JP7068681B2 - 生殖細胞追跡用抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、生殖細胞追跡用抗体に関する。また、本発明は、代理親魚技法において、移植した生殖細胞の宿主個体内での前記生殖細胞追跡用抗体を用いた、追跡方法に関する。
近年ヒトをはじめとする動物での生殖技術の発展は大きな注目を浴びている。特に、魚類では、世界規模での食用水産資源消費量の増加および天然水産資源量の減少を解消するために、生殖技術としての種苗生産技術(人工種苗(稚魚)放流を含む)への期待が高まっている。
(1)未分化生殖細胞表面抗原を認識する、生殖細胞追跡用抗体。
(2)直接標識されている、(1)に記載の生殖細胞追跡用抗体。
(3)FITC、フィコエリスリン、AlexaおよびHiLyteからなる群から選択される一種によって直接標識されている、(2)に記載の生殖細胞追跡用抗体。
(4)生殖細胞が魚類の生殖細胞である、(1)~(3)のいずれかに記載の生殖細胞追跡用抗体。
(5)魚類が、サケ科魚類またはサバ科魚類である、(4)に記載の生殖細胞追跡用抗体。
(6)抗体産生ハイブリドーマTA-No.6-28(NITE BP-02222)、TA-No.15-1(NITE BP-02223)、No.95(NITE BP-01937)、No.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも一種の抗体である、(5)に記載の生殖細胞追跡用抗体。
(7)(1)~(6)のいずれかに記載の生殖細胞追跡用抗体を用いて標識した生殖細胞を、宿主に移植し、in vivoで追跡する方法。
(8)宿主個体へ移植する生殖細胞を提供する個体と、宿主個体とが、それぞれ、魚類である、(7)に記載の方法。
(9)魚類が、サケ科魚類またはサバ科魚類である、(8)に記載の方法。
(10)宿主個体へ移植する生殖細胞を提供する個体が、宿主個体とは異種である、(7)~(9)のいずれかに記載の方法。
(11)生殖細胞を移植する宿主個体またはその部位が、透明または半透明である、(7)~(10)に記載のいずれかに記載の方法。
(12)追跡期間が、宿主個体へ生殖細胞を移植した後20日間である、(7)~(11)のいずれかに記載の方法。
(13)追跡を蛍光顕微鏡を用いて行う、(7)~(12)のいずれかに記載の方法。
(14)(1)~(6)のいずれかに記載の生殖細胞追跡用抗体を用いて標識した生殖細胞を宿主に移植し、in vivoで追跡する工程、および該宿主個体の生殖腺で、該抗体の発現が存在するまたは発現が高い宿主個体を選別する工程を含んでなる、宿主個体の生殖腺へ移植した未分化生殖細胞の生着が認められる個体の選別方法。
(15)(1)~(6)のいずれかに記載の生殖細胞追跡用抗体を用いて、移植前の魚類個体の未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程、該分離、濃縮した生殖細胞を、宿主魚類個体の腹腔内へ移植する工程、該宿主魚類個体の生殖腺において、該抗体の発現が存在するあるいは発現が高い宿主魚類個体を選別する工程、選別した魚類個体を成熟させ、宿主魚類個体の生殖腺に生着した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導して、精子または卵を得る工程を含んでなる、魚類の精子または卵の生産方法。
(16)(1)~(6)のいずれか一項に記載の生殖細胞追跡用抗体を用いて、移植前の魚類個体の未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程、該分離、濃縮した生殖細胞を、宿主魚類個体の腹腔内へ移植する工程、該宿主魚類個体の生殖腺において、該抗体の発現が存在するまたは発現が高い宿主魚類個体を選別する工程、選別した魚類個体を成熟させ、宿主魚類個体の生殖腺に生着した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導する工程、得られた精子および卵を交配する工程を含んでなる、魚類個体の生産方法。
未分化生殖細胞表面を認識する抗体産生ハイブリドーマTA-No.15-1(NITE BP-02223)、No.95(NITE BP-01937)、No.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体に対して、No.15-1はプロテインA精製、No.95、No.172、No.189はMGPP精製を行い、その後蛍光色素の直接標識を行った。プロテインA精製はHiTrap Protein A HP Columns(GE healthcare)を用いて、MGPP精製はimmunoAsist MG―PP(Kanto Reagent)を用いて、常法に従いIgGおよびIgMを精製した。直接法により緑色蛍光物質であるALEXA fluor 488(life technology)を抗体に直接標識した。具体的には、0.1M―NaHCO3に、規定量のIgM、IgGを、透析し、そこにDMSOに溶解したAlexa fluor 488を規定量ずつ混和し、室温で1時間撹拌した。次に、P4カラム(GE healthcare)にてゲル濾過し、抗体に結合しなかった溶液中に遊離しているAlexa fluor488を分離することで蛍光物質を直接標識した抗体を得た。
(1)抗体標識
1個体のクロマグロ(2~3歳体重30~40kg、生殖腺重量100~200g程度)から精巣を摘出し、細かく切り刻んだ。細かく刻んだ精巣に、終濃度2mg/mlのコラゲナーゼH(Roche)、終濃度1.65mg/mlのディスパーゼII(合同酒精)/L-15培地(インビトロジェン)(5%ウシ胎児血清(FBS))10mlを添加し、2時間、20℃で、ピペッティングによる物理的な分散を行いながらインキュベートした。L-15培地(インビトロジェン)1mlを添加して酵素反応を停止した。得られた細胞懸濁液(約1000万細胞/ml)を、パーコール(GE Healthcare)密度勾配遠心法に供し、細胞懸濁液中に含まれる精原細胞を粗精製することで、粗精製精原細胞を得た。
ニベ(孵化後13~14日齢)の稚魚(宿主)に対して、それぞれ生殖細胞追跡用抗体、対照抗体およびPKH26で標識した細胞を、約10000細胞/尾となるように、マイクロインジェクション法(Yazawa, R., Takeuchi, Y., Higuchi, K., Yatabe, T., Kabeya, N & Yoshizaki, Goro(2010)Chub mackerel gonads support colonization, survival, and proliferation of intraperitoneally transplanted xenogenic germ cells. Biology of reproduction, 82, 896-904参照)に従って、ニベ宿主の腹腔内に接種した。移植直後の写真を図4に示す。Non-TPは、移植を行っていないニベを示す。図4に示されるように、移植した部位で、No.15-1およびNo.180では、緑色蛍光を確認でき、PKH26では、赤色蛍光を確認できた。No.180およびPKH26の蛍光は、No.15-1より強いものであった。
生着率(%)=宿主の生殖腺で陽性が確認された個体数/生着を確認した移植個体数
(1)蛍光免疫組織染色
ブラウントラウトの精巣(未成熟:1歳齢と排精:2歳齢)を採取し、ブアン固定液を用いて固定し、常法に従って、パラフィン包埋組織切片(厚さ:4μm)を作成した。組織切片に対して、生殖細胞追跡用抗体を用いて蛍光免疫組織染色を行った。生殖細胞追跡用抗体として抗体産生ハイブリドーマNo.95(NITE BP-01937)のモノクローナル抗体を1次抗体として用いた。2次抗体としてgouat anti-mouse IgG IgG alexa 488 conjugated(life thechnology)を用い、常法に従って一次抗体に対して反応させた。また、HE染色も行った。それぞれの結果を、図8(未成熟)および図9(排精)に示す。
ブラウントラウト(1歳齢)の精巣を採取し、0.2%トリプシン(worthington)で処理し、分散した。分散した細胞に対して、生殖細胞追跡用抗体を用いて標識を行った。生殖細胞追跡用抗体として抗体産生ハイブリドーマNo.95(NITE BP-01937)のモノクローナル抗体をALEXA488で直接標識した抗体を用いた。
野生型ニジマス(受精後30日齢)の稚魚(宿主)に、生殖細胞追跡用抗体で標識した標識細胞を約10000細胞/尾となるように、マイクロインジェクション法に従って、宿主の腹腔内に接種した。
例4:サケ科魚類:タイヘイヨウサケ属での生殖細胞の分離濃縮
(1)抗体標識(磁気ビーズ)
vasa遺伝子組み換え魚であるvasa-GFP導入ニジマス(東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションより入手)の精巣(1歳齢)を採取した。vasa-GFPは、東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションで継代されている野生型系統のニジマスにvasa-GFP遺伝子生殖細胞高発現ベクターを導入したニジマスであり、精原細胞が蛍光観察条件において緑色蛍光を発する。精巣を、0.2%トリプシン(worthington)で分散し、細胞懸濁液(精巣分散細胞)を得た。
野生型ニジマス(受精後26~34日齢)(宿主)に、分離濃縮後の精巣分散細胞を、約3000細胞/尾となるように、マイクロインジェクション法に従って、宿主の腹腔内に接種した。対照として、分離濃縮を行っていない精巣分散細胞(未濃縮)を同細胞数、移植した。移植後13~15日目に開腹して、生殖腺に生着した細胞について、蛍光解析を行った。蛍光視野の写真を図13に示す。また、分離濃縮後の精巣分散細胞と、未濃縮の精巣分散細胞との、タイヘイヨウサケ属宿主への生着率と生着した細胞数を、上記例2の方法に従って算出した。結果を図14および15に示す。
(1)免疫組織染色
ニジマスの雄(1歳齢)および雌(1歳齢)(それぞれ東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションより入手)、マスノスケの雄(1歳齢)および雌(1歳齢)(それぞれ、東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションより入手)、ベニザケの雄(1齢)および雌(1齢)(それぞれ東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションより入手)を採取し、ブアン固定液を用いて固定し、常法に従って、パラフィン包埋組織切片(厚さ:4μm)を作成した。組織切片に対して、抗体産生ハイブリドーマNo.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体を1次抗体として、免疫組織染色を行った。2次抗体としてimmPRESS Reagent KIT(フナコシ株式会社)を用い、常法に従い、組織切片をDAB発色させた。また、HE染色も行った。それぞれの結果を図16に示す。
vasa遺伝子組み換え魚であるvasa-DsRed導入ニジマス(東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションより入手)の精巣(1歳齢)と、野生型ニジマス(東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションより入手)の精巣(1齢)とを採取した。vasa-DsRedは、東京海洋大学、水圏フィールド教育センター、大泉ステーションで継代されている野生型系統のニジマスにvasa-DsRed遺伝子生殖細胞高発現ベクターを導入したニジマスであり、精原細胞が蛍光観察条件において赤色蛍光を発する。
野生型ニジマス(受精後35日齢)に、標識したvasa-DsRed導入ニジマス精巣分散細胞および野生型ニジマス精巣分散細胞を、それぞれ約4000細胞/尾となるように、マイクロインジェクション法に従って、宿主の腹腔内に接種した。
Claims (9)
- 未分化生殖細胞表面抗原を認識し、蛍光色素により直接標識されており、
抗体産生ハイブリドーマTA-No.15-1(NITE BP-02223)、No.95(NITE BP-01937)、No.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも一種の抗体である、生殖細胞追跡用抗体を用いて標識した生殖細胞を、宿主に移植し、in vivoで追跡する方法であって、
宿主個体へ移植する生殖細胞を提供する個体が魚類であり、宿主個体が、魚類の稚魚である、方法。 - 魚類が、サケ科魚類またはサバ科魚類である、請求項1に記載の方法。
- 宿主個体へ移植する生殖細胞を提供する個体が、宿主個体とは異種である、請求項1または2に記載の方法。
- 生殖細胞を移植する宿主個体またはその部位が、透明または半透明である、請求項1~3に記載のいずれか一項に記載の方法。
- 追跡期間が、宿主個体へ生殖細胞を移植した後20日間である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 追跡を蛍光顕微鏡を用いて行う、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 未分化生殖細胞表面抗原を認識し、蛍光色素により直接標識されており、
抗体産生ハイブリドーマTA-No.15-1(NITE BP-02223)、No.95(NITE BP-01937)、No.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも一種の抗体である、生殖細胞追跡用抗体を用いて標識した生殖細胞を宿主に移植し、in vivoで追跡する工程、および
該宿主個体の生殖腺が、該抗体により標識された宿主個体を選別する工程
を含んでなり、
宿主個体へ移植する生殖細胞を提供する個体が魚類であり、宿主個体が魚類の稚魚である、宿主個体の生殖腺へ移植した未分化生殖細胞の生着が認められる個体の選別方法。 - 未分化生殖細胞表面抗原を認識し、蛍光色素により直接標識されており、
抗体産生ハイブリドーマTA-No.15-1(NITE BP-02223)、No.95(NITE BP-01937)、No.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも一種の抗体である、生殖細胞追跡用抗体を用いて、移植前のドナー魚類個体の未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程、
該分離、濃縮した生殖細胞を、稚魚である宿主魚類個体の腹腔内へ移植する工程、
該宿主魚類個体の生殖腺が、該抗体により標識された宿主魚類個体を選別する工程、
選別した宿主魚類個体を成熟させ、宿主魚類個体の生殖腺に生着した未分化生殖細胞を
配偶子へ分化誘導して、精子または卵を得る工程
を含んでなる、魚類の精子または卵の生産方法。 - 未分化生殖細胞表面抗原を認識し、蛍光色素により直接標識されており、
抗体産生ハイブリドーマTA-No.15-1(NITE BP-02223)、No.95(NITE BP-01937)、No.172(NITE BP-01938)およびNo.189(NITE BP-01939)により産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも一種の抗体である、生殖細胞追跡用抗体を用いて、移植前のドナー魚類個体の未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程、
該分離、濃縮した生殖細胞を、稚魚である宿主魚類個体の腹腔内へ移植する工程、
該宿主魚類個体の生殖腺が、該抗体により標識された宿主魚類個体を選別する工程、
選別した宿主魚類個体を成熟させ、宿主魚類個体の生殖腺に生着した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導する工程、
得られた精子および卵を交配する工程
を含んでなる、魚類個体の生産方法。
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