JP6897952B2 - 濃縮された生着能をもつ未分化生殖細胞を用いた生殖細胞系列への分化誘導方法 - Google Patents
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Description
Sciences of the U. S. A. ”:PNAS, 103(8), 2725-2729, 2006. ;“Development”, 137(8), 1227-1230, 2010.)、代理親魚技術における移植用未分化生殖細胞の多量確保の可能性が示唆された。しかしながら、精巣や、卵巣から分離される生殖細胞には、体細胞や、分化生殖細胞が混在し、該細胞から移植生着能を有する未分化生殖細胞を有効に分離し、濃縮することが、代理親魚技術における実用化に向けての移植効率の確保に重要な課題となっている。
精原細胞特異的な細胞表面抗原に対する抗体を作製するために、単離直後の生きた精原細胞を抗原として用いてモノクローナル抗体の作製を行った。具体的には、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入ニジマスからGFPを指標にフローサイトメーターで単離した精原細胞をマウスに免疫した。免疫は、4尾のマウス(Balb/c系統)に5回ずつおこなった。また、一回の免疫に用いた細胞数は、1尾あたり5×105細胞で、免疫前にアジュバントとPBSのエマルジョンの免疫を行った。
融合細胞(ハイブリドーマ)を播種した96wellプレート6枚において、すべてのwell(576well)でコロニーの形成が認められた。そこで、これらのハイブリドーマが精原細胞を認識する抗体を産生しているか否かを明らかにするために、Cell ELISAによりスクリーニングを行った。生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入ニジマスからGFPを指標にフローサイトメーターで単離した精原細胞をプレートに播種した。このプレートを用いて、ハイブリドーマが産生する抗体が、精原細胞を標識するか否かを化学発色法で解析した。Cell ELISAで得られたシグナル値を、図2に示す。
一次スクリーニングで陽性シグナルが得られた198個(図2)について、精原細胞を蛍光標識することができるか否か明らかにするために、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングを行った。生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入ニジマスの未成熟精巣(体細胞と未分化精原細胞のみからなる)をトリプシンで分散したのち、上記の198個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その後、蛍光顕微鏡下で観察し、GFP陽性の未分化精原細胞が抗体で標識されているか否かを解析した。二次スクリーニングにおける蛍光顕微鏡下で観察した結果を、図3に示す。
二次スクリーニングで陽性シグナルが得られた60個(図3)について、精原細胞を特異的に蛍光標識することができるか否か明らかにするために、フローサイトメーターを用いてスクリーニングを行った。生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入ニジマスの未成熟精巣(体細胞と未分化精原細胞のみからなる精巣)をトリプシンで分散したのち、上記の60個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その後、フローサイトメーターを用いて、GFP陽性の未分化精原細胞が特異的に抗体で標識されているか否かを解析した。また、先願の特許(特許第5408802号)に対する有用性を示すため、現在得られているCD205遺伝子に対する抗体を用いて同様の解析も行った。三次スクリーニングでGFP陽性の未分化精原細胞で優先的にシグナルが得られた11個及びCD205遺伝子に対する抗体を用いて行ったフローサイトメーター解析の結果を、図4に示す。
三次スクリーニングで得られた11個(図4)について、分化生殖細胞(精母細胞、精細胞、精子)を含む精巣においても精原細胞を特異的に蛍光標識することが出来るか否か明らかにするために、フローサイトメーターを用いてスクリーニングを行った。vasa-GFP蛍光は精巣において分化が進むにつれ弱くなることが知られている(Yano et al., 2008)。そこで、vasa-GFP遺伝子導入ニジマスの分化精巣(体細胞と未分化精原細胞、分化生殖細胞からなる精巣)をトリプシンで分散したのち、上記の11個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その後、フローサイトメーターを用いて、GFP強陽性の未分化精原細胞が特異的に抗体で標識されているか否かを解析した。四次スクリーニングでGFP強陽性の未分化精原細胞で優先的にシグナルが得られた2個の結果を、図5に示す。
四次スクリーニングでGFP強陽性の未分化精原細胞で優先的にシグナルが得られた2個の抗体について、ニジマスの精原細胞を分取できるか否かを明らかにするために、セルソーターを用いて抗体で標識された細胞を単離後、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。ニジマス精巣細胞を分散したのち、上記の2個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、セルソーターを用いて抗体で標識された細胞を単離し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。その結果、図6に示すように、未分化精原細胞の特徴であるvasa-GFP強陽性かつ大型の細胞が濃縮されたことが明らかになった。
四次スクリーニングでvasa-GFP強陽性の細胞を優先的に標識することができた2種類の抗体を用いることで、生着能を有した未分化生殖細胞を濃縮することができるか否か明らかにするために移植実験を行った。移植法は、Okutsu et al., 2006 に示した方法に従い、1個体あたり約1000細胞ずつ移植を行った。また、対象区として、濃縮前の細胞を用いた。精原細胞が生着した個体の割合、及び生着率を、図7に示す。
本スクリーニングで得られた抗体が、他の魚種においても未分化生殖細胞を特異的に標識することが出来るか否かを明らかにするために、ゼブラフィッシュ及び有用海産魚であるクロマグロを用いてスクリーニングを行った。
ゼブラフィッシュは、生殖細胞特異的にGFPを発するvasa-GFP遺伝子導入系統が確立されており、その発現がニジマス同様、分化が進むにつれ弱くなることが知られている。そこで、vasa-GFP遺伝子導入ゼブラフィッシュの精巣をトリプシンで分散したのち、実施例1の四次スクリーニングでニジマスにおいてvasa-GFP強陽性の細胞を優先的に標識することができた2個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その後、フローサイトメーターを用いて、GFP強陽性の未分化精原細胞が特異的に抗体で標識されているか否かを解析した。その結果、ゼブラフィッシュにおいても、GFP強陽性の未分化精原細胞で優先的にシグナルが得られた結果を、図8に示す。
実施例1の三次スクリーニングで陽性シグナルが得られた11個について、クロマグロの精原細胞を特異的に蛍光標識することができるか否かを明らかにするために、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングを行った。クロマグロ精巣細胞を分散したのち、上記の11個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その後、蛍光顕微鏡下で観察し、精原細胞の形態的特徴を有する細胞が抗体で標識されているか否かを解析した。その結果、162、172および189の3個の抗体が精原細胞を優先的に標識することが明らかになった。
三次スクリーニングで陽性シグナルが得られた11個について、卵巣においても生殖細胞を特異的に標識することができるか否かを明らかにするために、フローサイトメーターを用いてスクリーニングを行った。生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入ニジマスの卵巣をトリプシンで分散したのち、上記の11個の抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その後、フローサイトメーターを用いて、分散卵巣細胞中に含まれる、わずかなGFP陽性の生殖細胞を特異的に標識できるか否かを解析した。その結果、GFP陽性の生殖細胞で優先的にシグナルが得られた4個のフローサイトメーター解析の結果を、図11に示す。
卵巣細胞において、vasa-GFP陽性の生殖細胞を優先的に標識することが示された、4種類の抗体のうち、抗体産生ハイブリドーマNo.172(NITE AP−01938:ブダペスト条約に基く国際寄託番号BP−01938)が産生する抗体を用いて、ヤマメおよびヒメマスの卵巣に対して、組織免疫染色を行った結果を図12に示す。写真に示されるように、生殖細胞のマーカーであるVasa陽性の細胞が、該抗体で蛍光標識されていることが観察された。
Claims (19)
- 魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することを含む分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、
予め、vasa-GFP遺伝子導入魚よりGFPを指標に単離した生きた未分化生殖細胞を抗原とし、該抗原を免疫原とする抗体産生ハイブリドーマを作製することによって、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原を特異的に認識する抗体を取得する工程1、
該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類の未分化精巣、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣、又は、卵巣由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程2、
該分離、濃縮した分離生殖細胞を孵化前後の宿主魚類の腹腔内へ移植する工程3を含み、
生殖細胞の宿主魚類生殖腺への生着能を向上させたことを特徴とする
分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。 - 前記工程2で分離、濃縮する前記宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞が、未分化精巣から分離された未分化精原細胞であるA型精原細胞、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣から分離されたA型精原細胞、或いは、卵巣から分離された卵原細胞であることを特徴とする請求項1に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1が、
予め、vasa-GFP遺伝子導入魚よりGFPを指標に単離した、単離直後の生きた未分化生殖細胞を抗原とし、該抗原を免疫原とする抗体産生ハイブリドーマを作製する工程(1)、
該ハイブリドーマが産生する抗体が未分化生殖細胞を認識する抗体であることを検出するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚から該GFPを指標に単離した未分化生殖細胞を用いて、該ハイブリドーマが産生する抗体の未分化生殖細胞への標識能を検出する工程(2)、
該未分化生殖細胞を認識する抗体が、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を認識するものであることを検出するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚の未分化精巣或いは卵巣を用いて、該未分化生殖細胞を認識する抗体の該宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞への標識能を検出する工程(3)
を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。 - 前記工程1で取得する該抗体が、未分化精巣におけるA型精原細胞、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣におけるA型精原細胞、或いは、卵巣における卵原細胞からなる未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1が、前記工程(3)の後に、分化生殖細胞を含む、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞であるA型精原細胞を特異的に認識する抗体を検出し、取得するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚の精巣生殖細胞を用いて、GFP強陽性の未分化精原細胞を特異的に標識する抗体を検出、取得する工程(4)を含むことを特徴とする請求項3又は4に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1が、前記工程(3)の後に、卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識する抗体を検出し、取得するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚の卵巣細胞中に含まれるわずかなGFP陽性の生殖細胞を特異的に標識する抗体を検出、取得する工程(4)を含むことを特徴とする請求項3又は4に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1の前記工程(1)が、単離直後の生きた精原細胞をマウスに免疫し、回収したリンパ節由来の細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製する工程を含むことを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1の前記工程(2)が、該標識能を化学発色法によって検出することを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1の前記工程(3)が、該標識能を、蛍光免疫染色により検出することを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1の前記工程(4)が、該抗体を、蛍光免疫染色及びフローサイトメーターにより検出、取得することを特徴とする請求項5に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程1の前記工程(4)が、該抗体を、蛍光免疫染色により検出、取得することを特徴とする請求項6に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記工程2が、該抗体を用いて、磁気細胞単離法により、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類の未分化精巣、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣、又は、卵巣由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮することを特徴とする請求項1に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記魚類由来の分離生殖細胞が、前記宿主魚類とは異系統又は異種の魚類由来の生殖細胞であることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 前記宿主魚類が、サケ科魚類、ニベ、及びサバ科から選択され、前記異種の魚類がマグロであることを特徴とする請求項13に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することを含む分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、
抗体産生ハイブリドーマNo.80(NITE AP−01936:BP−01936)又はハイブリドーマNo.95(NITE AP−01937:BP−01937)から、未分化精巣、或いは分化生殖細胞を含む、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞であるA型精原細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得する工程1、
該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類の未分化精巣、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣、又は、卵巣由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程2、
該分離、濃縮した分離生殖細胞を孵化前後の宿主魚類の腹腔内へ移植する工程3を含み、
生殖細胞の宿主魚類生殖腺への生着能を向上させたことを特徴とする
分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。 - 魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することを含む分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、
抗体産生ハイブリドーマNo.172(NITE AP−01938:BP−01938)又はハイブリドーマNo.189(NITE AP−01939:BP−01939)から、卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得する工程1、
該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類の未分化精巣、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣、又は、卵巣由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程2、
該分離、濃縮した分離生殖細胞を孵化前後の宿主魚類の腹腔内へ移植する工程3を含み、
生殖細胞の宿主魚類生殖腺への生着能を向上させたことを特徴とする
分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。 - 分化生殖細胞を含む、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞である未分化A型精原細胞を特異的に認識する抗体である、抗体産生ハイブリドーマNo.80(NITE AP−01936:BP−01936)又はハイブリドーマNo.95(NITE AP−01937:BP−01937)が産生するモノクローナル抗体。
- 卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識する抗体である、抗体産生ハイブリドーマNo.172(NITE AP−01938:BP−01938)又はハイブリドーマNo.189(NITE AP−01939:BP−01939)が産生するモノクローナル抗体。
- 魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することを含む分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法に用いる分離生殖細胞の分離・濃縮方法であって、
予め、vasa-GFP遺伝子導入魚よりGFPを指標に単離した生きた未分化生殖細胞を抗原とし、該抗原を免疫原とする抗体産生ハイブリドーマを作製することによって、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原を特異的に認識する抗体を取得する工程1、
該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類の未分化精巣、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣、又は、卵巣由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮する工程2を含むことを特徴とする、
生着能を向上させた分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法に用いる分離生殖細胞の分離、濃縮方法。
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