CN103756956A - 一种马属动物胚胎切割操作液配制方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马属动物胚胎切割操作液配制方法和应用，其中，胚胎切割操作液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种、两种或三种；其配制方法包括：将乳酸钠混合液置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即得到胚胎切割操作液。适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。本发明的有益效果是：具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。

Description

一种马属动物胚胎切割操作液配制方法和应用

技术领域

本发明属于动物胚胎移植领域，特别是涉及一种马属动物胚胎切割操作液及其配制方法和应用。

背景技术

胚胎分割技术（Embryo bisection）是借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。

胚胎分割操作液是用于获取胚胎后进行胚胎分割操作时营养保护性液体。胚胎分割操作液多数为组织培养液，目前国内常用的胚胎切割操作液主要有杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）、布林斯特氏液、合成输卵管液（SOF）、惠屯氏液、Ham’s F-110以及TCM-199。上述几种液体均存在药品来源困难，价格昂贵，配制步骤繁琐且需现用现配等问题，为胚胎移植的规模化生产带来极大的不便。

 发明内容

为了解决传统的胚胎分割操作液药品来源困难、价格昂贵、配制步骤繁琐且需现用现配等问题，本发明提供了一种适用于规模化生产的马属动物非手术法胚胎移植用胚胎切割操作液及其配制方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马属动物胚胎分割操作液，所述胚胎切割操作液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白或犊牛血清或灭活马血清中的一种、两种或三种。

所述乳酸钠混合液包括乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和黄芪多糖中的一种或多种。

所述胚胎切割操作液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素30-180万单位、链霉素20-200万单位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犊牛血清0.5%-15%和/或灭活马血清0.5%-14%。其中，所述血清白蛋白、所述犊牛血清以及所述灭活马血清的百分比为体积百分比。

所述胚胎分割操作液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素50-150万单位、链霉素50-150万单位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犊牛血清1%-10%和/或灭活马血清1%-10%。其中，所述血清白蛋白、所述犊牛血清以及所述灭活马血清的百分比为体积百分比。

所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠1-7g、氯化钠1-5g、氯化钾2-7g、氯化钙0.5-2g、氯化镁0.05-0.5g和黄芪多糖0.01-0.3g。

所述乳酸钠混合液中各组分的含量优选为：每1000ml混合液中含有乳酸钠3-7g、氯化钠2-5g、氯化钾3-7g、氯化钙0.5-1.5g、氯化镁0.1-0.4g和黄芪多糖0.01-0.1g。

所述乳酸钠混合液中各组分的含量还可以优选为：每1000ml混合液中含有乳酸钠5.4g、氯化钠3.2g、氯化钾4.6g、氯化钙1.1g、氯化镁0.32g和黄芪多糖0.08g。

为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种马属动物胚胎切割操作液的配制方法，包括：

（1）按照各组分的含量称取乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，并加入蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用；

（2）称取黄芪多糖放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入步骤（1）中得到的混合液，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；

（3）胚胎分割操作前，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即可得到胚胎分割操作液。

本发明的马属动物胚胎切割操作液适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。

 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明以乳酸钠混合液作为主液，可提前配制待用，使用前只需向主液中加入适量抗生素及牛血清白蛋白或犊牛血清或灭活马血清即可。具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。

 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

 实施例1

一种马属动物胚胎分割操作液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，每1000ml乳酸钠混合液含有50万单位青霉素、50万单位链霉素和体积百分比为10%的犊牛血清。

称取乳酸钠27g、氯化钠16g、氯化钾23g、氯化钙5.5g和氯化镁1.6g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中6小时后，备用；称取黄芪多糖0.4g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；胚胎分割操作前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及犊牛血清，即可得到胚胎分割操作液。

使用本实施例胚胎分割操作液对非手术法牛胚胎胚胎分割操作。

 实施例2

一种马属动物胚胎分割操作液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，每1000ml乳酸钠林格注射液含有100万单位青霉素、120万单位链霉素和体积百分比为3%的灭活马血清。

称取乳酸钠10.5g、氯化钠6g、氯化钾13.5g和氯化钙9g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中3小时后，备用；称取黄芪多糖1.4g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；胚胎分割操作前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到胚胎分割操作液。

本实施例胚胎分割操作液应用于非手术法马胚胎的胚胎分割。

 实施例3

一种马属动物胚胎分割操作液，包括4000ml乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有80万单位青霉素、80万单位链霉素和体积百分比为5%的灭活马血清；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠26g、氯化钠10.8g、氯化钾21g和氯化钙16.8g。

称取乳酸钠26g、氯化钠10.8g、氯化钾21g和氯化钙16.8g，加入4000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中1小时后，得到乳酸钠混合液以待备用；胚胎分割操作前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到胚胎分割操作液。

本实施例胚胎分割操作液应用于非手术法马胚胎的胚胎分割操作。

 实施例4

一种马属动物胚胎分割操作液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有60万单位青霉素、90万单位链霉素和体积百分比为8%的灭活马血清；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠25.0g、氯化钠20.0g、氯化钾25g、氯化钙7.5g、氯化镁2.25g和黄芪多糖0.25g。

称取乳酸钠25.0g、氯化钠20.0g、氯化钾25g、氯化钙7.5g和氯化镁2.25g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中1小时后，备用；称取黄芪多糖0.25g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；胚胎分割前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到胚胎分割操作液。

本实施例胚胎分割操作液应用于非手术法马胚胎的胚胎分割操作。

 实施例5

一种马属动物胚胎分割操作液，包括4000ml乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有150万单位青霉素、60万单位链霉素和体积百分比为0.35%的牛血清白蛋白；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠16.8g、氯化钠8.0g、氯化钾14g、氯化钙2.8g和氯化镁1.08g。

称取乳酸钠16.8g、氯化钠8.0g、氯化钾14g、氯化钙2.8g和氯化镁1.08g,加入4000ml蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中1小时后，得到乳酸钠混合液，以待备用；胚胎分割操作前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白，即可得到胚胎分割操作液。

本实施例胚胎分割操作液应用于非手术法牛胚胎的胚胎分割操作。

 对比实验：

选取9头正常的供体母牛分成3组，在母牛发情后第七天，分别使用实施例1得到的胚胎分割操作液（实施例组1）、实施例5得到的胚胎分割操作液（实施例组5）和传统胚胎分割操作液（对照组1）进行胚胎分割操作，并保存胚胎30min后进行检卵和移植。1周后统计冲卵及移植数，并对受体进行观察，直至生产。供体母牛冲卵及胚胎移植效果如表1所示。

选取80匹正常的供体母马分成4组，在母马发情后第七天，分别使用实施例2-4得到的胚胎分割操作液（实施例组2-4）和传统胚胎分割操作液（对照组2）进行冲卵，并保存胚胎30min后进行检卵和移植。1周后统计冲卵及移植数，并对受体进行观察，直至生产。供体母马冲卵及胚胎移植效果如表2所示。

表1 供体母牛冲卵及胚胎移植效果对照表

组别	供体母牛数（头）	获得胚胎数（枚）	移植受体数（头）	产犊数（头）	胚胎成活率（%）
						实施例组1	3	33	29	28	96.6
实施例组5	3	32	28	27	96.4
						对照组	3	32	28	23	82.1

表2 供体母马冲卵及胚胎移植效果对照表

组别	供体母马数（匹）	获得胚胎数（枚）	移植受体数（匹）	产驹数（匹）	胚胎成活率（%）
						实施例组2	20	32	30	29	96.7
实施例组3	20	33	31	29	93.5
						实施例组4	20	32	30	29	96.7
对照组2	20	33	30	24	80.0

从表1和表2的数据可知：与传统胚胎分割操作液相比，使用本发明的胚胎分割操作液进行冲卵并保存胚胎30min后进行检卵和移植，其获得胚胎数相差不明显，但其胚胎成活率提高13-16个百分点。

通过对比实验可知，本发明实施例配比的马属动物胚胎分割操作液提高了产犊/驹数和胚胎成活率，且与传统胚胎分割操作液相比，其具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，不需现用现配，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。

 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述胚胎切割操作液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种、两种或三种。

2.根据权利要求1所述的马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述乳酸钠混合液包括乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和黄芪多糖中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述胚胎切割操作液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素30-180万单位、链霉素20-200万单位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犊牛血清0.5%-15%和/或灭活马血清0.5%-14%。

4.根据权利要求1或2所述的马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述胚胎切割操作液中各组分的含量为：每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素50-150万单位、链霉素50-150万单位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犊牛血清1%-10%和/或灭活马血清1%-10%。

5.根据权利要求1-4任一项所述的马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠1-7g、氯化钠1-5g、氯化钾2-7g、氯化钙0.5-2g、氯化镁0.05-0.5g和黄芪多糖0.01-0.3g。

6.根据权利要求1-5任一项所述的马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠3-7g、氯化钠2-5g、氯化钾3-7g、氯化钙0.5-1.5g、氯化镁0.1-0.4g和黄芪多糖0.01-0.1g。

7.根据权利要求1-6任一项所述的马属动物胚胎切割操作液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为：每1000ml混合液中含有乳酸钠5.4g、氯化钠3.2g、氯化钾4.6g、氯化钙1.1g、氯化镁0.32g和黄芪多糖0.08g。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的马属动物胚胎切割操作液的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括：

（1）按照各组分的含量称取乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，并加入蒸馏水混合，置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用；

（2）称取黄芪多糖放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入步骤（1）中得到的混合液，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；

（3）胚胎切割操作前，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即可得到胚胎切割操作液。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的马属动物胚胎切割操作液的应用，其特征在于，所述胚胎切割操作液适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。