CN104130973A - 用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒。本发明涉及用于绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液，其特征在于：包含绵羊小卵泡液和用于绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液成分。本发明还公开了一种绵羊卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于在常规体外成熟方法的基础上增加了预处理步骤。同时，本发明还验证了采用本发明的成熟方法培养的卵母细胞体外受精后获得的受精卵的卵裂率和囊胚率显著高于常规成熟方法培养的卵母细胞。本发明提供的预处理液和体外成熟培养方法能有效地促进绵羊卵母细胞体外成熟，具有对卵母细胞无毒害、限制少、效果好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及胚胎工程领域，具体涉及用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒。
背景技术
在家畜繁殖上，卵巢来源的卵母细胞是生产动物胚胎的主要来源之一，因此卵母细胞体外成熟对于动物育种、克隆以及转基因动物生产是一个重要的平台技术。
2003年，王旭光对比了不同季节新疆绵羊卵母细胞在不同FSH、LH浓度下体外成熟的效果，并发现绵羊卵母细胞体外成熟的培养时间以24～26h为宜，同时探索了不同的EH和电激活方案对卵母细胞体外成熟的影响，发现EH+A23187+CHX是最适绵羊卵母细胞激活方案，卵裂率达到69.8％，囊胚率达到30％(王旭光.绵羊卵母细胞体外成熟和孤雌激活的研究[D].新疆：新疆农业大学,2003)。吕自力等于2004年按不同分布对绵羊卵母细胞进行了分级，并研究了在同样的体外培养条件下，不同级别的卵母细胞的成熟率，结果证明卵丘—卵母细胞复合体(COCs)的成熟率最高，达到68.9％(吕自力，马育芳，帅志强等.不同级别绵羊卵母细胞在春季体外培养条件下的成熟率比较[J].黑龙江畜牧兽医,2004,05)。2006年，王宝珍通过试验证明绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养时间以24h为佳,FCS浓度以20％最适宜(王宝珍.绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养的研究[J].甘肃畜牧兽医,2006,05)。同年，孙桂金研究了FSH/LH浓度、年龄和采卵季节对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:FSH/LH能促进绵羊卵母细胞体外成熟，添加量以10μg/ml为宜；成年绵羊卵母细胞成熟率高于性成熟前绵羊，但无显著差异；发情季节绵羊卵母细胞较乏情季节易成熟。(孙桂金,尹逊河,敖红.绵羊卵母细胞体外成熟的研究[J].中国草食动物,2006,05)。同时，万鹏程等人还发现在绵羊体外成熟培养系统中添加5ng/mLVEGF能够显著(P<0.01)提高绵羊卵母细胞的体外成熟率，证实了VEGF对绵羊卵母细胞的体外成熟具有调节作用(万鹏程,罗海玲,张小红.血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟及体外受精卵卵裂率的影响[J].中国畜牧杂志,2006,23)。2008年，张晓建等人发现体外成熟培养19～21h的绵羊卵母细胞在成熟率上显著高于体外成熟培养16～18h(P<0.05)(张晓建,安志兴,李学斌.卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响[J].安徽农业科学,2008,32)。刘丑生等人于同年研究了EGFI、GF-I以及EGF和IGF-I联合对绵羊卵母细胞体外成熟和卵裂的影响，结果表明:50ng/mL的EGF的成熟率和卵裂率分别为71.2％和45.5％,显著高于对照组和10、20、304、0ng/mL组(P<0.05),当EGF浓度达到100ng/mL时,成熟率和卵裂率最高,分别为72.9％和45.7％(刘丑生,陆会宁,张利平.EGF和IGF-I对绵羊卵母细胞体外成熟和卵裂的影响[J].畜牧兽医学报,2008,05)。2013年，徐燕霞在成熟液中分别加入BMP15、FGF8b，以成熟液作为对照组，对不同培养液的卵母细胞的成熟率和早期胚胎的发育情况进行比较。实验结果表明，成熟液中添加BMP15，卵母细胞的成熟率和胚胎发育情况明显高于对照组和添加FGF8b组，差异极显著(P<0.01)；对照组和添加FGF8b组卵母细胞成熟率和胚胎发育情况差异不显著(P>0.05)(徐燕霞.BMP15、FGF8b对绵羊卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育影响的初步研究[D].甘肃：甘肃农业大学,2013)。2014年，刘春霞等人通过实验证实了添加10％～15％ESS,10μg/mLFSH,20μg/mLLH,1.5μg/mL17-β E2,100IU青霉素,100IU链霉素的TCM-199成熟培养液能较好地促进绵羊卵母细胞体外成熟(刘春霞,赵瑞媛,周欢敏.绵羊卵母细胞体外受精培养体系的建立与优化[J].内蒙古农业大学学报,2014,01)。
目前，常规的体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)虽然能够使卵母细胞在体外环境下完成减数分裂，但很难使核质同步成熟，得到的卵母细胞质量远不如体内成熟的卵母细胞，核质同步成熟成为亟待解决的问题。为了更好的模拟体内环境，研究者开发了更为科学的卵母细胞体外两步成熟培养方法，即首先将卵母细胞在含有一定量减数分裂抑制剂的培养液中培养一段时间，然后再移入体外成熟液进行正常成熟培养，这种方法能够延长细胞质成熟的时间，促进卵母细胞积累丰富的母源mRNA和蛋白质，尽可能达到核质同步成熟。
2012年胡媛媛采用两步成熟培养方法对绵羊的卵母细胞进行成熟，利用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和毛喉素(FSK)两种核成熟抑制剂组合对卵母细胞进行预成熟2h(第一步成熟),然后转移至含有5μmol/L的Cilostamide成熟液中继续体外成熟28h(第二步成熟)，研究结果表明:第一步成熟中的抑制剂组合适宜浓度为100μmol/L IBMX+100μmol/L FSK或100μmol/L IBMX+50μmol/L FSK,囊胚发育率分别达到(51.6％和49.8％),均显著高于对照组(33.1％)(P<0.05)(胡媛媛.两步体外成熟法对绵羊卵母细胞发育能力的影响[D].河北：河北农业大学，2012)。即便如此，这样的实验结果也并不理想。究其原因，这些报道中所采用的减数分裂抑制剂均是化学抑制剂(如，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和毛喉素(FSK))，虽然在卵母细胞成熟过程可以有效抑制减数分裂，但其在某种程度上对卵母细胞具有毒害作用，不利于胚胎的后期发育。
发明内容
本发明针对上述现有技术的缺陷和不足，基于绵羊小卵泡液(SMALL FOLLICULAR FLUID,SFF)抑制减数分裂的原理，提供了一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液。同时，基于该预处理液，本发明还提供了改进的绵羊卵母细胞体外成熟方法：即使用所述的预处理液对需要体外培养的绵羊卵母细胞进行预处理，然后再进行常规的体外成熟培养。本发明提供的预处理液和体外成熟方法在显著提高了绵羊卵母细胞的体外成熟效率和后期发育能力。
本发明的技术方案如下：
用于绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液，其特征在于：在绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液中添加有绵羊小卵泡液。
所述的预处理液，其特征在于：所述绵羊小卵泡液的终浓度为10％(v/v)。
所述的预处理液，其特征在于：所述绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液为含终浓度3mg/ml BSA的TCM199培养液。
一种绵羊卵母细胞体外成熟方法，其特征在于包括如下步骤：
1)从绵羊离体卵巢中采集绵羊卵母细胞；
2)将所述绵羊卵母细胞放入所述的预处理液中进行预处理；
3)将预处理后的绵羊卵母细胞转移至体外成熟培养液中进行体外成熟培养。
所述的方法，其特征在于：所述体外成熟培养液的配方为：TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml E2+10％(v/v)的FBS。
所述的方法，其特征在于：所述绵羊卵母细胞指A级卵丘卵母细胞复合体和/或B级卵丘卵母细胞复合体；所述A级卵丘卵母细胞复合体表现为胞质均匀、多层卵丘颗粒细胞包裹；B级卵丘卵母细胞复合体表现为胞质均匀、少于3层卵丘颗粒细胞包裹或部分裸露。
所述的方法，其特征在于：所述的预处理的步骤如下：将A、B级COCs用所述预处理液清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的所述预处理液中培养4h；培养条件为：含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
所述的方法，其特征在于：所述体外成熟培养的步骤如下：将预处理后的COCs转移到预先在CO2培养箱中平衡2h以上的所述外成熟培养液液中培养26h；培养条件为：含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
所述的预处理液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从绵羊离体卵巢上1-3mm的卵泡中抽取卵泡液；
2)将抽取的卵泡液在14000rpm下离心10min，抽取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤；
3)所得滤液SFF与绵羊卵母细胞体外成熟预处理的常规培养液成分配制得到所述预处理液。
用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒，其特征在于：包含所述的预处理液。
所述的试剂盒，其特征在于：还包括体外成熟培养液，所述体外成熟培养液的配方如下：TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml的E2+10％(v/v)的FBS。
本发明基于绵羊小卵泡液抑制减数分裂的原理，提供了一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液。同时，基于该预处理液，本发明人还提供了改进的绵羊卵母细胞体外成熟方法，即使用所述的预处理液对需要体外培养的绵羊卵母细胞进行预处理，然后再进行常规的体外成熟培养。实验证明，本发明提供的预处理液和体外成熟方法显著提高了绵羊卵母细胞的体外成熟效率和后期发育能力。
本发明提供的一种用于绵羊体外成熟的预处理液(Pre-IVM液)。是在细胞体外培养常规的培养液成分的基础上添加了绵羊小卵泡的SFF。在本发明的一个实施例中，所述预处理液为包含10％(v/v)SFF(体积比)和终浓度3mg/ml BSA的TCM199培养液。
本发明还提供了一种绵羊卵母细胞体外成熟的新方法。本发明人利用所述的预处理液(Pre-IVM液)对可用于体外成熟的绵羊卵母细胞进行预处理，然后再进行体外成熟培养。
在本发明的一些优选实施例中，所述可用于体外成熟的绵羊卵母细胞为A级(胞质均匀、多层卵丘颗粒细胞包裹)和B级(胞质均匀、少于3层卵丘颗粒细胞包裹或部分裸露)卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)。
本发明的一些实施例中，所述预处理的步骤具体为将包括A、B级卵丘卵母细胞的卵丘卵母细胞复合体COCs用所述Pre-IVM液清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的所述Pre-IVM液中培养4h；培养条件为：含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。所述体外成熟培养具体为将预处理后的COCs转移到预先在CO2培养箱中平衡2h以上的IVM液中培养26h；培养条件为：含5％CO2的空气，温度38.6℃，包和湿度；所述IVM液为包含终浓度10ug/ml的FSH、终浓度1ug/ml的LH、终浓度1ug/ml的E2以及10％(v/v)的FBS的TCM199培养液。
本发明中，所述预处理液由于含有能抑制减数分裂的SFF，能延长细胞质成熟的时间，促进卵母细胞积累丰富的母源mRNA和蛋白质，在一定程度上使得核质同步成熟，从而提高体外成熟的卵母细胞的质量。
经体外受精、体外培养实验，实验结果数据表明，结果证实，与常规的体外成熟方法相比，经本发明的预处理液处理过并使用本发明的方法体外成熟培养的卵母细胞受精后卵裂率和囊胚率显著提高。
综上，本发明利用绵羊小卵泡液有效抑制绵羊卵母细胞减数分裂，提供了一种包含天然的、生理性的减数分裂抑制物质——小卵泡液SFF的绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液，同时建立了一种有效的绵羊卵母细胞体外成熟培养方法。通过小卵泡液预处理后促进了绵羊卵母细胞成熟，提高了绵羊卵母细胞的体外发育能力。本发明提供的预处理液及相关培养方法能够成为一种新型有效的绵羊卵母细胞体外成熟培养体系，并在畜牧业胚胎工程生产上具有良好的应用前景。
根据市场需求，基于本发明提供的预处理液及绵羊卵母细胞体外成熟方法，提供了一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒，其核心试剂是上述预处理液。为完善该试剂盒的便捷度，本发明的一些实施例中，还包括本发明提供的具体的体外成熟培养液，配方为TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml的E2+10％(v/v)的FBS。
附图说明
图1是采用本发明所述的Pre-IVM液对绵羊卵母细胞进行体外成熟的方法示意图
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
主要仪器设备
CO2培养箱、恒温台、体视显微镜、超净台。
主要试剂
FSH(Follicle stimulating hormone，促卵泡激素)、LH(Luteinizing hormone，黄体生成素)、E2(Estradiol，雌二醇)、FBS(Fetal bovine serum，胎牛血清)、TCM199(Sigma)、BAS(bovine serum albumin，牛血清蛋白)、SOF培养液(配方见表1)，所有试剂均为Sigma公司产品。
主要生物材料
绵羊的离体卵巢：收集于屠宰场。
实施例1预处理液的制备
步骤1.从绵羊的离体卵巢上1-3mm的卵泡中抽取卵泡液；
步骤2.将抽取的卵泡液在14000rpm下离心10min，抽取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤；
步骤3.所得滤液即SFF，将其按终浓度10％(v/v)加入至含有终浓度为3mg/ml BAS的TCM199中，配制得到所述Pre-IVM液。
实施例2绵羊卵母细胞体外成熟
步骤1.卵母细胞采集：使用10ml注射器从绵羊的离体卵巢表面抽取直径4-6mm卵泡。将抽取的卵母细胞放入100mm直径的培养皿中，在体视显微镜下挑选出A级(胞质均匀、多层卵丘颗粒细胞包裹)和B级(胞质均匀、少于3层卵丘颗粒细胞包裹或部分裸露)卵丘卵母细胞复合体(COCs)用于体外成熟培养。
步骤2.卵母细胞预处理：将挑选出的A、B级COCs用Pre-IVM液清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的Pre-IVM液中培养，培养条件为含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度，培养时间为4h。
步骤3.卵母细胞成熟培养：IVM液(TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml E2+10％FBS)在CO2培养箱中平衡2h以上，经上一步处理后的绵羊卵母细胞移到IVM液中继续进行体外成熟培养，培养时间为26h，培养条件为含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。体外成熟的方法流程示意图详见图1。
实施例3绵羊卵母细胞成熟率验证
实验方法：
1.成熟的绵羊卵母细胞的培养
分别使用常规方法和本发明提供的方法制备两类体外成熟的绵羊卵母细胞。
I类成熟的卵母细胞的制备方法为常规成熟法，步骤如下：
1)同实施例2步骤1
2)IVM液(TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml E2+10％FBS)CO2培养箱中平衡2h以上，中进行体外成熟培养，将上一步采集的COCs置于IVM液在培养时间为24h，培养条件为含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
II类成熟的卵母细胞的制备方法为同实施例2的步骤1～3。
2.体外受精
受精液：SOF+2％发情羊血清。用38-40℃水温预热园底的试管，放入冻精到试管中干解冻，另两个园底的试管中各加入受精液0.5毫升，在CO2培养箱中预热，把解冻的精液等分轻轻加入这两个离心管底部，放入培养箱中浮育40分钟，然后吸取上部精液，移入1.5ml的离心管中，离心，弃上清，再加入1毫升受精液离心洗涤，弃大部分上清，留大约150ul后将精液沉淀轻轻吹打混匀，根据精子浓度将适量精子加入50μL受精液中。
在孵育精子的同时，将步骤1得到的I类成熟的卵母细胞和II类成熟的卵母细胞分别在0.05％的透明质酸酶液中反复吹打冲洗一次，除去部分卵丘细胞，保留2-3层卵丘细胞。用受精液将卵母细胞洗涤2次，然后将15-20个成熟卵母细胞放入50μl的受精液。
表1 SOF培养液的组成成分
| 药品 | 浓度 |
| NaCL | 107.63mM |
| KCL | 7.16mM |
| KH2PO4 | 1.19mM |
| MgSO4 | 1.51mM |
| CaCL2.2H2O | 1.78mM |
| NaHCO3 | 25.00mM |
| 乳酸钠 | 5.35mM |
| 丙酮酸钠 | 7.27mM |
| 谷氨酰胺 | 0.20mM |
| 必需氨基酸 | 20.0μL/mL |
| 非必需氨基酸 | 10.0μL/mL |
| 柠檬酸钠 | 0.34mM |
| 肌醇 | 2.77mM |
3.体外培养
24小时后将受精卵移入胚胎培养液中，培养液为SOF-BSA，将50枚受精卵移入500μl培养液的四孔培养板中，培养条件为5％CO2，5％O2，90％N2，温度为38.6℃。受精后48小时和144小时分别检查卵裂率和囊胚率。
结果分析：
实验结果详见表2，用常规成熟法体外成熟的绵羊卵母细胞(I类成熟的卵母细胞)经体外受精后获得的受精卵的卵裂率为81.7％，囊胚率为29.2％，囊胚平均细胞数为86.3±19；而经本发明的Pre-IVM液处理后并体外成熟的绵羊卵母细胞(II类成熟的卵母细胞)经体外受精后获得的受精卵的卵裂率为95.1％，囊胚率为47.4％，囊胚平均细胞数为116.2±11。
表2两类成熟的绵羊卵母细胞的体外受精获得的受精卵的培养结果统计对比
表中同列数据不同上标表示差异显著(P<0.05)
大量的实验数据证明，采用本发明的Pre-IVM液处理过的并经本发明的方法所培养的绵羊卵母细胞，其成熟效率和后期的发育能力得到较大的提高，卵母细胞成熟受精后的卵裂率和囊胚率都明显高于常规成熟方法的(表2)，使用本发明的成熟方法成熟培养的卵母细胞，其受精后所形成的囊胚的细胞数也明显增加，显示囊胚的质量较好，因此证实了本发明的Pre-IVM液及其相关体外成熟方法可以更好的促进绵羊卵母细胞体外成熟。
Claims (11)
1.用于绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液，其特征在于：在绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液中添加有绵羊小卵泡液。
2.根据权利要求1所述的预处理液，其特征在于：所述绵羊小卵泡液的终浓度为10％(v/v)。
3.根据权利要求1所述的预处理液，其特征在于：所述绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液为含终浓度3mg/ml BSA的TCM199培养液。
4.一种绵羊卵母细胞体外成熟方法，其特征在于包括如下步骤：
1)从绵羊离体卵巢中采集绵羊卵母细胞；
2)将所述绵羊卵母细胞放入权利要求1～3任一所述的预处理液中进行预处理；
3)将预处理后的绵羊卵母细胞转移至体外成熟培养液中进行体外成熟培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述体外成熟培养液的配方为：TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml E2+10％(v/v)的FBS。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述绵羊卵母细胞指A级卵丘卵母细胞复合体和/或B级卵丘卵母细胞复合体；所述A级卵丘卵母细胞复合体表现为胞质均匀、多层卵丘颗粒细胞包裹；B级卵丘卵母细胞复合体表现为胞质均匀、少于3层卵丘颗粒细胞包裹或部分裸露。
7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述的预处理的步骤如下：将A、B级COCs用所述预处理液清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的所述预处理液中培养4h；培养条件为：含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
8.根据权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于：所述体外成熟培养的步骤如下：将预处理后的COCs转移到预先在CO2培养箱中平衡2h以上的所述外成熟培养液液中培养26h；培养条件为：含5％CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
9.权利要求1所述的预处理液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从绵羊离体卵巢上1-3mm的卵泡中抽取卵泡液；
2)将抽取的卵泡液在14000rpm下离心10min，抽取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤；
3)所得滤液SFF与绵羊卵母细胞体外成熟预处理的常规培养液成分配制得到所述预处理液。
10.用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～3任一所述的预处理液。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：还包括体外成熟培养液，所述体外成熟培养液的配方如下：TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml的E2+10％(v/v)的FBS。
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