CN105838668A - 小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养，具体公开了一种小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液，其含有100nM的E2和100ng/mL的CNP/BNP。本发明还提供了所述体外成熟培养液在促进小卵泡卵母细胞体外成熟或抑制小卵泡卵母细胞减数分裂中的应用及一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，具体为：采集动物的卵母细胞，按卵泡直径大小分类：将小卵泡卵母细胞置于前述的体外成熟培养液中进行前成熟培养，培养时间为20h，然后在成熟液内培养46±2h；将大卵泡卵母细胞直接在成熟液中培养46±2h。本发明采用两段体外成熟培养方法，应用CNP/BNP和E2前成熟处理小卵泡卵母细胞，促进核成熟和胞质成熟同步，提高了体外发育能力，能够成为新型的减数分裂抑制药物在畜牧业成产上推广应用。

Description

小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养，具体地说，涉及小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液。

背景技术

在家畜繁殖上，广泛采用非刺激卵巢来源卵母细胞体外成熟后产生动物胚胎，因此体外卵母细胞成熟是一个重要的平台技术用于育种，克隆及转基因动物生产。

目前，优质种公畜数量少，繁育速度慢，生产性能落后是制约我国畜牧业发展的关键因素。体外受精胚胎的细胞数量，明显低于体内胚胎，这反映了卵母细胞体外培养体系还不理想。体外受精胚胎质量是影响胚胎移植妊娠率和移植后后代成活率的重要因素。

近年来关于卵母细胞成熟的培养(IVM)方面取得了较大进展。专利CN102140435A，CN101591637A，CN100432219C，CN102899286A公开了提高卵母细胞体外成熟的方法或新的培养液。要么是于促进减数分裂的恢复，促进卵母细胞体外生长成熟。要么是于阻滞卵母细胞减数分裂，提高卵母细胞的体外发育能力，模拟体内环境开发了卵母细胞体外两段成熟的培养方法，既通过体外使用减数分裂抑制剂暂时可逆的阻滞卵母细胞减数分裂的恢复，同时促进卵母细胞生长发育，增强细胞质的成熟，然后移出减数分裂的抑制环境，进行体外成熟。这种方法的目的延长颗粒细胞与卵母细胞通过间隙连接进行物质和信息交流的时间，促进卵母细胞积累丰富的mRNA和蛋白质。

但在模拟体内环境开发了卵母细胞体外两段成熟的培养方法中，其研究结果显示通过减数分裂抑制剂并没有提高卵母细胞体外发育能力，甚至产生了不利的影响。其中专利CN102899286A利用CNP阻滞卵母细胞减数分裂，从而促进卵母细胞的体外成熟。但是在Federica Franciosi等对CNP对卵母细胞体外成熟的效果有不同的描述(Federica Franciosi，Giovanni Coticchio，Valentina Lodde，IreneTessaro，Silvia C..Natriuretic peptide precursor C delays meioticresumption and sustains gap Junction-mediated communication in bovinecumulus-enclosed oocytes.Biol Reprod 2014；91:61，1-9.)，且根据本申请申请人实验室的最新研究发现：1、生理情况下，钠肽系统的BNP/NPR2和CNP/NPR2抑制猪卵母细胞成熟；2、FSH(卵泡刺激素)和E2(雌二醇)通过维持BNP/NPR2和CNP/NPR2的高表达从而阻滞卵母细胞减数分裂。E2受体对BNP、CNP阻滞卵母细胞减数分裂有促进作用，并且能延长BNP，CNP对阻滞卵母细胞减数分裂抑制时间(Zhang，W.，Yang，Y.，Liu，W.，Chen，Q.，Wang，H.，Wang，X.，Zhang，Y.，Zhang，M.，Xia，G.Brain natriuretic peptideand C-type natriureticpeptide maintain porcine oocyte meiotic arrest.J.Cell.Physiol.2015；230:71-81)。

但是，卵母细胞来源于直径大小不同的卵泡，来源小卵泡卵母细胞在细胞质尚未未完全成熟，而来源于大卵泡卵母细胞的胞质却已经成熟，二者处于不同的状态。小卵泡卵母细胞体外培养后体外受精的卵裂比率和囊胚率仍处于显著较低的水平。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液，其含有80～120nM的E2和100～150ng/mL的CNP和/或BNP。

所述E2为雌二醇，所述CNP为C型钠肽，所述BNP为B型脑钠肽。

作为优选，所述体外成熟培养液含有：CNP和/或BNP 100ng/mL，FSH(卵泡刺激素)0.05IU/mL，E2 100nM。

进一步地，所述体外成熟培养液还含有：BSA(牛血清白蛋白)4mg/mL，半胱氨酸0.1mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL。

具体而言，优选所述体外成熟培养液为含有CNP和/或BNP100ng/mL，FSH 0.05IU/mL，E2 100nM，BSA 4mg/mL，半胱氨酸0.1mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL的TCM199培养液。

需要说明的是，“CNP和/或BNP”意为：CNP和BNP同时使用，或择其一单独使用。“100～150ng/mL的CNP和/或BNP”意为：无论CNP和BNP同时使用还是单独使用，其总浓度为100～150ng/mL。

第二方面，基于本发明的试验发现，本发明提供了前述体外成熟培养液在促进小卵泡卵母细胞体外成熟或抑制小卵泡卵母细胞减数分裂中的应用。

进一步地，本发明还提供了含有E2与CNP和/或BNP的组合物在制备用于促进小卵泡卵母细胞体外成熟药物/抑制小卵泡卵母细胞减数分裂药物中的应用。

第三方面，本发明提供一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，具体为：采集动物的卵母细胞，按卵泡直径大小分类，将小卵泡卵母细胞(卵丘-卵母细胞复合体)置于前述的体外成熟培养液中进行前成熟培养。

经过前成熟培养的小卵泡卵母细胞，能够让尚未成熟的小卵泡卵母细胞胞质成熟有更充分的时间，利于小卵母细胞达到细胞核成熟和细胞质成熟的充分同步成熟。小卵泡卵母细胞是属于胞质还未发育成熟的卵母细胞。

进一步地，所述方法具体为：采集动物的卵母细胞，按卵泡直径大小分类：将小卵泡卵母细胞(卵丘-卵母细胞复合体)置于前述的体外成熟培养液中进行前成熟培养，培养时间为20～25h，然后在成熟液内培养46±2h；将大卵泡卵母细胞(卵丘-卵母细胞复合体)直接在成熟液中培养46±2h。

其中，所述成熟液为本领域常规使用的成熟液。

作为优选，本发明所述成熟液含有0.05IU/mL FSH，0.05IU/mLLH，10ng/mL EGF，4mg/mL BSA，10％(体积分数)卵泡液，0.1mg/mL半胱氨酸，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素的TCM199培养液。

所述动物包括牛、猪、羊、鼠等。

成熟后的卵母细胞可用于孤雌激活，或进行体外受精，然后进行胚胎培养或生产。

更为具体地，当所述动物为猪时，所述方法具体包括如下步骤：

1)对不同直径的卵泡分类采集；

2)将卵泡直径小于4mm的小卵泡卵母细胞在前述体外成熟培养液中培养；

3)将卵泡直径大于4mm的大卵泡卵母细胞和步骤2)处理后的小卵泡卵母细胞在前述成熟液中培养。具体而言，所述成熟液中的卵泡液使用PFF(猪卵泡液)。

本发明的有益效果在于：

本发明首次采用针对卵泡直径大小的卵母细胞进行分类培养，提高了小卵泡卵母细胞成熟比率，从而充分利用屠宰场卵母细胞资源，加速良种选育以及扩繁技术体系，大幅提高良种率和技术水平。

本发明采用两段体外成熟培养方法，应用CNP/BNP和E2前成熟处理小卵泡卵母细胞，促进核成熟和胞质成熟同步，提高了体外发育能力，能够成为新型的减数分裂抑制药物在畜牧业成产上推广应用。

本发明所涉及的CNP，BNP和E2都为卵泡内活性肽类物质，对卵母细胞的毒害作用小。

附图说明

图1为本发明实施例5中BNP和CNP不同组合对抑制的猪卵母细胞成熟的影响。

图2为本发明实验例1中不同大小卵泡与卵母细胞发展潜力的关系。

图3为本发明实验例1中不同直径大小的猪卵泡中的BNP和CNP的平均浓度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液

1、原料：

TCM-199，BSA，FSH，E2，BNP和/或CNP，半胱氨酸(Cys)，青霉素，链霉素。

2、制备方法：

将BSA、FSH、E2、BNP/CNP、半胱氨酸、青霉素、链霉素溶于TCM-199中，制备得到含有4mg/mL BSA，0.05IU/mL FSH，100nM E2，100ng/mL BNP，0.1mg/mL半胱氨酸(Cys)，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。

实施例2小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液

本实施例与实施例1的区别在于：将BNP替换为CNP。

实施例3小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液

本实施例与实施例1的区别在于：E2的浓度为120nM，BNP的浓度为150ng/mL。

实施例4小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液

本实施例与实施例2的区别在于：E2的浓度为80nM，BNP的浓度为120ng/mL。

实施例5小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液

本实施例与实施例1的区别在于：将BNP替换为BNP和CNP的等比例混合物。且对BNP和CNP不同组合对抑制的猪卵母细胞成熟的影响的实验，数据统计如图1所示，由图1可知，BNP和CNP不同浓的组合对抑制的猪卵母细胞成熟的影响是相似的。

实验例1

本实验例用于说明本发明所述小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液对小卵泡卵母细胞体外成熟的作用及影响。

具体步骤如下：

1、从北京市第五肉联厂取卵巢，置于含Ca²⁺、Mg²⁺、青霉素60mg/L和链霉素100mg/L的35～38℃生理盐水中，在2h之内运回实验室。用等温的上述生理盐水冲洗2-3遍之后放在38.5℃的水浴锅中备用。猪卵巢：购自第五肉联厂。猪精液：购自北京养猪育种中心。

2、猪卵母细胞的采集和分类：

用配有16号针头的20mL注射器分别抽取卵巢上小卵泡(<4mm的卵泡)和大卵泡(>4mm的卵泡)，进行了不同大小卵泡与卵母细胞发展潜力的关系的实验，数据统计如图2所示，由图2可知发明内容所述小4mm的卵泡的卵细胞比大于4mm卵泡的卵细胞的发育潜力(体外成熟培养后体外受精的卵母细胞的卵裂率和囊赔率)要显著地低。将抽取液放于55mm的塑料培养皿中，在体式显微镜下，有巴氏管挑选卵丘包裹2层以上，致密，而且胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte-complexes，COCs)，用于体外成熟培养。

3、猪卵母细胞的体外成熟培养：

分别将采集到的COCs用洗卵液洗3-4遍，然后在成熟液中清洗1-2遍，放于在培养箱中至少平衡4h的培养液滴内(每50μL液滴放15枚)，每一直径35mm的塑料培养皿中做7个液滴，用胚胎级矿物油覆盖。大卵泡卵母细胞常规成熟培养基培养46±2h，小卵泡卵母细先用含有CNP 100ng/mL或BNP100ng/mL，依据分类的直径大小猪卵泡的BNP和CNP的平均浓度实验，数据统计如图3所示，由图3可知，BNP和CNP的平均浓度在卵泡直径从3mm生长到6mm一直维持很高浓度，这说明维持一定BNP和CNP的平均浓度对卵母细胞的细胞质成熟有一定的作用。

FSH 0.05units/mL，E2 100nM，培养液内前成熟培养培养时间为20h，然后在成熟液内成熟46±2h。培养条件为38.5℃、5％的CO₂空气和100％湿度。

4、卵母细胞的收集与成熟培养：

猪卵丘-卵母细胞复合物：将采集到的COCs用洗卵液洗3-4遍(洗卵液的配制:先用100mL双蒸水加热搅拌溶解0.5gPVA，待PVA完全溶液冷却至室温后依次加入4.775g DPBS粉末、青霉素0.0325g、链霉素0.025g，双蒸水定溶至500mL。0.22μm滤器过滤灭菌，50mL分装，用于冲洗COCs和配制脱卵丘液)，然后在成熟液中清洗1-2遍，分别放于在培养箱中至少平衡4h的添加0ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、500ng/mL VEGF(血管内皮生长因子)的成熟培养液滴内(每50μL液滴放15枚)，每一直径35mm的塑料培养皿中做7个液滴，用胚胎级矿物油覆盖。

5、猪卵母细胞的孤雌激活：

成熟培养液中培养46h±2h并且已经脱去卵丘细胞后，选择卵周隙明显，卵细胞膜完整，且排出第一极体的卵母细胞，先用38.5℃预温的激活液洗涤3遍，并在其中平衡5min，将平衡好的卵母细胞转移到已经铺满激活液的融合槽中，融合槽电极宽度1mm，电融合仪参数为1个DC，1.5kv/cm，100μs进行电刺激，之后将卵母细胞用pzm-3+10μg/mL CHX+10μL/mL CB洗涤5遍，洗涤后将卵母细胞转移到石蜡油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h的pzm-3+10μg/mLCHX+10μL/mLCB液滴内培养4～6h。培养条件为38.5℃、5％的CO₂空气和100％湿度。

6、猪卵母细胞孤雌激活后胚胎的培养

将激活处理的卵母细胞取出，在PZM-3中洗涤3遍，转入石蜡油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h的PZM-3液滴内培养，液滴大小为50μL，每个液滴中放8-10枚卵。培养48h和168h观察记录卵裂率和囊胚形成率。

同列不同字母表示差异显著(P<0.01)；卵裂率＝卵裂数/卵母细胞数，囊赔率＝囊胚数/卵裂数

7、猪卵母细胞的体外受精

将鲜精用含抗生素的PBS，400×g，5min离心，洗涤3遍。体外受精液重悬(体外受精液的配制方法：取100mL超纯水，加入0.6611gNaCl、0.0224gKCl、0.1102g CaCl₂·2H₂0、0.2324g Tris、0.1982gD-Glucose、0.0550g Sodium Pyruvate。充分混合均匀后用0.22μm滤器过滤，放于4℃保存。用时向其中加入0.4gmL BSA和0.00971g的咖啡因作为体外受精液)，使精子密度为4×10⁸个/mL，在38.5℃、5％的CO₂空气和100％湿度条件下孵育90min。将体外成熟培养46h±2h并且已经脱去卵丘细胞后，选择卵周隙明显，卵细胞膜完整，且排出第一极体的卵母细胞，先用38.5℃预温的mTMB中洗涤3遍，洗涤后将卵母细胞转移到石蜡油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少48h的mTMB液滴内培养30min。之后将上述处理的精子转移到卵母细胞所在的受精滴中，使mTBM液滴内精子密度为1.5～5×10⁵个/mL，共培养4-6h。

8、猪卵母细胞体外受精后胚胎的培养

将体外受精处理的卵母细胞取出，在PZM-3(同前述成熟液)中洗涤3遍，转入石蜡油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h的PZM-3液滴内培养，液滴大小为50μL，每个液滴中放8-10枚卵。培养48h和168h观察记录卵裂率和囊胚形成率。

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.01)；卵裂率＝卵裂数/卵母细胞数，囊赔率＝囊胚数/卵裂数

实验结果表明E2+BNP/CNP前成熟处理(20h)后进行体外成熟培养，其孤雌激活和体外受精后的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组(P<0.01)。

结论：有以上结果可知E2+BNP/CNP，能抑制小卵泡卵母细胞减数分裂，促进小卵泡卵母细胞体外成熟，提高小卵泡卵母细胞受精后卵裂率和囊胚发育率(2-3倍的提高)，提高胚胎质量，在卵母细胞体外发育能力方面具有潜在的利用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液，其特征在于，其含有80～120nM的E2和100～150ng/mL的CNP和/或BNP。

2.根据权利要求1所述的体外成熟培养液，其特征在于，其含有：CNP和/或BNP 100ng/mL，FSH 0.05IU/mL，E2 100nM。

3.根据权利要求2所述的体外成熟培养液，其特征在于，其含有：BSA 4mg/mL，半胱氨酸0.1mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL。

4.权利要求1～3任一项所述的体外成熟培养液在促进小卵泡卵母细胞体外成熟或抑制小卵泡卵母细胞减数分裂中的应用。

5.含有E2与CNP和/或BNP的组合物在制备用于促进小卵泡卵母细胞体外成熟药物/抑制小卵泡卵母细胞减数分裂药物中的应用。

6.一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，采集动物的卵母细胞，按卵泡直径大小分类，将小卵泡卵母细胞置于含有权利要求1～3任一项所述的体外成熟培养液中进行前成熟培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采集动物的卵母细胞，按卵泡直径大小分类：将小卵泡卵母细胞置于含有权利要求1～3任一项所述的体外成熟培养液中进行前成熟培养，培养时间为20～25h，然后在成熟液内培养46±2h；将大卵泡卵母细胞直接在成熟液中培养46±2h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述成熟液为含有0.05IU/mL FSH，0.05IU/mL LH，10ng/mL EGF，4mg/mL BSA，10％卵泡液，0.1mg/mL半胱氨酸，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素的TCM199培养液。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述动物为猪，所述方法具体包括如下步骤：

1)对不同直径的卵泡分类采集；

2)将卵泡直径小于4mm的小卵泡卵母细胞在权利要求1或2所述的体外成熟培养液中培养；

3)将卵泡直径大于4mm的大卵泡卵母细胞和步骤2)处理后的小卵泡卵母细胞在成熟液中培养。