CN103749430A - 一种马属动物胚胎冷冻保存液及其配制方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马属动物胚胎切割操作液配制方法和应用，其中，胚胎切割操作液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种、两种或三种；其配制方法包括：将乳酸钠混合液置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即得到胚胎切割操作液。适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。本发明的有益效果是：具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。

Description

一种马属动物胚胎冷冻保存液及其配制方法和应用

技术领域

本发明属于动物胚胎移植领域，特别是涉及一种马属动物冷冻保存液及其配制方法和应用。

背景技术

将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第5-6天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静止下来并可在-196度的液氮中保存的一种方法。在胚胎移植的过程中，若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内，将增加受孕的机会。

胚胎冷冻保存液，是在胚胎冷冻的过程中，为胚胎提保护性的营养液体。目前国内外对胚胎冷冻保存液的保存鲜有人报道。特别是国内，马属动物相关的胚胎冷冻保存液的研究几乎为零。而进口胚胎冷冻保存液价格昂贵，且其配方配制过程繁琐。

发明内容

为了解决传统的胚胎冷冻保存液药品来源困难、价格昂贵、配制步骤繁琐且需现用现配等问题，本发明提供了一种适用于规模化生产的马属动物非手术法胚胎移植用胚胎冷冻保存液及其配制方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马属动物胚胎冷冻保存液，所述冷冻保存液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白或犊牛血清或灭活马血清中的一种、两种或三种。

所述乳酸钠混合液包括乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和黄芪多糖中的一种或多种。

所述胚胎冷冻保存液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素30-180万单位、链霉素20-200万单位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犊牛血清0.5%-15%和/或灭活马血清0.5%-14%。其中，所述血清白蛋白、所述犊牛血清以及所述灭活马血清的百分比为体积百分比。

所述胚胎冷冻保存液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素50-150万单位、链霉素50-150万单位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犊牛血清1%-10%和/或灭活马血清1%-10%。其中，所述血清白蛋白、所述犊牛血清以及所述灭活马血清的百分比为体积百分比。

所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠1-7g、氯化钠1-5g、氯化钾2-7g、氯化钙0.5-2g、氯化镁0.05-0.5g和黄芪多糖0.01-0.3g。

所述乳酸钠混合液中各组分的含量优选为：每1000ml混合液中含有乳酸钠3-7g、氯化钠2-5g、氯化钾3-7g、氯化钙0.5-1.5g、氯化镁0.1-0.4g和黄芪多糖0.01-0.1g。

所述乳酸钠混合液中各组分的含量还可以优选为：每1000ml混合液中含有乳酸钠5.4g、氯化钠3.2g、氯化钾4.6g、氯化钙1.1g、氯化镁0.32g和黄芪多糖0.08g。

为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种马属动物胚胎冷冻保存液的配制方法，包括：

（1）按照各组分的含量称取乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，并加入蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用；

（2）称取黄芪多糖放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入步骤（1）中得到的混合液，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；

（3）胚胎冷冻保存前，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即可得到保存液。

本发明的马属动物胚胎冷冻保存液适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。

 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明以乳酸钠混合液作为主液，可提前配制待用，使用前只需向主液中加入适量抗生素及牛血清白蛋白或犊牛血清或灭活马血清即可。具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。

 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

 实施例1

一种马属动物胚胎冷冻保存液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，每1000ml乳酸钠混合液含有50万单位青霉素、50万单位链霉素和体积百分比为10%的犊牛血清。

称取乳酸钠27g、氯化钠16g、氯化钾23g、氯化钙5.5g和氯化镁1.6g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中6小时后，备用；称取黄芪多糖0.4g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；胚胎冷冻保存前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及犊牛血清，即可得到胚胎冷冻保存液。

使用本实施例胚胎冷冻保存液对非手术法牛胚胎冷冻保存。

 实施例2

一种马属动物胚胎冷冻保存液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，每1000ml乳酸钠林格注射液含有100万单位青霉素、120万单位链霉素和体积百分比为3%的灭活马血清。

称取乳酸钠10.5g、氯化钠6g、氯化钾13.5g和氯化钙9g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中3小时后，备用；称取黄芪多糖1.4g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；胚胎冷冻保存前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到胚胎冷冻保存液。

本实施例胚胎冷冻保存液应用于非手术法马胚胎的冷冻保存。

 实施例3

一种马属动物胚胎冷冻保存液，包括4000ml乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有80万单位青霉素、80万单位链霉素和体积百分比为5%的灭活马血清；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠26g、氯化钠10.8g、氯化钾21g和氯化钙16.8g。

称取乳酸钠26g、氯化钠10.8g、氯化钾21g和氯化钙16.8g，加入4000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中1小时后，得到乳酸钠混合液以待备用；胚胎冷冻保存前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到胚胎冷冻保存液。

本实施例胚胎冷冻保存液应用于非手术法马胚胎冷冻保存。

 实施例4

一种马属动物胚胎冷冻保存液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有60万单位青霉素、90万单位链霉素和体积百分比为8%的灭活马血清；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠25.0g、氯化钠20.0g、氯化钾25g、氯化钙7.5g、氯化镁2.25g和黄芪多糖0.25g。

称取乳酸钠25.0g、氯化钠20.0g、氯化钾25g、氯化钙7.5g和氯化镁2.25g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中1小时后，备用；称取黄芪多糖0.25g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；胚胎冷冻保存前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到胚胎冷冻保存液。

本实施例胚胎冷冻保存液应用于非手术法马胚胎的冷冻保存。

 实施例5

一种马属动物胚胎冷冻保存液，包括4000ml乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有150万单位青霉素、60万单位链霉素和体积百分比为0.35%的牛血清白蛋白；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠16.8g、氯化钠8.0g、氯化钾14g、氯化钙2.8g和氯化镁1.08g。

称取乳酸钠16.8g、氯化钠8.0g、氯化钾14g、氯化钙2.8g和氯化镁1.08g,加入4000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中1小时后，得到乳酸钠混合液，以待备用；胚胎冷冻保存前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白，即可得到胚胎冷冻保存液。

本实施例胚胎冷冻保存液应用于非手术法牛胚胎的冷冻保存。

 对比实验：

选取9头正常的供体母牛分成3组，在母牛发情后第七天，分别使用实施例1得到的胚胎冷冻保存液（实施例组1）、实施例5得到的胚胎冷冻保存液（实施例组5）和传统胚胎冷冻保存液（对照组1）进行冲卵，并保存胚胎30min后进行检卵和移植。1周后统计移植统计，并对受体进行观察，直至生产。供体母牛及胚胎移植效果如表1所示。

选取80匹正常的供体母马分成4组，在母马发情后第七天，分别使用实施例2-4得到的胚胎冷冻保存液（实施例组2-4）和传统胚胎冷冻保存液（对照组2）进行冲卵，并保存胚胎30min后进行检卵和移植。1周后统计胚胎移植数，并对受体进行观察，直至生产。供体母马胚胎移植效果如表2所示。

表1 供体母牛冲卵及胚胎移植效果对照表

组别	供体母牛数（头）	获得胚胎数（枚）	移植受体数（头）	产犊数（头）	胚胎成活率（%）
						实施例组1	3	33	29	28	96.6
实施例组5	3	32	28	27	96.4
						对照组	3	32	28	23	82.1

表2 供体母马冲卵及胚胎移植效果对照表

组别	供体母马数（匹）	获得胚胎数（枚）	移植受体数（匹）	产驹数（匹）	胚胎成活率（%）
						实施例组2	20	32	30	29	96.7
实施例组3	20	33	31	29	93.5
						实施例组4	20	32	30	29	96.7
对照组2	20	33	30	24	80.0

从表1和表2的数据可知：与传统胚胎冷冻保存液相比，使用本发明的胚胎冷冻保存液进行冲卵并保存胚胎30min后进行检卵和移植，其获得胚胎数相差不明显，但其胚胎成活率提高13-16个百分点。

通过对比实验可知，本发明实施例配比的马属动物胚胎冷冻保存液提高了产犊/驹数和胚胎成活率，且与传统胚胎冷冻保存液相比，其具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，不需现用现配，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。

 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (9)

1.马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述冷冻保存液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种、两种或三种。

2.根据权利要求1所述的马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述乳酸钠混合液包括乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和黄芪多糖中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述冷冻保存液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素30-180万单位、链霉素20-200万单位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犊牛血清0.5%-15%和/或灭活马血清0.5%-14%。

4.根据权利要求1或2所述的马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述冷冻保存液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素50-150万单位、链霉素50-150万单位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犊牛血清1%-10%和/或灭活马血清1%-10%。

5.根据权利要求1-4任一项所述的马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠1-7g、氯化钠1-5g、氯化钾2-7g、氯化钙0.5-2g、氯化镁0.05-0.5g和黄芪多糖0.01-0.3g。

6.根据权利要求1-5任一项所述的马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠3-7g、氯化钠2-5g、氯化钾3-7g、氯化钙0.5-1.5g、氯化镁0.1-0.4g和黄芪多糖0.01-0.1g。

7.根据权利要求1-6任一项所述的马属动物胚胎冷冻保存液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠5.4g、氯化钠3.2g、氯化钾4.6g、氯化钙1.1g、氯化镁0.32g和黄芪多糖0.08g。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的马属动物胚胎冷冻保存液的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括：

（1）按照各组分的含量称取乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，并加入蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用；

（2）称取黄芪多糖放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入步骤（1）中得到的混合液，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；

（3）胚胎冷冻保存前，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即可得到胚胎冷冻保存液。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的马属动物胚胎冷冻保存液的应用，其特征在于，所述胚胎冷冻保存液适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。