или гелевого носителя) или в виде нанесения на поверхность твердого носителя с помощью различных клеящих субстанций. В связи с обратимостью взаимодействия нуклеиновых кислот и носителя после контакта (взаимодействия) композита с биологическими жидкостями (в частности, после введения в организм реципиента) генетические конструкции последовательно высвобождаются под действием факторов реципиентного ложа, а также при биорезорбции носителя (если носитель состоит из биорезорбируемых материалов).
Компонентами носителя, способными образовывать химические связи с нуклеиновыми кислотами, могут служить гидроксиапатит, флуороапатит [12], карбонилимидазол [13], полиакриламид [14], полимеры метакриловой кислоты [15] и др. Носитель защищает действующее вещество - компартментализированную нуклеиновую кислоту - от повреждающих факторов тканей реципиентного ложа и позволяет пролонгировать эффект за счет временной химической связи с генетическими конструкциями. Прочность химической связи нуклеиновых кислот с носителем может быть различной в зависимости от материала носителя и вида нуклеиновых кислот: варьируется в интервале от полного отсутствия таковой до практически необратимой связи.
Взаимодействие нуклеиновых кислот и клеток, входящих в состав композита, состоит в трансфекции клеток генетическими конструкциями. Введение нуклеиновых кислот внутрь клеток может выполняться как in vitro до совмещения с носителем, так и реализовываться уже в объеме носителя, когда сначала совмещают нуклеиновые кислоты с носителем, а уже после этого привносят клетки.
Количество нуклеиновых кислот для создания композита определяется емкостью носителя, то есть максимальным количеством нуклеиновых кислот, которые могут быть размещены на его поверхности или в его объеме, а также количеством нуклеиновых кислот, которым может быть трансфецирована популяция клеток, подлежащих совмещению с носителем для создания композита. Таким образом, количество зависит от конкретной ситуации и может быть легко подобрано специалистом.
Клетки, входящие в состав композита, адгезированы к поверхности твердого носителя за счет реализации разнообразных механизмов клеточно-матриксного и клеточно-клеточного взаимодействия или локализованы в объеме жидкого, гелевого или мазеподобного носителя. Количество клеток, необходимое для создания композита, с одной стороны, определяется площадью поверхности (для твердых) или объемом (для жидких и гелеобразных) носителя, а с другой, минимально необходимой концентрацией для обеспечения репаративной регенерации поврежденных тканей, и также эффективное количество может быть определено специалистом исходя из конкретных условий.
Синергичное действие нуклеиновых кислот и клеток может быть различным в зависимости от технологии их объединения с носителем в единое медицинское изделие, от вида генетических конструкции и типов клеток. Синергичное действие реализуется на двух этапах: при создании изделия и непосредственно после его трансплантации в организм реципиента. На этапе создания изделия синергичность заключается в возможности трансфекции клеток нуклеиновыми кислотами (всеми при трансфекции in vitro или частью при трансфекции в объеме носителя), что позволяет, с одной стороны, повысить количество вводимых нуклеиновых кислот, а с другой, оптимизировать свойства клеточной популяции, индуцировав экспрессию целевых генов, содержащихся во введенных нуклеиновых кислотах. Наиболее эффективными технологиями реализации этого аспекта синергичного действия являются трансфекция клеток in vitro (совмещение клеток и нуклеиновых кислот) и объединение с носителем уже трансфицированных клеток, совмещение клеток с комплексом «носитель-нуклеиновые кислоты», трансфекция клеток in vitro и последующее объединение с комплексом «носитель - нуклеиновые кислоты». Наименее эффективным вариантом является совмещение клеток с носителем с последующим добавлением нуклеиновых кислот, так как технология внесения нуклеиновых кислот включает использование реагентов и физических факторов (высушивание), повреждающих клетки. После введения в организм реципиента генетические конструкции транспортируются клетками реципиентного ложа и клетками трансплантированного изделия, экспрессируются, а продукт экспрессии индуцирует и поддерживает морфофункциональную активность в том числе и введенных в состав изделия клеток.
В другом аспекте изобретение относится к способам применения биокомпозита. Биокомпозит может быть использован для эффективной доставки нуклеиновых кислот млекопитающему.
Также биокомпозит может быть применен в способе обеспечения гистотипического заживления повреждения у млекопитающего.
Способы введения бокомпозита могут быть различными и зависят от его формы и характера повреждений тканей и органов. Так, например, возможно введение непосредственно в область поврежденных тканей при выполнении хирургической операции или манипуляции. Допустимо инъекционное введение композита (носитель которого жидкость или гель) в организм реципиента - внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное, подкожное, внутрикостные, эндолюмбальное, субдуральное, внутрисуставное, эндобульбарное, а также аппликационное применение композита при условиях жидкой, гелевой, кремовой, мазевой формы носителя.
В соответствии с этапностью создания композита возникает необходимость использования двух наборов: первый для содержания в подходящей емкости комплекса «носитель-нуклеиновые кислоты», второй - для совмещения комплекса «носитель-нуклеиновые кислоты» с клетками, его размещения и транспортировки. Первый набор представляет собой изделие из двух оболочек: внутренняя - стерильная и внутри и снаружи (предназначена для размещения комплекса «носитель-нуклеиновые кислоты» и сохранения его стерильности); внешняя - стерильная только изнутри, снаружи нестерильная, плотно фиксирующая внутреннюю, но при этом легко раскрываемая руками без касания внутренней стерильной части и обеспечивающая стерильность внутренней части, защиту от механических повреждений.
Второй набор, предназначенный для совмещения комплекса «носитель-нуклеиновые кислоты», представляет собой стерильную емкость из стекла или полимерных материалов различного объема, необходимого для размещения носителя с нуклеиновыми кислотами, культуральной среды или биологической жидкости (например, кровь) с клетками. Стерильная емкость помещена также в упаковку из двух оболочек - внутренней стерильной с двух сторон и внешней - стерильной изнутри, но нестерильной снаружи.
Таким образом, набор для приготовления биокомпозита содержит в отдельной емкости комплекс носитель с, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислотой и емкость для совмещения указанного комплекса с биологической жидкостью или культуральной средой с клетками, обеспечивающими гистотипическую репаративную регенерацию.
Возможность осуществления изобретений целесообразно проиллюстрировать в примерах: создание композита за счет объединения носителя, содержащего гидроксиапатит и костный коллаген, с популяцией аутогенных мононуклеарных клеток крови и генетической конструкцией, содержащей нуклеотидную последовательность с геном VEGF (см. патент RU 2297848), и его применение для обеспечения репаративной регенерации костной ткани - восполнения костного дефекта протяженностью 2 см болышеберцовой кости кролика.
Пример 1. Химическое связывание нуклеиновой кислоты и носителя
1. Подготовка носителя (в данном примере его объем 1 см3):
а) отмывка (инкубирование в 0,5 М фосфата в объеме 1 мл при температуре 37°C при постоянном встряхивании в течение 12 часов);
б) уравновешивание (обработка 10 мМ фосфата в объеме 1 мл при температуре 37°C при постоянном встряхивании, 3 раза по 10 мин);
в) высушивание (инкубирование при температуре 37°C до полного высыхания - 3 часа).
2. Нанесение нуклеиновой кислоты (инкубирование с раствором, содержащим плазмиды ДНК, в объеме 100 мкл в 10мМ фосфата в концентрации 1 мкг/мкл при температуре 37°C и постоянном встряхивании в течение 12 часов) с учетом расчетной емкости носителя для нуклеиновых кислот, которая в данном примере составляет 202,765 нг нуклеиновых кислот на 1 мг носителя.
3. Обработка полученного комплекса «носитель-генетическая конструкция»:
а) промывка (обработка 5 мМ раствором фосфата в объеме 1 мл 3 раза);
б) высушивание (инкубирование при температуре 37°C до полного высыхания - 3 часа).
4. Совмещение комплекса «носитель-нуклеиновые кислоты» с популяцией аутогенных мононуклеарных клеток крови, полученной непосредственно перед операцией - при выполнении операционного доступа. Комплекс «носитель-нуклеиновые кислоты» объемом 1 см3 помещали в стерильную емкость с 5 мл крови пациента, забранной шприцем из области поврежденных тканей при реализации операционного доступа. Время экспозиции составляло несколько минут - время, достаточное для заполнения всех пор носителя с нуклеиновыми кислотами кровью, содержащей аутогенные мононуклеарные клетки, обеспечивающие гистотипическую репаративную регенерацию костной ткани.
Пример 2. Трансплантация полученного в примере 1 комплекса. Этап трансплантации изделия медицинского назначения в эксперименте. Модель: костный дефект протяженностью 2 см большеберцовой кости кролика. Сначала вводят спицы Киршнера для фиксации диастаза и оси конечности, после чего помещают в костный дефект биокомпозит.
На Рисунках приведены данные, подтверждающие эффективность введения химически компартментализованного генетического материала и клеток для обеспечения репаративного остеогенеза.
Рис.1. Композит, состоящий из клеток и нуклеиновых кислот, совмещенных с носителем из остеопластического материала: А - световая микроскопия, Б - сканирующая электронная микроскопия.
Рис.2. Этап трансплантации изделия медицинского назначения в эксперименте. А - дефект до введения биокомпозита, введены спицы Киршнера для фиксации диастаза и оси конечности; Б - биокомпозит, введенный в костный дефект.
Рис.3. Большеберцовая кость кролика. В центральной части определяется костный регенерат (обозначен белой стрелкой), образованный с помощью композита.
Рис.4. Костный регенерат, образованный с помощью введенного химически компартментализованного генетического материала и клеток. Гистологическая картина. Окраска: гематоксилин, эозин. Световая микроскопия. Ув. ×100.
Для подтверждения химического связывания нуклеиновой кислоты и носителя из остеопластического материала после промывки и высушивания полученного изделия выполняли диссоциацию - разрушение связи и высвобождение нуклеиновой кислоты в раствор. Для этого изделие обрабатывали 0,5 М фосфата в объеме 50 мкл при 37°C при постоянном встряхивании в течение 10 мин, а раствор с элюированной нуклеиновой кислотой подвергали спектрофотометрии (спектрофотометр Nanodrop-1000). В результате было установлено содержание нуклеиновых кислот в растворе в количестве 202,765 нг на каждый мг носителя (разные носители обладают разной емкостью).
Для подтверждения возможности совмещения популяции аутогенных мононуклеарных клеток крови с изделием выполняли световую микроскопию, идентифицируя клетки, адгезированные к поверхности носителя. Методами световой, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии было установлено, что клетки адгезированы к поверхности матрикса, распластаны, занимают практически всю свободную поверхность носителя (Рис.1.).
Приведенный пример демонстрирует выполнимость объединения нуклеиновых кислот, клеток и носителя, возможность введения полученного изделия медицинского назначения в организм реципиента, а также демонстрирует более быстрое и эффективное восстановление целостности кости голени кролика.
Пример 3. Получение различных вариантов биокомпозита
Были изготовлены комплексы из различных материалов носителей и нуклеиновых кислот в концентрациях, указанных ниже:
- комплекс из кальция фосфата и нуклеиновых кислот, добавленных в концентрации 72,5 нг на 1 мг носителя;
- комплекс из гидроксиапатита и нуклеиновых кислот, добавленных в концентрации 347,8 нг на 1 мг носителя;
- комплекс из аллогенного деминерализованного костного матрикса и нуклеиновых кислот, добавленных в концентрации 108,4 нг на 1 мг носителя;
- комплекс из ксеногенного депротеинизированного костного матрикса и нуклеиновых кислот, добавленных в концентрации 285,7 нг на 1 мг носителя;
- комплекс из кальция фосфата с гидроксиапатитом и нуклеиновых кислот, добавленных в концентрации 520,1 нг на 1 мг носителя.
Каждый из указанных комплексов был получен с помощью технологии (протокола), указанной в примере 1. Клетки были добавлены к комплексам из носителей и нуклеиновых кислот на втором этапе получения биокомпозита. При этом в каждом случае были использованы различные клеточные типы (выделенные по различным технологиям): культура мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, культура фибробластов, культура остеогенных клеток надкостницы, свежая кровь с клетками, стромально-васкулярная фракция клеток жировой ткани, полученная с помощью специального аппарата (Cytori).
Пример 4. Трансплантация полученных в примере 3 комплексов
Полученные биокомпозиты были исследованы в эксперименте на кроликах с краниальными дефектами. Краниальные дефекты диаметром 10 мм были выбраны в качестве модели дефекта критических размеров, так как кости крыши черепа кроликов в этом случае не восстанавливаются самопроизвольно - без дополнительных оптимизирующих влияний. Каждому животному были сформированы билатеральные идентичные дефекты теменных костей. Биокомпозиты трансплантировались в дефекты правых теменных костей (экспериментальная группа), в дефекты левых - носитель без клеток и нуклеиновых кислот (контроль 1) или комплекс из носителя с нуклеиновыми кислотами без клеток (контроль 2). Результаты оценивались через 15, 30, 45, 60 суток.
Было показано, что только в случае трансплантации биокомпозитов (экспериментальные группы) уровень трансфекции клеток реципиентного ложа ДНК-плазмидами (с геном VEGF} был наиболее высок, что привело к статистически значимо более выраженному ангиогенезу и репаративному остеогенезу на всех временных точках по сравнению с контрольными группами.
Таким образом, в наших исследованиях высокая эффективность в активизации репаративной регенерации происходит за счет взаимного действия оптимально подобранных компонентов биокомпозита, их синергичного эффекта.
Носитель обеспечивает доставку клеток и генных конструкций в область повреждения, их защиту и пролонгированность высвобождения генных конструкций в ходе биодеградации носителя. При этом нами было установлено, что наиболее эффективные результаты могут быть достигнуты только за счет использования в качестве носителей материалов, содержащих коллаген, гидроксиапатит, кальцийфосфат или другие компоненты внеклеточного матрикса, обеспечивающие как оптимальную адгезию клеток и фиксацию генетических конструкций (плазмидных ДНК), так и обладающие оптимальной биосовместимостью и положительным влиянием на репаративный процесс. В свою очередь клетки наряду с непосредственным участием в репаративном процессе служат мишенями для генных конструкций и при успешной трансфекции, реализация которой была подтверждена нами в ходе проведенных исследовний, становятся своего рода «биореакторами» терапевтического белка, кодируемого генными конструкциями биокомпозита - в течение определенного времени продуцируют данный белок (VEGF и (или) SDF-1). При этом экспрессия генных конструкций биокомпозита, содержащих гены, кодирующие VEGF и (или) SDF-1, обеспечивает активизацию ангиогенных процессов, а также повышает устойчивость клеток к гипоксии, что в совокупности способствует повышению выживаемости клеток биокомпозита. Другими словами, новизна подхода состоит в том, что компоненты, включенные в состав биокомпозита, нацелены не только на непосредственное обеспечение репаративного процесса за счет прямого влияния на клетки реципиентного ложа, но и характеризуются опосредованным действием на репаративную регенерацию посредством взаимного потенцирования: плазмидные ДНК обеспечивают выживаемость клеток биокомпозита, а клетки - доставку плазмидных ДНК в целевую область и их экспрессию.
Способ применим в медицинской практике, особенно для стимуляции репаративных процессов в тканях, а также в ветеринарии для лечения млекопитающих.
Источники информации
1. Greenleaf W.J., Bolander M.E., Sarkar G. et al. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine and Biology 1998; 24(4): 587-595.
2. Schratzberger P., Krainin J.G., Schratzberger G. et al. Transcutaneous ultrasound augments naked DNA transfection of skeletalmuscle. Molecular Therapy 2002, 6(5): 576-583.
3. Duvshani-Eshet M., Machluf M. Therapeutic ultrasound optimization for gene delivery: a key factor achieving nuclear DNA localization. Journal of Controlled Release 2005; 108(2-3): 513-528.
4. Kim H.J., Greenleaf J.F., Kinnick R.R. Ultrasound-mediated transfection of mammalian cells. Human Gene Therapy 1996; 7(11): 1339-1346,.
5. Fraley R., Subramani S., Berg P. et al. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 1980; 255(21): 10431-5.
6. Roos A.K., Eriksson F., Timmons J.A.. Skin electroporation: effects on transgene expression, DNA persistence and local tissue environment. PLoS One. 2009; 4(9): е7226.
7. Schertzer J.D., Lynch G.S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods Mol Biol. 2008; 433: 115-25.
8. Деев Р.В., Цупкипа Н.В., Бозо И.Я., Пинаев Г.П., Тихилов Р.М. Способ совмещения культивированных остеогенных клеток и трехмерного материала-носителя. Патент №2008150694 от 22.12.2008.
9. Polykandriotis E., Arkudas A., Horch R. et al. Autonomously vascularized cellular constructs in tissue engineering: opening a new perspective for biomedical science. J. Cell Mol. Med. 2007; 11(1): 6-20.
10. Гоулдстейн С.А. Способы переноса генов in vivo для заживления ран. Патент №2170104 от 10.07.2001.
11. Y. Huang, D, Kaigler, K.G. Rice. Combined angiogenic and osteogenic factor delivery enhances bone marrow stromal cell-driven bone regeneration. J. Bone Miner. Res. 2005; 20(5): 848-57
12. Giovannini R., Freitag R. Comparison of different types of ceramic hydroxyapatite for the chromatographic separation of plasmid DNA and a recombinant anti-Rhesus D antibody. Bioseparation 2001; 9: 359-368.
13. Sousa A., Tomaz C.T., Sousa F. et al. Successful application of monolithic innovative technology using a carbonyldiimidazole disk to purify supercoiled plasmid DNA suitable for pharmaceutical applications. J Chromatogr A. 2011; 1218(46): 8333-43.
14. Zhang Y.S., Bai X.F. A simple, rapid and high-resolution banding method in polyacrylamide gels. Yi Chuan. 2008; 30(2): 251-4.
15. Smrekar F., Podgornik A., Ciringer M. et al. Preparation of pharmaceutical-grade plasmid DNA using methacrylate monolithic columns. Vaccine 2010; 28(8): 2039-45.

Claims (16)

1. Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию.
2. Биокомпозит по п.1, отличающийся тем, что носитель содержит коллаген и/или гидроксиапатит и/или кальцийфосфат и/или продукты внеклеточного матрикса.
3. Биокомпозит по п.1, отличающийся тем, что носитель может быть в виде геля, золя, мази, крема или их комбинации.
4. Биокомпозит по п.1, отличающийся тем, что содержит аутогенные и/или аллогенные клетки.
5. Биокомпозит по п.1, отличающийся тем, что содержит клетки - производные одной или разных цитогенетических линий.
6. Биокомпозит по п.1, отличающийся тем, что содержит стволовые клетки, малодифференцированные прогениторные или дифференцированные клетки или смесь клеток разной степени дифференцировки.
7. Биокомпозит по п.1, отличающийся тем, что содержит клетки, полученные от млекопитающего непосредственно перед применением биокомпозита, или клетки, которые предварительно подвергали лабораторным технологиям клеточного процессинга.
8. Способ получения биокомпозита, предусматривающий совмещение по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, с носителем, и последующее добавление клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию, к полученному комплексу носитель с нуклеиновой кислотой.
9. Способ получения биокомпозита, предусматривающий совмещение по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, с носителем и добавление предварительно трансфецированных нуклеиновой кислотой клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию, к полученному комплексу носитель с нуклеиновой кислотой.
10. Способ получения биокомпозита, предусматривающий совмещение по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, с носителем, при этом нуклеиновую кислоту предварительно объединяют с клетками, обеспечивающими репаративную регенерацию, после чего трансфецированные клетки добавляют к носителю.
11. Способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего, предусматривающий введение ему биокомпозита по любому из пп.1-7.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что введение биокомпозита осуществляют непосредственно в область поврежденных тканей при выполнении хирургической операции или манипуляции.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что введение биокомпозита осуществляют инъекционным способом: внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, внутрикостно, эндолюмбально, субдурально, внутрисуставно, эндобульбарно.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что введение биокомпозита осуществляют с помощью аппликации.
15. Способ доставки нуклеиновой кислоты, предусматривающий введение реципиенту биокомпозита по любому из пп.1-7.
16. Набор для приготовления биокомпозита по любому из пп.1-7, содержащий в отдельной емкости комплекс носитель с по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, содержащей гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1 и емкость для совмещения комплекса с биологической жидкостью или культуральной средой с клетками, обеспечивающими репаративную регенерацию.
RU2011153873/15A 2011-12-29 2011-12-29 Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения RU2519326C2 (ru)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011153873/15A RU2519326C2 (ru) 2011-12-29 2011-12-29 Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения
UAA201405515A UA112450C2 (uk) 2011-12-29 2012-12-24 Біокомпозит для регенерації пошкоджених тканин та органів, набір для виготовлення біокомпозита і спосіб лікування
CN201280064772.0A CN104203285A (zh) 2011-12-29 2012-12-24 用于使损伤的组织和器官再生的生物复合材料、用于制造所述生物复合材料的试剂盒、制造所述生物复合材料的方法和治疗损伤的方法
EA201400401A EA031108B1 (ru) 2011-12-29 2012-12-24 Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов костных тканей у млекопитающего, способы получения и применения биокомпозита
EP12861904.6A EP2797633B1 (en) 2011-12-29 2012-12-24 A biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite
PCT/RU2012/001103 WO2013100818A2 (en) 2011-12-29 2012-12-24 A biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite and a method of treating inquiries.
US14/369,008 US9730959B2 (en) 2011-12-29 2012-12-24 Biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite and a method of treating injuries
CA2866483A CA2866483C (en) 2011-12-29 2012-12-24 A biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite and a method of treating inquiries
ES12861904.6T ES2617338T3 (es) 2011-12-29 2012-12-24 Biocomposite para la regeneración de tejidos y órganos lesionados, un kit para fabricar el biocomposite, un procedimiento de fabricación del biocomposite

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011153873/15A RU2519326C2 (ru) 2011-12-29 2011-12-29 Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011153873A RU2011153873A (ru) 2013-07-10
RU2519326C2 true RU2519326C2 (ru) 2014-06-10

Family

ID=48698765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011153873/15A RU2519326C2 (ru) 2011-12-29 2011-12-29 Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9730959B2 (ru)
EP (1) EP2797633B1 (ru)
CN (1) CN104203285A (ru)
CA (1) CA2866483C (ru)
EA (1) EA031108B1 (ru)
ES (1) ES2617338T3 (ru)
RU (1) RU2519326C2 (ru)
UA (1) UA112450C2 (ru)
WO (1) WO2013100818A2 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623171C1 (ru) * 2016-10-07 2017-06-22 Общество с ограниченной ответственностью "ГИСТОГРАФТ" Способ получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, способ получения твердого матрикса носителя, оптимизированный твердый ген-активированный материал для регенерации тканей
RU2634576C1 (ru) * 2016-10-24 2017-10-31 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) Способ стимуляции регенерации тканей
RU2808883C1 (ru) * 2023-04-21 2023-12-05 Пётр Владимирович Озеров Способ получения био композита ex tempore и способ био синус лифтинга с использованием полученного био композита

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
RU2597786C2 (ru) * 2015-02-10 2016-09-20 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани
ES2584107B2 (es) * 2016-05-02 2017-04-06 Universidade De Santiago De Compostela Andamio biodegradable que comprende ARN mensajero
KR101710615B1 (ko) 2016-09-07 2017-02-27 주식회사 파마리서치프로덕트 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법
CN106943624B (zh) * 2017-05-08 2019-12-10 佛山今兰生物科技有限公司 一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法
CN109663149A (zh) * 2017-10-17 2019-04-23 天津大学 非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法
CN110393822A (zh) * 2018-04-23 2019-11-01 香港賽寧生物工程技術有限公司 胶原蛋白-羟基磷灰石复合小分子骨材料的制备方法
CN112386744B (zh) * 2020-10-14 2022-04-26 中山大学附属第六医院 一种药物缓释水凝胶半嵌入式复合支架及其制备方法
CN113351165B (zh) * 2021-04-29 2023-04-14 中石化石油工程技术服务有限公司 矿区饮用水除氟工艺

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2170104C2 (ru) * 1996-04-12 2001-07-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган Способы переноса генов in vivo для заживления ран

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040266715A1 (en) 1999-03-31 2004-12-30 Wong Liang Fong Neurite regeneration
US7022522B2 (en) * 1998-11-13 2006-04-04 Limin Guan Macroporous polymer scaffold containing calcium phosphate particles
US6479064B1 (en) 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
EP1409647A4 (en) 2001-04-30 2009-09-09 Yissum Res Dev Co COMPOSITE SKELETONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR GENERATING COMPLEX TISSUE GRAFT
WO2003092468A2 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Gel-Del Technologies, Inc. Biomatrix structural containment and fixation systems and methods of use thereof
WO2005072125A2 (en) * 2004-01-16 2005-08-11 Massachusetts Institute Of Technology Composite materials for controlled release of water soluble products
US20050272153A1 (en) 2004-01-27 2005-12-08 Zou Xuenong Bone tissue engineering by ex vivo stem cells ongrowth into three-dimensional trabecular metal
RU2297848C2 (ru) 2005-05-11 2007-04-27 Александр Веньяминович Иткес Генно-инженерная конструкция vegf-ибмед (vegf-ibmed)
US20070212332A1 (en) 2005-08-11 2007-09-13 Department Of Veterans Affairs Methods for accelerating bone repair
EP2796544B1 (en) * 2005-09-09 2019-04-03 Duke University Tissue engineering methods and compositions
RU2343928C1 (ru) 2007-04-03 2009-01-20 Открытое акционерное общество "Институт стволовых клеток человека" Способ получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови
JP5795166B2 (ja) 2007-11-28 2015-10-14 オルガノジェネシス インク． 生命工学による組織コンストラクト並びに生産及び使用のための方法
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
RU2384618C2 (ru) 2008-03-27 2010-03-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного
RU2414916C2 (ru) 2008-12-22 2011-03-27 Российская академия наук. Учреждение Российской академии наук институт цитологии РАН (ИНЦ РАН) Способ совмещения культивированных остеогенных клеток и трехмерного материала-носителя
RU2407063C2 (ru) 2009-03-02 2010-12-20 Федеральное государственное учреждение "Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р.Р.Вредена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (ФГУ "РНИИТО им. Р.Р.Вредена Росмедтехнологий") Способ моделирования злокачественных соединительнотканных опухолей (сарком)
RU2399667C1 (ru) 2009-04-10 2010-09-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения плюрипотентных клеток
US20110229970A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-22 Florida State University Research Foundation Dual-chamber perfusion bioreactor for orthopedic tissue interfaces and methods of use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2170104C2 (ru) * 1996-04-12 2001-07-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган Способы переноса генов in vivo для заживления ран

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG Y.-C. et al. Combined Angiogenic and Osteogenic Factor Delivery Enhances Bone Marrow Stromal Cell-Driven Bone Regeneration. J Bone Miner Res. 2005 May; 20(5):848-857. Epub 2004 Dec 20 [Найдено 26.03.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1359/JBMR.041226/pdf. KANCZLER J.M., OREFFO R.O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 2008 May 2;15:100-114 [Найдено 26.03.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.ecmjournal.org/journal/papers/vol015/pdf/v015a08.pdf. JI W. et al. Bioactive Electrospun Scaffolds Delivering Growth Factors and Genes for Tissue Engineering Applications. Pharm Res. 2011; 28:1259-1272. Published online: 19 November 2010 [Найдено 26.03.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3098998/pdf/11095_2010_Article_320.pdf. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623171C1 (ru) * 2016-10-07 2017-06-22 Общество с ограниченной ответственностью "ГИСТОГРАФТ" Способ получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, способ получения твердого матрикса носителя, оптимизированный твердый ген-активированный материал для регенерации тканей
RU2634576C1 (ru) * 2016-10-24 2017-10-31 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) Способ стимуляции регенерации тканей
RU2808883C1 (ru) * 2023-04-21 2023-12-05 Пётр Владимирович Озеров Способ получения био композита ex tempore и способ био синус лифтинга с использованием полученного био композита

Also Published As

Publication number Publication date
US20140341870A1 (en) 2014-11-20
CA2866483A1 (en) 2013-07-04
WO2013100818A3 (en) 2013-09-06
RU2011153873A (ru) 2013-07-10
US9730959B2 (en) 2017-08-15
CA2866483C (en) 2019-01-29
EP2797633A4 (en) 2015-01-14
EA201400401A1 (ru) 2014-07-30
EP2797633A2 (en) 2014-11-05
WO2013100818A2 (en) 2013-07-04
UA112450C2 (uk) 2016-09-12
ES2617338T3 (es) 2017-06-16
CN104203285A (zh) 2014-12-10
EA031108B1 (ru) 2018-11-30
EP2797633B1 (en) 2016-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2519326C2 (ru) Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения
Li et al. Tailoring materials for modulation of macrophage fate
Ashammakhi et al. Regenerative therapies for spinal cord injury
Fu et al. Trophic effects of mesenchymal stem cells in tissue regeneration
Smith et al. Harnessing macrophage plasticity for tissue regeneration
Chen et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies
Farokhi et al. Importance of dual delivery systems for bone tissue engineering
El-Fiqi et al. Osteoinductive fibrous scaffolds of biopolymer/mesoporous bioactive glass nanocarriers with excellent bioactivity and long-term delivery of osteogenic drug
Waters et al. Stem cell secretome-rich nanoclay hydrogel: a dual action therapy for cardiovascular regeneration
Ye et al. Promoting musculoskeletal system soft tissue regeneration by biomaterial-mediated modulation of macrophage polarization
Wu et al. Biomaterials for endogenous regenerative medicine: coaxing stem cell homing and beyond
Zhang et al. Bioinspired mild photothermal effect-reinforced multifunctional fiber scaffolds promote bone regeneration
Hammond Building biomedical materials layer-by-layer
US10449257B2 (en) Self-assembled composite ultrasmall peptide-polymer hydrogels
Cooke et al. Design of biomaterials to enhance stem cell survival when transplanted into the damaged central nervous system
Szwed-Georgiou et al. Bioactive materials for bone regeneration: biomolecules and delivery systems
Wang et al. Delivery of salvianolic acid B for efficient osteogenesis and angiogenesis from silk fibroin combined with graphene oxide
Hu et al. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair
Wegman et al. Non-viral gene therapy for bone tissue engineering
Hosseinkhani et al. Gene therapy for regenerative medicine
Liu et al. Preparation of Icariin and Deferoxamine functionalized poly (l-lactide)/chitosan micro/Nanofibrous membranes with synergistic enhanced Osteogenesis and angiogenesis
Chen et al. Nanocomposite hydrogels in regenerative medicine: applications and challenges
Esmaeili et al. Exploring the evolution of tissue engineering strategies over the past decade: From cell-based strategies to gene-activated matrix
Miszuk et al. Biomimetic nanofibrous 3D materials for craniofacial bone tissue engineering
Qin et al. Prospects and challenges for the application of tissue engineering technologies in the treatment of bone infections

Legal Events

Date Code Title Description
HE9A Changing address for correspondence with an applicant
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20171116

QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181008

Effective date: 20181008