CN103881965B - 一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液及培养方法，所述牛胚胎体外培养液组成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶剂为SOF培养液。本发明将海藻糖和大豆甙元组合应用于牛胚胎体外，相比于单独使用海藻糖或者大豆甙元，可以显著提高体外胚胎的发育率，其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液，以及利用所述牛胚胎体外培养液进行牛胚胎体外培养的方法。
（二）背景技术
随着现代繁殖生物技术的发展及胚胎体外生产技术的逐步完善，利用体外受精技术生产体外胚胎呈现出潜在的广阔应用前景。家畜胚胎体外生产尤其是体细胞核移植是快速扩大优秀种群数量的有效途径。虽然通过体外受精技术已经获得了活的后代，但体外受精后的早期胚胎体外发育率较低，限制了胚胎体外生产在实践中的推广应用。
体内早期胚胎的发育在避光、低氧气浓度（约7%）的雌性生殖道内完成，并且有输卵管和子宫分泌的粘液保护。但胚胎的体外培养在约含20%氧气的培养箱中完成，这种高浓度氧气将对体外培养的胚胎产生显著的氧化应激。并且体外胚胎脱离了母体的保护，不仅会受到氧化应激的损伤，还面临日光或灯光刺激、渗透压变化等因素的影响。这些不利因素直接导致了目前体外胚胎的早期发育率显著低于体内胚胎，已成为体外受精等胚胎体外生产技术推广应用的一个瓶颈。
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖，化学性质稳定，对热、酸都不敏感，并具有独特的生物学特性、对生物抗脱水的保护作用、抗冷冻保护作用和抗高渗保护作用，在各种恶劣环境下，海藻糖表现出对物种的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子良好的保护作用。对于海藻糖的研究已有文献报道。CN103450288A、CN103146779A、CN102965412A、CN102337313A、CN101831474A、CN1807465A等多种专利申请公开了海藻糖的合成或纯化方法。CN101181279A、CN1302812C、CN100571707C、CN101443344A等多种专利公开了海藻糖在医药领域的用途。而CN101513221A、CN103250880A等多种专利公开了海藻糖用作动物饲料添加剂的用途。但到目前为止，尚未见有关海藻糖用于家畜繁殖技术领域，特别是用于胚胎体外培养的报道。
（三）发明内容
本发明的目的是提供一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液及培养方法，本申请发明人就海藻糖用于牛胚胎体外培养进行了长时间的研究，从而完成了本发明，该培养液具有缓解体外环境对早期胚胎的多种应激损伤，提高卵母细胞体外受精后胚胎发育率的功能。
本发明采用的技术方案是：
一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液，所述牛胚胎体外培养液组成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶剂为SOF培养液。
所述海藻糖已有多种制取方法，属于已知工艺和成熟技术，并已有商品出售，较为成熟的生产和销售厂家有河南华诺海藻生物工程有限公司、武汉富瑞斯凯材料供应有限公司、厦门美拉德食品配料有限公司、Sigma公司等。本发明中所用海藻糖购自Sigma公司，纯度大于98%。
所述大豆甙元已有多种制取方法，属于已知工艺和成熟技术，并已有商品出售，较为成熟的生产和销售厂家有西安融升生物科技有限公司、成都新基科技有限公司、Sigma公司等，本发明中所用大豆甙元购自Sigma公司。由于大豆甙元不溶于水，因此通常先用少量有机溶剂如DMSO溶解之后再进行培养基的配制。
优选的，所述培养液组成如下：
溶剂为SOF培养液。
本发明还涉及一种利用所述牛胚胎体外培养液进行牛胚胎体外培养的方法，所述方法包括：将受精后的早期牛胚胎用SOF培养液反复冲洗后，放入所述含海藻糖的牛胚胎体外培养液中，于38～39℃、5%CO2的环境内，进行胚胎体外培养。
所述早期牛胚胎由牛卵母细胞经常规体外成熟培养、体外受精获得。
优选的，所述方法如下：
（1）配制牛卵母细胞体外成熟培养液，组成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清体积百分含量8%～20%，溶剂为常规培养液；所述常规培养液为M199、DMEM、F12、MEM中的一种或多种；所述的血清可为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中一种；
（2）将牛卵母细胞体外成熟培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，牛卵母细胞经冲洗（用常规培养液冲洗）后放入预热后的培养小滴，在38～39℃、5%CO2的环境内培养20～24小时；所述牛可为奶牛、黄牛或者水牛中一种；所述牛卵母细胞是从屠宰场获取的卵巢中用注射器抽取的，其周围至少包裹三层卵丘细胞并且细胞质比较均匀；
（3）用常规受精培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50～100μL的受精小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后与步骤（2）培养后的牛卵母细胞一同放入受精小滴，在38～39℃、5%CO2的环境内培养15～18小时，进行受精，得到受精后的早期胚胎；
（4）配制牛胚胎体外培养液，组成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶剂为SOF培养液；
（5）用步骤（4）配制的牛胚胎体外培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，将受精后的早期胚胎冲洗（常规胚胎体外培养液冲洗三次）后，放入培养小滴中，在38～39℃、5%CO2的环境内培养。
优选的，步骤（3）所述受精培养液为含5～10mg/mL肝素的BO液、或者Tyrode’s改良液。
本发明胚胎体外培养液，是根据目前胚胎体外生产时，体外胚胎早期发育率较低的现状，结合海藻糖的结构特点和功能研制而成。海藻糖是天然双糖中性质最稳定的，对热、酸都不敏感，与蛋白质和氨基酸混合加热时也不会发生着色变化。在恶劣环境下，海藻糖已表现出对物种的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子良好的保护作用。外源性的海藻糖对生物体或生物大分子也具有独特的非特异性保护作用。课题组的实验证实，海藻糖应用于牛胚胎体外培养，可以有效提高体外胚胎的发育率，解决了目前受精后牛胚胎体外发育率低的问题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
本发明的有益效果主要体现在：本发明将海藻糖和大豆甙元组合应用于牛胚胎体外培养，相比于单独使用海藻糖或者大豆甙元，可以显著提高体外胚胎的发育率，其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：制备含海藻糖的牛胚胎体外培养液
准确称取海藻糖30mg，先用20mL的SOF培养液溶解，然后向培养液中加入400mg牛血清白蛋白和5000IU的青霉素，5000μg的链霉素，轻微搅拌均匀，再加入SOF培养液至50mL体积，再次搅拌混匀。用0.22μM的微滤膜（Millipore Corporation，Bedford.Mass.USA）抽滤消毒后，在4℃下贮存，备用。
实施例2：含海藻糖的培养液用于奶牛胚胎体外培养
奶牛卵母细胞在牛卵母细胞体外成熟培养液（含有100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和体积百分含量为10%胎牛血清的M199培养液（购自美国GIBCO公司））中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎分别在不含海藻糖的SOF培养液（对照组）、只含海藻糖0.6mg/mL的SOF培养液、只含大豆甙元0.5μg/mL的SOF培养液以及实施例1制备的含海藻糖和大豆甙元的牛胚胎体外培养液中继续培养8天。
具体方法如下：
A、成熟培养：牛卵母细胞体外成熟培养液在一次性塑料培养皿上形成体积约为80～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热2小时，牛卵母细胞经冲洗后放入预热后的培养小滴，在38～39℃、5%CO2的环境内培养24小时；
B、体外受精：用受精培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为80～100μL的受精小滴，置38～39℃环境中预热2小时，将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后与步骤（A）培养后的牛卵母细胞一同放入受精小滴，在38～39℃、5%CO2的环境内培养16小时，进行受精，得到受精后的早期胚胎；受精培养液为含8mg/mL肝素的BO液；
C、用实施例1牛胚胎体外培养液在一次性塑料培养皿上做成体积为50～100μL的培养小滴置38～39℃环境中预热1～3小时。将受精后的早期胚胎用胚胎体外培养液冲洗三次后，放入培养小滴中，在38～39℃、5%CO2的环境内培养8天。于培养后的第48小时和第8天分别统计胚胎分裂率和囊胚期发育率。
结果显示：培养的第2天，对照组中的早期胚胎分裂率为71.3%，在实施例1制备的含海藻糖的牛胚胎体外培养液中的早期胚胎分裂率为77.6%，比对照组提高8.3%。培养的第8天，对照组中的早期胚胎囊胚期发育率为20.4%，在实施例1制备的含海藻糖的牛胚胎体外培养液中的早期胚胎囊胚期发育率为32.7%，比对照组提高12.3%。（参见表1）
表1
| 组别 | 卵裂率（%） | 囊胚发育率（%） |
| 不含海藻糖和大豆甙元培养液组 | 69.3a | 20.4a |
| 只含海藻糖的培养液组 | 68.1a | 19.6a |
| 只含大豆甙元的培养液组 | 70.2a | 20.0a |
| 实施例1培养液组 | 77.6b | 32.7b |
注：同列数字不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
结果证实，实施例1制备的含海藻糖的牛胚胎体外培养液体外培养奶牛胚胎可有效提高受精后的早期胚胎发育率。
实施例3：含海藻糖的培养液用于黄牛胚胎体外培养
黄牛卵母细胞在含有100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和体积百分含量为10%胎牛血清的M199培养液中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎分别在不含海藻糖的SOF基础培养液（对照组）、只含海藻糖0.6mg/mL的SOF培养液、只含大豆甙元0.5μg/mL的SOF培养液以及实施例1制备的含海藻糖和大豆甙元的牛胚胎体外培养液中继续培养8天。
具体方法同实施例2。
结果显示：培养的第2天，对照组中的早期胚胎分裂率为70.5%，在实施例1制备的含海藻糖的牛胚胎体外培养液中的早期胚胎分裂率为78.1%，比对照组提高8.4%。培养的第8天，对照组中的早期胚胎囊胚期发育率为19.1%，在实施例1制备的含海藻糖的牛胚胎体外培养液中的早期胚胎囊胚期发育率为32.9%，比对照组提高13.8%。（参见表2）
表2
| 组别 | 卵裂率（%） | 囊胚发育率（%） |
| 不含海藻糖和大豆甙元培养液组 | 69.7a | 19.1a |
| 只含海藻糖的培养液组 | 70.3a | 20.3a |
| 只含大豆甙元的培养液组 | 68.5a | 18.7a |
| 实施例1培养液组 | 78.1b | 32.9b |
注：同列数字不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
实施例4：含海藻糖的培养液用于奶牛卵母细胞体外成熟培养和牛胚胎体外培养
具体方法如下：
A、成熟培养：牛卵母细胞体外成熟培养液在一次性塑料培养皿上形成体积约为80～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热2小时，牛卵母细胞经冲洗后放入预热后的培养小滴，在38～39℃、5%CO2的环境内培养24小时；以不含海藻糖和大豆甙元的M199培养液（对照组1）、只含海藻糖0.6mg/mL的M199培养液（对照组2）、只含大豆甙元0.5μg/mL的M199培养液（对照组3）作为对照；
牛卵母细胞体外成熟培养液配制：称取大豆甙元10mg，溶解到1mL的DMSO中，配成母液贮存在4℃冰箱内。准确称取海藻糖30mg，先用20mL的M199培养液（Gibco公司）溶解，然后向溶解有海藻糖的M199培养液中加入2.5μL上述大豆甙元母液、5mL小牛血清、5000IU的青霉素、5000μg的链霉素，轻微搅拌均匀，再加入M199培养液至50mL体积，再次搅拌混匀。用0.22μM的微滤膜（Millipore Corporation，Bedford.Mass.USA）抽滤消毒后，在4℃下贮存，备用。
B、体外受精：用受精培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为80～100μL的受精小滴，置38～39℃环境中预热2小时，将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后与步骤（A）培养后的牛卵母细胞一同放入受精小滴，在38～39℃、5%CO2的环境内培养16小时，进行受精，得到受精后的早期胚胎；受精培养液为含8mg/mL肝素的BO液；
C、用实施例1牛胚胎体外培养液在一次性塑料培养皿上做成体积为50～100μL的培养小滴置38～39℃环境中预热1～3小时。将受精后的早期胚胎用胚胎体外培养液冲洗三次后，放入培养小滴中，在38～39℃、5%CO2的环境内培养8天，以不含海藻糖的SOF培养液（对照组1）、只含海藻糖0.6mg/mL的SOF培养液（对照组2）、只含大豆甙元0.5μg/mL的SOF培养液（对照组3）作为对照。于培养后的第48小时和第8天分别统计胚胎分裂率和囊胚期发育率，结果见表3。
表3
| 表3组别 | 卵裂率（%） | 囊胚发育率（%） |
| 不含海藻糖和大豆甙元培养液组（对照组1） | 71.5a | 20.6a |
| 只含海藻糖的培养液组（对照组2） | 71.4a | 21.1a |
| 只含大豆甙元的培养液组（对照组3） | 69.7a | 19.3a |
| 实施例1培养液组 | 82.3b | 35.7b |
注：同列数字不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
Claims (6)
1.一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液，其特征在于所述牛胚胎体外培养液组成如下：海藻糖0.6mg/mL，大豆甙元0.5μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶剂为SOF培养液。
2.如权利要求1所述的牛胚胎体外培养液，其特征在于所述培养液组成如下：
溶剂为SOF培养液。
3.利用权利要求1所述牛胚胎体外培养液进行牛胚胎体外培养的方法，所述方法包括：将受精后的早期牛胚胎用SOF培养液反复冲洗后，放入所述含海藻糖的牛胚胎体外培养液中，于38～39℃、5％CO2的环境内，进行胚胎体外培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述早期牛胚胎由牛卵母细胞经体外成熟培养、体外受精获得。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)配制牛卵母细胞体外成熟培养液，组成如下：海藻糖0.6mg/mL，大豆甙元0.5μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清体积百分含量8％～20％，溶剂为M199培养液；
(2)将牛卵母细胞体外成熟培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，牛卵母细胞经冲洗后放入预热后的培养小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内培养20～24小时；
(3)用受精培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50～100μL的受精小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后与步骤(2)培养后的牛卵母细胞一同放入受精小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内培养15～18小时，进行受精，得到受精后的早期胚胎；
(4)配制牛胚胎体外培养液，组成如下：海藻糖0.6mg/mL，大豆甙元0.5μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶剂为SOF培养液；
(5)用步骤(4)牛胚胎体外培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，将受精后的早期胚胎冲洗后，放入培养小滴中，在38～39℃、5％CO2的环境内培养。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)所述受精培养液为含5～10mg/mL肝素的BO液、或者Tyrode’s改良液。
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