CN103999849B - 一种哺乳动物睾丸组织冷冻保存的抗冻剂及冷冻-解冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种哺乳动物睾丸组织冷冻保存的抗冻剂，该抗冻剂是BSA冷冻保护剂或者是海藻糖冷冻保护剂，BSA冷冻保护剂的配方为：BSA：15mg/mL，DMEM-F12：0.65mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL；海藻糖冷冻保护剂的配方为：海藻糖：40mg/mL，DMEM-F12：0.6mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL。采用该抗冻剂能够在冷冻-解冻过程中很好地保护哺乳动物睾丸组织的生理活性。

Description

一种哺乳动物睾丸组织冷冻保存的抗冻剂及冷冻-解冻方法

技术领域

本发明涉及用于哺乳动物睾丸组织冷冻保存的抗冻剂及其冷冻-解冻的技术体系，可使哺乳动物睾丸组织冷冻-解冻后保持良好的生理活性。

背景技术

哺乳动物睾丸组织低损伤冷冻保存技术为优良家畜品种生殖细胞保存、珍稀濒危物种的保护等提供了新的途径，为未成年男性生育能力的恢复、组织器官的冷冻保存等提供了理论和技术基础，有利于体外获得精子细胞并促进人工授精技术的发展，为以睾丸组织为实验材料的相关研究提供样本保存方案。由于睾丸组织结构复杂且包含不同类型的细胞，而不同细胞的冷冻耐受性差异较大，因而睾丸组织的冷冻保存要求更完善的冷冻-解冻技术体系；冷冻保护剂正是在整个睾丸组织冷冻保存过程中影响其效果的关键因素，其成份配伍直接且明显地影响冻后睾丸组织的生理活性。

酶是生物体内新陈代谢的催化剂，是生物体实现自我更新、组织细胞发挥其生理机能的关键因素，因而组织中酶的活性可以作为判定组织生理活性的依据。碱性磷酸酶(AKP)是一种含锌的胞浆结合酶，AKP的活性在精原细胞和早期发育时期的初级精母细胞内较强；酸性磷酸酶(ACP)是睾丸支持细胞溶酶体的特异酶，可使己糖磷酸酯脱磷酸而成为果糖作为精子游动的能源，可作为衡量是否有生精障碍的指标；乳酸脱氢酶(LDH)主要存在于精母细胞、精子细胞质及精子尾中段线粒体中，催化丙酮酸转化为乳酸进行无氧代谢，是生精细胞代谢产生能量的主要酶；葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase)在睾丸组织内主要位于支持细胞的溶酶体和线粒体中，参与各种葡萄糖苷酸的水解以及细胞器的降解和细胞更新。因此，以上4种酶可作为睾丸组织的标志性酶，酶活力可作为判定睾丸组织生理活性的依据。

在传统的细胞和组织冷冻保存过程中，通常使用渗透性的甘油和DMSO作为冷冻保护剂，由于二者具有一定的生物毒性，因而对细胞和组织的冷冻保存效果并不理想。牛血清白蛋白(BSA)是一种从牛血清中提取的、含有580多个氨基酸组成的单肽链，具有复杂的三维分子形状，能结合多种代谢产物。BSA作为蛋白质类膜结构稳定剂，在冷冻保存过程中可以去除细胞核组织膜中的部分胆固醇和锌，从而调整膜的脂肪水平并改变膜的稳定性(DowandBavister1989)；可以克服冷冻过程中产生的溶血磷脂和自由脂肪酸引起的Ca²⁺易进入细胞内的性质(Buhr1990)；可以中和细菌与组织代谢的副产物，起到一定抗氧化作用和缓冲作用(Maxwell1996)。另外，Watson(1981)研究认为，低密度蛋白质可使膜磷脂处于溶解状态，BSA能通过溶解磷脂使膜具有一定的流动性，从而发挥对细胞和组织膜结构的保护作用。海藻糖是一种典型的应激代谢产物，能够在高寒、高渗透压等恶劣条件下于细胞和组织的表面形成独特的保护膜，有效地保护生物大分子的结构不被破坏，从而维持生物体的正常生命过程和生理特征。海藻糖的冷冻保护机理与其晶体结构和化学特性紧密相关。Sussich等认为，海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖，在冷冻过程中可以在细胞和组织膜外产生一种玻璃状的防护层，提高了细胞对高渗透压和低温环境的耐受性；海藻糖作为一种水分替代物，在冷冻过程中避免了细胞膜在固相-液相转变中受到伤害，在细胞内主要作为一种亲和性溶质来抗衡细胞外的渗透压变化。另外，海藻糖在冷冻过程中可以强力地束缚水分子，与膜脂质共同拥有结合水或者本身起到代替膜结合水的功能，防止细胞和组织因失水而造成养分损失和细胞损伤。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种哺乳动物睾丸组织低损伤冷冻保存的抗冻剂及其采用该抗冻剂用于哺乳动物睾丸组织的冷冻-解冻的方法，本发明以牛血清白蛋白(BSA)或海藻糖作为冷冻保护剂的主要成份，以冷冻保存前后犊牛睾丸组织AKP、ACP、LDH和β-D-Glucosidase的酶活性为评定指标，探索最佳的冷冻保护剂配伍与冷冻-解冻技术体系，以保持哺乳动物睾丸组织在冷冻-解冻后具有良好的生理活性。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种哺乳动物睾丸组织的冷冻保存的抗冻剂，其特征在于，所述的抗冻剂是BSA冷冻保护剂或者是海藻糖冷冻保护剂，其中：

BSA冷冻保护剂的配方为：BSA：15mg/mL，DMEM-F12：0.65mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL；

海藻糖冷冻保护剂的配方为：海藻糖：40mg/mL，DMEM-F12：0.6mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL。

所述的缓冲液采用pH＝7的Na₂HPO₄-柠檬酸钠缓冲液。

上述哺乳动物睾丸组织的冷冻保存的抗冻剂用于哺乳动物睾丸组织的冷冻-解冻的方法，其特征在于，按下列步骤实施：

1)在5ml可立式冷冻管中加入2ml经过剪碎的无菌睾丸组织，然后加入BSA冷冻保护剂2ml作为抗冻剂，或者加入海藻糖冷冻保护剂2ml作为抗冻剂；

2)于4℃冰箱中平衡2h，-20℃冰箱中平衡2h，-80℃超低温冰箱中冻存12h，最后投入液氮罐中冷冻保存；

3)冻存7d后，在37℃水浴锅中解冻至完全溶解，离心弃去冷冻保护剂后将睾丸组织移入培养皿中无菌培养24h，然后将睾丸组织和培养液制备成10％的组织匀浆液并离心取上清液；

4)测定匀浆液中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖苷酶的活性值。

本发明的哺乳动物睾丸组织的冷冻保存的抗冻剂，由于采用了BSA冷冻保护剂或海藻糖冷冻保护剂作为抗冻剂，能够在哺乳动物睾丸组织的冷冻-解冻过程中很好地保护哺乳动物睾丸组织的生理活性。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。

按照本发明的技术方案，本实施例给出两种哺乳动物睾丸组织冷冻保存的抗冻剂，它们是BSA冷冻保护剂或海藻糖冷冻保护剂(表1)，其中：

BSA冷冻保护剂的配方为：BSA：15mg/mL，DMEM-F12：0.65mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL；

海藻糖冷冻保护剂的配方为：海藻糖：40mg/mL，DMEM-F12：0.6mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL。

表1：BSA和海藻糖的冷冻保护剂配方

成份

BSA

海藻糖

DMEM-F12

青链霉素双抗

缓冲液

胎牛血清FBS

BSA冷冻保护剂

15mg/mL

0.65mL/mL

0.05ml/mL

0.05mL/mL

0.1mL/mL

海藻糖冷冻保护剂

40mg/mL

0.6mL/mL

0.05ml/mL

0.05mL/mL

0.1mL/mL

注：青链霉素双抗在冷冻保护前单独添加。

该表为BSA和海藻糖的冷冻保护剂的配方，其中BSA为15mg/mL，海藻糖为40mg/mL；DMEM-F12：0.65mL/mL(BSA冷冻保护剂)或0.6mL/mL(海藻糖冷冻保护剂)，青链霉素双抗由5瓶80万单位的青霉素和4瓶100万单位的链霉素，溶于40ml的PBS中再用0.22μm滤器过滤除菌，青链霉素双抗在冷冻保护剂配方中的用量为0.05mL/mL；缓冲液采用pH＝7的Na₂HPO₄-柠檬酸钠缓冲液，即由16.47ml的0.2mol/LNa₂HPO₄(ml)溶液与3.53ml的0.1mol/L柠檬酸钠(ml)溶液混合配制，用0.22μm滤器过滤除菌，即可得到Na₂HPO₄-柠檬酸钠缓冲液，该Na₂HPO₄-柠檬酸钠缓冲液在冷冻保护剂配方中的用量为0.05mL/mL。胎牛血清FBS在冷冻保护剂配方中的用量为0.1mL/mL。

采用上述哺乳动物睾丸组织冷冻保存的抗冻剂用于哺乳动物睾丸组织的冷冻-解冻方法，在5ml可立式冷冻管中加入2ml经过剪碎的无菌睾丸组织，然后加入BSA冷冻保护剂2ml或者海藻糖冷冻保护剂2ml；分别于4℃冰箱中平衡2h，-20℃冰箱中平衡2h，-80℃超低温冰箱中冻存12h，最后投入液氮罐中冷冻保存；冻存7d后，在37℃水浴锅中解冻至完全溶解，离心弃去冷冻保护剂后将睾丸组织移入培养皿中无菌培养24h，然后将睾丸组织和培养液制备成10％的组织匀浆液并离心取上清液，测定匀浆液中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖苷酶的活性值。

实施具体过程如下：

首先根据表1的冷冻保护剂配方提前配制冷冻保护剂，0.22μm滤器过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

试验冷冻所用犊牛睾丸来自8月龄阉割公牛。将PBS升温至37℃后加入1％的青链霉素双抗，将犊牛睾丸浸泡于PBS中，用保暖瓶于1h之内带回实验室。

将犊牛睾丸放入盛有PBS的烧杯中，并用PBS洗涤2～3次，除去血污后用酒精棉球擦拭消毒。超净工作台中用镊子去除脂肪垫、微血管、附睾以及白膜等，充分暴露出线团状生精小管，将生精小管组织用剪刀剪碎至1～2(mm³)，收集备用。将配制好的无菌冷冻保护剂和剪碎的睾丸组织以体积比1：1装入冻存管中并涡旋震荡混匀，4℃冰箱中平衡2h，-20℃冰箱中平衡2h，然后放入-80℃超低温冰箱中12h，最后投入液氮罐中保存，每个处理设置3个重复。

将冻存管置于37℃水浴解冻至完全溶解，1000转/min离心5min并弃去冷冻保护剂，再用PBS离心洗涤3次。将1ml体积的睾丸组织移入培养皿，加入9ml含10％FBS和100U/mL双抗的DMEM-F12，37℃、5％CO₂无菌培养24h，将睾丸组织和培养液匀浆制备成10％的组织匀浆液，2500转/min4℃离心10min取上清液并分装为4份，4℃冰箱保存备用。

将未经冷冻保存的新鲜犊牛睾丸组织，与经BSA和海藻糖冷冻保7天后的睾丸组织，均严格按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书对碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖苷酶的活性进行测定(表2)，并将测得数据代入相关公式准确计算。每个试验处理重复3次，所有结果均用平均值±标准差表示，其中新鲜睾丸组织的酶活性为空白对照组。

表2：BSA和海藻糖的冷冻保护剂保存后的犊牛睾丸组织4种酶的活性值％U/gprot

冷冻保护剂类别	碱性磷酸酶	酸性磷酸酶	乳酸脱氢酶	葡萄糖苷酶
					未经冻存的新鲜睾丸组织	683.43±21.06	151.07±2.32	2085.59±34.72	541.59±6.44
经BSA冻存后的睾丸组织	599.99±18.75	129.11±1.96	1891.53±126.52	489.98±4.18
					经海藻糖冻存后的睾丸组织	454.88±14.42	114.63±1.48	1862.79±30.69	405.26±2.48

BSA冷冻保护剂组：根据以上操作步骤，测定得到经BSA冷冻保护剂冻存7天后的犊牛睾丸组织，其碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖苷酶的活性分别高达599.99±18.75、129.11±1.96、1891.53±126.52和489.98±4.18U/gprot，各种酶的活性值均与新鲜睾丸组织的酶活性极为接近，这说明该BSA冷冻保护剂能够很好地保护犊牛睾丸组织在冷冻-解冻后的生理活性。

海藻糖冷冻保护剂组：根据以上操作步骤，测定得到经海藻糖冷冻保护剂冻存7天后的犊牛睾丸组织，其碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖苷酶的活性分别达到454.88±14.42U/gprot、114.63±1.48U/gprot、1862.79±30.69U/gprot和405.26±2.48U/gprot，各种酶的活性值均与新鲜睾丸组织的酶活性较为接近，这说明该海藻糖冷冻保护剂也能够较好地保护犊牛睾丸组织在冷冻-解冻后的生理活性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种哺乳动物睾丸组织的冷冻保存的抗冻剂，其特征在于，所述的抗冻剂是BSA冷冻保护剂或者是海藻糖冷冻保护剂，其中：

BSA冷冻保护剂的配方为：BSA：15mg/mL，DMEM-F12：0.65mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL；

海藻糖冷冻保护剂的配方为：海藻糖：40mg/mL，DMEM-F12：0.6mL/mL，青链霉素双抗：0.05mL/mL，缓冲液：0.05mL/mL，胎牛血清FBS：0.1mL/mL；

所述的缓冲液采用pH＝7的Na₂HPO₄-柠檬酸钠缓冲液。

2.权利要求1所述的哺乳动物睾丸组织的冷冻保存的抗冻剂用于哺乳动物睾丸组织的冷冻-解冻的方法，其特征在于，按下列步骤实施：

1)在5ml可立式冷冻管中加入2ml经过剪碎的无菌睾丸组织，然后加入BSA冷冻保护剂2ml作为抗冻剂，或者加入海藻糖冷冻保护剂2ml作为抗冻剂；

2)于4℃冰箱中平衡2h，-20℃冰箱中平衡2h，-80℃超低温冰箱中冻存12h，最后投入液氮罐中冷冻保存；

3)冻存7d后，在37℃水浴锅中解冻至完全溶解，离心弃去冷冻保护剂后将睾丸组织移入培养皿中无菌培养24h，然后将睾丸组织和培养液制备成10％的组织匀浆液并离心取上清液；

4)测定匀浆液中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖苷酶的活性值。